专利名称：一种从黄霉素预混剂中提取、纯化制备黄霉素a对照品的方法
技术领域：
本发明属于兽药对照品试剂制备领域，具体涉及一种黄霉素预混剂中提取、纯化黄霉素A对照品的方法。
背景技术：
黄霉素为磷酸化多糖类抗生素，具有抗菌作用机理，是通过干扰细菌细胞壁的结构物质肽聚糖的生物合成从而抑制细菌的繁殖，黄霉素的促生长原理可能在他能提高饲料中能量和蛋白质的消化，能使肠壁变薄，从而提高营养物质的吸收，能有效地持续肠道菌群的平衡和瘤胃PH值的稳定。细菌对黄霉素不易产生耐药性，黄霉素也不容易与其他抗生素产生交叉耐药性。黄霉素主要包括黄霉素A、Bl、Ba和C等，其中黄霉素A为主要有效成分，占50%以上。黄霉素只用作饲料添加剂，不作为治疗用药，具有抗生素类添加剂的防病和促生长等作用。黄霉素抗菌谱较窄，主要对革兰氏阳性菌有效，且对其他抗生素耐药性的革兰氏阳性菌也有效，但对革兰氏阴性菌作用很弱。对牛，猪、鸡、兔都有促生长、提高饲料转化率的作用。 美国FDA规定肉鸡每吨饲料添加I 2g，火鸡为每吨I 2g，猪为每吨2 4g。日本每吨鸡饲料添加O. 5 5g，腐乳猪为5 10g，仔猪为I 10g。现有黄霉素对照品为生物发酵法制备，黄霉素A纯度不高，约50% 70%左右，含有黄霉素BI、Ba和C等副产物，不适用于黄霉素A残留检测使用。本发明从黄霉素预混剂中提取纯化的黄霉素A对照品，纯度高达93% 99%，杂质少，步骤简便，成本低廉,主要应用于黄霉素残留检测领域。黄霉素A对照品的用途，即本发明的推广应用前景持续使用抗生素所引起的畜产品抗生素残留以及动物和人类出现耐药性问题已经越来越为人们所重视。20世纪80年代以来，越来越多的国家立法禁止滥用抗生素。畜禽饲料中慎用抗生素原则和限制抗生素促进生长剂，必定是未来养殖业发展的趋势。1997年联合国粮农组织(FAO)要求停止或禁止抗生素饲料添加剂。1998年12月又提议在10年内淘汰抗生素饲料添加剂。目前，联合国FAO，WTO组织及发达国家特别规定人用抗生素不得用于动物，对使用抗生素有极严格的要残限制，甚至完全不准使用。欧盟已经决定从2006年I月起，禁止在饲料中使用莫能霉素 (monensin),盐霉素(salinomycin),卑霉素(Avilamycin),黄霉素(Flavophospholipol) 等4种生长促进因子类抗生素，这意味着欧盟将会全面禁止在饲料中投放任何种类的抗生素。在日本肯定表制度中，黄霉素没有规定畜禽肌肉及内脏残留限量，按照“一律标准”原则，即没有规定残留限量的化合物一律按10μ g/kg限量来执行，黄霉素的残留限量为10 μ g/kg。动物源性食品中抗生素残留的检出，已成为世界肉类贸易中重要的技术指标和技术壁垒之一。由于黄霉素在我国养殖业广泛使用，欧盟、日本等国家对我国出口动物产品的药物残留限制提出了更严格的要求，必将对我国动物源性食品出口带来了严重影响。为了突破抗生素残留限制的技术壁垒，对畜禽产品中黄霉素残留进行检测和监控，制备高纯度
4的黄霉素A对照品显得非常必要。
发明内容
本发明的目的是提供一种从黄霉素预混剂中提取纯化黄霉素A对照品的方法，利用该方法制备的黄霉素A纯度达到93%以上。为了实现上述目的本发明采用如下技术方案一种从黄霉素预混剂中提取、纯化制备黄霉素A对照品的方法，包括如下步骤
(I)提取
以每mL甲醇与O. 4g黄霉素预混剂的比例混合二者并加入离心试管中，将离心试管置于超声提取器中，超声提取30min,每IOmin振荡一次，8000转/min下离心3min,将上清液转移至旋转蒸发瓶中；在残渣中加入甲醇按照上述步骤，重复提取2次；合并每次提取的上清液，40°C水浴旋转蒸发浓缩至干，得到提取物。(2) SPE 纯化
依次用4mL乙酸乙酯、4mL甲醇和4mL水活化C18固相萃取小柱，控制流速为I 2mL/ min ;将提取物用IOmL超纯水溶解，并全部加于固相萃取小柱上，并挤干柱床上的水分，依次用4mL5%甲醇溶液、4mL正己烷与二氯甲烷的混合溶液、4mL乙酸乙酯和6mL乙酸乙酯与甲醇的混合溶液淋洗除杂；最后用6mL甲醇将黄霉素从固相萃取小柱中解析，将解析液于 40°C水浴旋转蒸发浓缩至干，得到黄霉素纯化产物；将纯化产物转移至称量皿中，_75°C真空冷冻干燥5h，即得黄褐色黄霉素A粗产品。(3) HPLC 纯化
称取黄霉素A粗产品,用流动相溶解并稀释成2 10mg/mL,过O. 45mm滤膜,按下列条件分离纯化，收集洗脱液。分离纯化条件
色谱柱Agela Technologies Venusil MP C18, 250 mm X 4· 6 mm, 5 mm;
柱温30°C ;
流动相0. 2%甲酸铵乙腈，体积比为55:45 ；
流速1. OmL/min ；
进样量50 mL ；
检验波长258nm。(4)浓缩、干燥
将收集的洗脱液减压浓缩去除乙腈，得到浓缩液；控制流速I 2 mL/min，将浓缩液全部过C18固相萃取小柱；用IOmL超纯水淋洗C18固相萃取小柱；用IOmL甲醇解析C18固相萃取小柱，直至解析液中没有黄霉素A ;将收集解析液在40°C水浴下氮吹仪浓缩至干，转移至称量皿后真空冷冻干燥，即得淡黄色的黄霉素A对照品。(5)纯度鉴定
称取一定量的黄霉素A对照品，用水溶解，用紫外分光光度计测定258nm下的吸光度， 计算黄霉素A的纯度。本发明通过溶剂提取、固相萃取柱净化、高效液相色谱纯化、冷冻干燥的方式，代替了旧的生物发酵方法，使纯化效果提高，可靠、稳定。用本发明的方法制备的黄霉素A纯度可达到93% 99%。本发明生产的黄霉素A对照品纯度高，步骤简便，成本低廉，适用于黄霉素A残留检测领域。
具体实施例方式下面结合实施例，对本发明做进一步的描述。以下实施例用于说明本发明，但不限制本发明的范围。(I)提取
本实施例采用的是武汉同兴生物科技有限公司生产的黄霉素预混剂，产品含量8%，规格为25千克/袋。称取10 g黄霉素预混剂于50mL离心试管中，加入25mL甲醇,置于超声提取器中，超声提取30分钟，每10分钟振荡一次；8000转/min下离心3min，上清液转移至 250mL旋转蒸发瓶中，残渣中再加入25mL甲醇重复提取2次；合并提取液(即上清液)，40°C 水浴旋转蒸发浓缩至干。(2) SPE 纯化
C18固相萃取小柱(500mg, 3mL)依次用4mL乙酸乙酯、4mL甲醇和4mL水活化,控制流速为I 2mL/min，将提取物用IOmL超纯水溶解，并全部加于固相萃取柱上，并挤干柱床上的水分，依次用4mL 5%甲醇溶液、4mL正己烷二氯甲烷(体积比I: l)、4mL乙酸乙酯和6mL乙酸乙酯甲醇(体积比3:1)淋洗除杂，最后用3X2mL甲醇将黄霉素从固相萃取柱解析。将黄霉素解析液于40°C水浴旋转蒸发浓缩至干，得到黄霉素纯化产物。将纯化产物小心转移至称量皿中，-75°C真空冷冻干燥5h，即得黄褐色黄霉素A粗产品。其中所用试剂甲醇，乙酸乙酯，正己烷和二氯甲烷都选用色谱纯级别的试剂。(3) HPLC 纯化
称取适量黄霉素A粗产品，用流动相溶解并稀释成约含量2 10mg/mL，过O. 45mm滤膜。按下列条件分离纯化。为保证纯度，从黄霉素A色谱峰达到检测器20秒后开始收集洗脱液，完全通过检测器后10秒结束收集。液相色谱分离条件
a)色谱柱AgelaTechnologies Venusil MP C18, 250 mm X 4· 6 mm, 5 mm,或相当者；
b)柱温30°C ；
c)流动相0.2%甲酸铵(pH4. 9):乙腈(55 :45);乙腈试剂选用色谱纯级别的；
d)流速1.O mL/min ；
e)进样量50mL ；
f)检测波长258nm。(4)浓缩、干燥
将收集的洗脱液减压浓缩去除乙腈；控制流速在I 2 mL/min下，将浓缩液全部过C18 固相萃取柱；用IOmL超纯水淋洗C18柱；用IOmL甲醇解析黄霉素A，直至解析液中没有黄霉素A ;将收集解析液在40°C水浴下氮吹仪浓缩至干，小心转移至称量皿后真空冷冻干燥，即得淡黄色的黄霉素A对照品。(5)纯度鉴定
称取一定量的黄霉素A对照品，用水溶解并定容至10mL，用紫外分光光度计测定258nm下的吸光度，依据A258=21，357 Μ—1 cm—1计算溶液中黄霉素的物质的量浓度，按式(I)计算黄霉素A对照品的纯度。
Ax JW xFX =-二…；ζ—■ .................—.^ IQ V··································· (I)
X 21357 xL X1000
式中
X——黄霉素A的纯度，单位为％ ；
A——258 nm处的吸光度；
M——黄霉素A的物质的量1582，单位为克每摩尔(g/mol);
V-样液最终定容体积，单位为毫升(mL)；
m——试样质量，单位为克(g)；
L——比色皿的长度。本发明获得的黄霉素A对照品性状为淡黄色粉末，纯度93%以上。
权利要求
1.一种从黄霉素预混剂中提取、纯化制备黄霉素A对照品的方法，包括如下步骤(1)提取以每mL甲醇与O. 4g黄霉素预混剂的比例混合二者并加入离心试管中，将离心试管置于超声提取器中，超声提取30min,每IOmin振荡一次，8000转/min下离心3min,将上清液转移至旋转蒸发瓶中；在残渣中加入甲醇按照上述步骤，重复提取2次；合并每次提取的上清液，40°C水浴旋转蒸发浓缩至干，得到提取物；(2)SPE纯化依次用4mL乙酸乙酯、4mL甲醇和4mL水活化C18固相萃取小柱，控制流速为I 2mL/ min ;将提取物用IOmL超纯水溶解，并全部加于固相萃取小柱上，并挤干柱床上的水分，依次用4mL5%甲醇溶液、4mL正己烷与二氯甲烷的混合溶液、4mL乙酸乙酯和6mL乙酸乙酯与甲醇的混合溶液淋洗除杂；最后用6mL甲醇将黄霉素从固相萃取小柱中解析，将解析液于 40°C水浴旋转蒸发浓缩至干，得到黄霉素纯化产物；将纯化产物转移至称量皿中，_75°C真空冷冻干燥5h，即得黄褐色黄霉素A粗产品；(3)HPLC 纯化称取黄霉素A粗产品,用流动相溶解并稀释成2 10mg/mL,过O. 45mm滤膜,按下列条件分离纯化，收集洗脱液；分离纯化条件色谱柱Agela Technologies Venusil MP C18, 250 mm X 4· 6 mm, 5 mm;柱温30°C ;流动相0. 2%甲酸铵乙腈，体积比为55:45 ；流速1. OmL/min ；进样量50 mL ；检验波长258nm ；(4)浓缩、干燥将收集的洗脱液减压浓缩去除乙腈，得到浓缩液；控制流速I 2 mL/min，将浓缩液全部过C18固相萃取小柱；用IOmL超纯水淋洗C18固相萃取小柱；用IOmL甲醇解析C18固相萃取小柱，直至解析液中没有黄霉素A ;将收集解析液在40°C水浴下氮吹仪浓缩至干，转移至称量皿后真空冷冻干燥，即得淡黄色的黄霉素A对照品；(5)纯度鉴定称取一定量的黄霉素A对照品，用水溶解，用紫外分光光度计测定258nm下的吸光度， 计算黄霉素A的纯度。
2.根据权利要求I所述一种从黄霉素预混剂中提取、纯化制备黄霉素A对照品的方法， 其特征是步骤(2)中所述正己烷与二氯甲烷的混合溶液中二者的体积比为1:1 ;所述乙酸乙酯与甲醇的混合溶液中二者的体积比为3:1。
3.根据权利要求I所述一种从黄霉素预混剂中提取、纯化制备黄霉素A对照品的方法， 其特征是步骤(3)中收集洗脱液应在黄霉素A色谱峰达到检测器20秒后开始，完全通过检测器后10秒结束。
4.根据权利要求I所述一种从黄霉素预混剂中提取、纯化制备黄霉素A对照品的方法，其特征是步骤(5)中黄霉素A的纯度达到93% 99%。
全文摘要
本发明公开了一种从黄霉素预混剂中提取、纯化制备黄霉素A对照品的方法。该方法包括黄霉素的提取、浓缩、纯化、干燥和纯度鉴定方法。根据本发明制备的黄霉素A纯度达到93%以上。本发明提供的黄霉素A对照品制备方法具有步骤简便，成本低廉和纯度高的优点。
文档编号C07H1/06GK102603817SQ20121002945
公开日2012年7月25日 申请日期2012年2月10日 优先权日2012年2月10日
发明者唐柏彬, 张雷, 李应国, 李贤良, 王国民, 郗存显 申请人:重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心