专利名称：基于cho细胞表达系统的重组人神经生长因子纯化方法
技术领域：
本发明涉及生物医药提取技术领域，特别是一种从CHO细胞表达上清提取重组人神经生长因子的方法。
背景技术：
人神经生长因子(human Nerve Growth Factor, hNGF)是最早发现的神经系统中重要的营养因子，对中枢和周围神经细胞的生长、发育、分化及再生有重要作用，可影响外周和中枢神经系统某些神经元的存活和分化，对保护神经系统的正常功能有重要作用；并且hNGF对治疗脑损伤、老年性痴呆、脑帕金森氏综合症等与神经损伤和神经退行有关的疾病有重要临床价值(吕宪峰，刘志强，王东，等，一种适于规模化生产的眼镜蛇蛇毒神经生长因子的纯化方法，申请公布号CN101845093A)。然而hNGF在人体内含量极低，天然来源几乎不可能。因此，人们将目光转向动物替代品，而由于蛇毒提取神经生长因子可能存在有毒物质残留的风险，迄今临床使用的NGF仍为小鼠颌下腺提取的鼠源NGF。·虽然鼠源NGF与人源NGF在氨基酸序列上具有90%的同源性，但是鼠源性蛋白制品不论在化学结构上还是空间结构上都有别于人源性蛋白制品，动物源性的蛋白存在较高的免疫原性，容易引起人体内的抗原反应，长期使用存在一定风险(李佳楠，汤华东，基于昆虫杆状病毒表达系统的重组人神经生长因子的制备方法，申请公布号CN101906423A)。所以，使用基因工程技术表达人源的NGF代替小鼠颌下腺提取的NGF必将是未来NGF药物发展的趋势。然而诸多的已经报道的NGF表达系统如大肠杆菌、酵母以及昆虫细胞均存在蛋白活性低、系统无法进行连续性表达、对纯化工艺要求严格等缺点。相反，CHO细胞表达系统具有诸多优点，比如1)准确的转录后修饰功能，使得蛋白在分子结构、理化特性以及生物学功能上接近天然分子；2)表达产物分泌至胞外，便于纯化；3)通过筛选可获得高效表达细胞株；4)可进行悬浮高密度培养，产量高(王妍，王革，何凌冰，等，重组人神经生长因子的酵母表达系统以及制备重组人神经生长因子的方法，申请公布号CN1793375A)。因此，使用CHO细胞表达重组人神经生长因子必将成为NGF的行业趋势。然而，传统的纯化工艺大多步骤繁琐，层析填料相对落后，存在着收率低、耗时长、蛋白污染几率大等缺点。由于CHO细胞表达系统费用相对昂贵，如果使用传统的纯化工艺势必对蛋白的得率、活性以及时间损耗上存在巨大劣势，进而提高产品成本，这也是一直影响CHO细胞表达重组人神经生长因子的工业化生产的主要原因。因此，一种适用于CHO细胞表达系统的新的、周期短、成本低、高回收率的纯化工艺的开发势在必行。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种生产周期短、生产效率高、减少样品上柱前超滤处理以及使用一种耐高盐、高流速、高载量的触角型离子交换凝胶F「actogerEMD S03_ (M)和高分辨率的分子筛凝胶Superdex 75prepgrade从CHO细胞表达上清提取重组人神经生长因子的纯化方法。
基于CHO细胞表达系统的重组人神经生长因子纯化方法，操作方法如下I)将收获的高表达重组人神经生长因子的CHO细胞上清先后离心去除活细胞、细胞碎片，过滤去除杂质和细菌；2)将过膜后的细胞上清上样于pH6. 0—8.0, 20mmol/LPB缓冲液平衡好的Fractogels EMDSOf (M)层析柱，上样完毕后，用含 0. 2—0. 5mmol/L NaCl, pH6. 0—8. 0 的20mmol/L PB缓冲液冲洗未结合蛋白以及杂质蛋白，之后用含0. 5 — 0. 85mol/L NaCl,PH6. 0—8. 0的20mmol/LPB缓冲液洗脱，收集目的蛋白峰；3)将收集的目的蛋白峰，使用截留分子量为3K的超滤设备浓缩蛋白，4)浓缩后的蛋白上样于含0. 15mol/L NaCl,pH7. 0的20mmol/L PB缓冲液平衡好的Superdex 75层析柱，收集目的蛋白峰，即为重组人神经生长因子原液。所述步骤(I)中离心去除活细胞、细胞碎片的方法为先2000rpm离心去除细胞， 然后8000rpm离心去除细胞碎片。所述步骤(I)过滤去除杂质和细菌的方法为离心后上清过0. 22iim滤膜，除去杂质和细菌。所述步骤(2)中过膜后的细胞上清用磷酸氢二钠将pH调至7. O。所述步骤(2)中上样时流速2ml/min。
所述超滤设备包括切向流超滤系统、中空纤维柱和超滤离心管。所述步骤(4)中上样时流速lml/min。本发明选用的Fractogef EMD是合成的聚合物树脂，它的官能团通过共价键合结合到聚合物骨架的羟基上，形成一种“触手”样结构，相比起其他离子交换填料它具有如下特
占-
^ \\\ I)纯化收率高载量大，高流速，在高盐浓度条件下，有比传统介质更好的生物分子结合能力；2)产品安全与糖基质的介质相比,Fractogef EMD不会受微生物分解,使受内毒素
污染的风险大大降低；3)非常经济；4)化学稳定性好，介质寿命长。对比实验表明，Fractogel_ EMD SO3^ (M)填料在相同条件下具有比其他对比填料更高的NGF载量；Fractoger EMD S03_ (M)的选择，使得样品前处理只需要离心与过滤，省去了其他方法中超滤处理的步骤；且载量进一步提升。采用超滤浓缩样品，提高样品的浓度可以收取更多的最终产品，提高了得率，减小体积后用更少的层析介质即可完成分离，节约了成本。本发明选用了市面上分辨率最好的Superdex系列填料，使得产品最大程度上与杂质蛋白分开，从而大幅度提高纯度；另一方面，凝胶过滤层析方法的选择，使得层析过程的同时完成缓冲液的置换，更加方便之后产品的冻干处理。本发明方法与其他方法相比减少了操作步骤，大大缩短了生产周期，提高了处理量和得率，适合规模化生产。步骤I)中细胞上清的获得分两步进行，第一步2000rpm离心去除活细胞，再用SOOOrpm离心去除掉细胞增殖过程中产生的细胞碎片，这样分布处理避免了低速离心无法去除细胞碎片，而高速离心对活细胞造成伤害以致细胞内蛋白释放至上清中，为纯化减少了干扰。步骤3)中超滤系统的选择，是因为超滤过程在常温下进行，能耗低，不需加热，无热效应及相态变化，不需加入其它物质即可达到分离、浓缩、纯化即分级等目的，故特别适用于I)热敏性物质(生物制品、菌体、蛋白质)的浓缩分离；2)极稀溶液的浓缩回收；3)恒体积恒浓度下的脱盐纯化。 本发明提供了一种专门适用于CHO表达系统的神经生长因子纯化方法，与之前已公开的CHO细胞神经生长因子的纯化方法(L.E.伯顿，C.H.施梅尔策，J.T.贝克，神经营养蛋白的纯化，申请公布号CN1237184A)相比，本方法操作步骤更少，同时能缩短生产周期、提高产品回收率、减少蛋白污染几率；而与已报道的(姜静，于淑萍，姜桂香，等，两步柱色谱法纯化CHO表达的重组人P神经生长因子(rhNGF)，中国生物工程杂志2008，28(10):84—89)方法比，本方法避免使用了反相层析技术，减少了添加剂以及有机物质的引入，从而减少了有机物质去除步骤，更加适合大规模生产。综上所述，本发明提供了一种快速、高效的从CHO表达系统中纯化高活性的重组人神经生长因子方法，具有明显的技术创新性和工艺先进性，能工业化生产重组人神经生长因子。按照本发明的表达系统和方法可以制备得到大于98%，生物比活性高于5X IO5Au/mg的重组人神经生长因子。
图I为填料筛选时静态载量结果，其中M :Protein marker ；1 SP Sepharose Fast-flow ；2 CM Sepharose Fastflow ；3 =Fractogef EMD SE (M);4 Fractogel* EMD SO3- (M);5 :Nuvia S ；6 UNOsphere RapidS；7 MacroprepHigh S,图2为Fractogef EMD S03_ (M)层析图，I为UV280nm吸收曲线，2为洗脱梯度曲线，3为电导曲线，阴影部分为目的蛋白峰。其中，横坐标为洗脱体积(单位ml);左侧纵坐标为峰下面积(单位mAU);右侧纵坐标为电导率(单位mS/cm)。图3为Superdex 75prepgrade层析图，I为UV280nm吸收曲线，2为电导曲线，阴影部分为目的蛋白峰。其中，横坐标为洗脱体积(单位ml);左侧纵坐标为峰下面积(单位mAU);右侧纵坐标为电导率(单位mS/cm)。图4为本发明获得的重组人神经生长因子Tricine-SDS-PAGE电泳图，其中M Protein marker ；1 CH0 细胞表达上清；2 :纯化后的 rh P -NGF,图5为本发明获得的重组人神经生长因子的鸡胚法活性检测图，其中A为鼠源神经生长因子诱导前鸡胚背跟神经节，B为25ng/ml鼠源神经生长因子诱导生长3天的鸡胚背跟神经节，C为重组人神经生长因子诱导前鸡胚背跟神经节，D为25ng/ml重组人神经生长因子诱导生长3天的鸡胚背跟神经节。具体实施方法
技术领域：
本发明更详细的实施方法参见实施例，本实施例是用于解释、说明而不是以任何方式限制本发明。本发明所用的试验材料如无特别说明均为市售购买产品，各种试剂和培养基的成分和配制方法可参见常规实验手册中的操作。实施例一种基于CHO细胞表达系统的重组人神经生长因子的纯化方法，包括以下步骤I、细胞上清处理取摇床培养7—8天收获的高表达重组人神经生长因子的CHO细胞培养液，首先2000rpm离心IOmin,去除活细胞,然后将上清8000rpm离心20min,去除细胞碎片，离心后上清过0. 22 ii m滤膜，除去杂质和细菌，再用磷酸氢二钠将pH调至7. 0，备用。
2>Fractogel EMD SO3 (M)层析将过膜后的细胞上清上样于pH7. 0，20mmol/L PB缓冲液平衡好的Fractogef EMDSOf(M)层析柱，流速 2ml/min，上样完毕后，使用含 0. 45mol/L NaCl, pH7. 0 的 20mmol/L PB缓冲液冲洗未结合蛋白以及杂质蛋白，之后用含0. 7mol/L NaCl，pH7. 0的20mmol/LPB缓冲液洗脱，收集目的蛋白峰，见图2。3、超滤浓缩蛋白溶液将目的蛋白溶液倒入截留分子量为IOK的超滤离心管中，4000rpm离心至溶液体积缩小为4ml左右，备用。4> Superdex 75prepgrade 层析浓缩后的蛋白上样于含0. 15mol/L NaCl，pH7. 0的20mmol/LPB缓冲液平衡好的Superdex75层析柱(I. 6 X 60cm),流速lml/min, 80min附近蛋白峰即为目的蛋白峰，收集目的蛋白峰，即为重组人神经生长因子原液，见图3。5、Tricine-SDS-PAGE 电泳鉴定纯化 rh ^ -NGF 蛋白纯度取重组人神经生长因子原液，按体积比I : 4加入5X上样缓冲液，沸水浴煮lOmin，上样于10%浓度的Tricine-SDS-PAGE胶，每孔上样20 ill。电泳完毕，使用考马斯亮蓝对胶进行染色30min，之后使用脱色液将胶背景脱至无色。利用Imaging G6凝胶成像系统扫描Tricine-SDS-PAGE胶，结果见图4，再使用Gel-Pro软件对重组人神经生长因子条带进行纯度分析，结果表明条带纯度为99%。6、鸡胚背根神经节法鉴定rh P -NGF生物活性使用BCA法对纯化好的重组人神经生长因子原液进行蛋白定量，然后稀释至与生物活性参比品鼠源神经生长因子“苏肽生”(舒泰神药业，30ug/支，15000AU/支)相同的浓度，之后将样品与对照标准品均按照一定比例稀释5-8个梯度，加入到事先准备好的鸡胚背根神经节培养皿中，观察其刺激神经纤维生长发育状况。根据以下标准，对结果进行判定神经节不长为阴性，以表示；神经节突起生长但较稀疏，以“ + ”表示，明显生长以“++”表示；生长较好以“+++”表示；生长最好以“++++”表示，出现过量抑制以“+++*”表示。通常情况下，从出现阴性结果的稀释度开始往回数第3和第4两个稀释度中取生长较好的作为判定终点，以稀释度的倒数为样品的效价(效价=AU/ml)。根据此法计算，本方法纯化后重组人神经生长因子比活性为lX106AU/mg。鸡胚神经纤维生长情况如图5所示。
权利要求
1.基于CHO细胞表达系统的重组人神经生长因子纯化方法，操作方法如下 1)将收获的高表达重组人神经生长因子的CHO细胞上清先后离心去除活细胞、细胞碎片,过滤去除杂质和细菌； 2)将过膜后的细胞上清上样于pH6.0—8. 0,20mmol/LPB缓冲液平衡好的FractogefEMDSOf (M)层析柱，上样完毕后，用含 0. 2—0. 5mmol/L NaCl, pH6. 0—8. 0 的 20mmol/LPB缓冲液冲洗未结合蛋白以及杂质蛋白，之后用含0. 5—0. 85mol/L NaCl，pH6. 0 — 8. 0的20mmol/LPB缓冲液洗脱，收集目的蛋白峰； 3)将收集的目的蛋白峰，使用截留分子量为3K的超滤设备浓缩蛋白； 4)浓缩后的蛋白上样于含0.15mol/L NaCl, pH7. 0的20mmol/L PB缓冲液平衡好的Superdex 75层析柱，收集目的蛋白峰，即为重组人神经生长因子原液。
2.根据权利要求I所述的方法，所述步骤(I)中离心去除活细胞、细胞碎片的方法为先2000rpm离心去除细胞，然后8000rpm离心去除细胞碎片。
3.根据权利要求2所述的方法，所述步骤(I)过滤去除杂质和细菌的方法为离心后上清过0. 22 ii m滤膜，除去杂质和细菌。
4.根据权利要求3所述的方法，所述步骤(2)中过膜后的细胞上清用磷酸氢二钠将pH调至7. O。
5.根据权利要求I所述的方法，所述步骤(2)中上样时流速2ml/min。
6.根据权利要求I所述的方法，所述超滤设备包括切向流超滤系统、中空纤维柱和超滤离心管。
7.根据权利要求I所述的方法，所述步骤(4)中上样时流速lml/min。
全文摘要
本发明涉及“基于CHO细胞表达系统的重组人神经生长因子纯化方法”，包括如下步骤1)将上清先后离心去除活细胞、细胞碎片，过滤去除杂质和细菌；2)上清上样于EMD SO3-(M)层析柱，冲洗未结合蛋白以及杂质蛋白，洗脱，收集目的蛋白峰；用截留分子量为3K的超滤设备浓缩蛋白，4)上样于含Superdex 75层析柱，收集目的蛋白峰，即为重组人神经生长因子原液。本发明的表达系统和方法可以制备纯度大于98％，比活性高于5×105AU/mg的重组人神经生长因子。本发明与其他方法相比减少了操作步骤，大大缩短了生产周期，提高了处理量和得率，适合规模化生产。
文档编号C07K14/48GK102702341SQ20121020617
公开日2012年10月3日 申请日期2012年6月18日 优先权日2012年6月18日
发明者乐伟, 刘荷中, 史权威, 李曼, 霍立红 申请人:北京华安科创生物技术有限公司