专利名称：一种制备猪去氧胆酸的工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种制备猪去氧胆酸的工艺，具体利用盐析、甲酯化和重结晶原理从提取胆红素的下脚料(或猪胆汁)中制备医药猪去氧胆酸的新工艺方法，属于生物制药领域。
背景技术：
猪去氧胆酸(Hyodeoxycholic Acid, HDCA)是广泛存在于动物胆汁中的一种生化物质，含量为O. 19Γ0. 2%，分子式为C24H4tlO4,分子量为392. 58。其略溶于醇，微溶于丙酮，极微溶于乙醚、氯仿，几不溶于水。我国猪胆资源丰富，猪胆汁中主要含胆汁酸类、胆色素、粘蛋白、脂类及无机物等，胆汁酸则主要包含猪去氧胆酸、猪胆酸、鹅去氧胆酸、3α-羟基-6-氧代-5 α-胆烷酸以及胆石酸等。在其中猪去氧胆酸约占40%，鹅去氧胆酸约占25%。 国内许多企业都把从猪胆汁中提取胆红素后的物质作为废弃物，但是如果能利用提取胆红素后的母液分离提取猪去氧胆酸，既可以充分利用原料，提高猪胆汁的利用率，又可以增加经济效益。HDCA是从猪胆汁中提取的一种胆烷酸，其具有降低血中胆固醇和甘油三酯、镇痉、祛痰作用，为人工牛璜的重要成分；临床上用于治疗高血脂症、气管炎以及由肝胆疾病引起的消化不良。本品对金黄色葡萄球菌、白喉杆菌、百日咳菌等有抑制作用，其作为清开灵注射剂中的有效成分，经临床观察对急性白血病的治疗有良好作用，体外实验证明其具有诱导细胞凋亡、抑止细胞的增殖分裂作用。HDCA作为治疗冠心病药物的研究，通过药理试验，其有降压、降血液中胆固醇的作用，临床试用也有明显的作用。HDCA主要从猪胆汁中提取，其提取工艺分为皂化(猪胆汁酸经强碱水解)和精制，目前猪去氧胆酸的精制途径大致分两条一是脱色、脱水、浓缩、干燥；二是甲酯化、与苯加成、用苯分离得加成物、用碱水解、调pH、干燥，最终得到较纯的猪去氧胆酸。目前该产品其他提取纯化工艺所得的产品纯度低、使用溶剂毒性较大、回收率低、成本高等问题，这就要求有一种新方法出现来解决这些问题。
发明内容
本发明的目的是为了改进现有技术的不足，提供了一种制备猪去氧胆酸的工艺。为了实现上述目的，本发明的技术方案如下一种制备猪去氧胆酸的工艺，其具体步骤如下(I)盐析将提取胆红素的下脚料作为原料，加入反应釜中，再向反应釜中加水，用酸溶液调节pH至2. O 4. 0，温度控制在15 25°C之间，边搅拌边加入盐，连续搅拌，抽滤，得滤饼；(2)碱液水解将步骤(I)中的滤饼加入反应釜中，再加入碱液进行水解，水解时间为30 60min，以酸溶液酸化至刚果红变蓝，静置，抽滤，得到滤饼；(3)吸附脱色将步骤(2)中得到的滤饼加入反应釜中，再向反应釜中加入有机溶剂和活性炭，加热至65 80°C，冷凝回流30 60min ;冷却至20 30°C，抽滤，得滤液，向滤液中加入脱水剂，脱水15 24h ;抽滤，滤液旋蒸，浓缩至原体积的1/3 2/3，静置结晶，过滤收集晶体，真空干燥，得到猪去氧胆酸粗品；(4)甲酯化取猪去氧胆酸粗品溶于有机溶剂中，加入浓硫酸进行酯化，于15 25°C下搅拌36 48h，调节pH至6. 8 7. 2，继续搅拌I 2h ;进行抽滤，滤饼用有机溶剂洗涤2 3次，合并滤液及洗液，减压蒸去有机溶剂，得到棕色粘稠状物；并经过TLC监测；(5)柱层析湿法装柱；将步骤(4)中所得棕色粘稠状物加入硅胶柱中；用洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱液，经过TLC监测；再进行减压浓缩，得到淡黄色粘稠状固体；(6)水解将步骤(5)所得淡黄色粘稠状固体加入反应釜中，加入碱和水，用酸溶液调节PH至刚果红变蓝，抽滤，收集沉淀，水洗至流出液无色，得猪去氧胆酸；
(7)纯化将步骤(6)所得猪去氧胆酸加入有机溶剂中，在机械搅拌条件下加热至有机溶剂水溶液完全沸腾，待猪去氧胆酸溶解后，分次加入水，继续搅拌，待温度降至10 20°C，再机械搅拌30 60min，进行抽滤，得到猪去氧胆酸晶体；(8)真空干燥将步骤(7)中的晶体用恒温真空度干燥箱进行干燥，即得猪去氧胆酸纯品。优选在步骤(I)中所述的水的用量为3 6mL/g原料量；调节pH所用的酸溶液为HCl或H2SO4溶液；所用盐为NaCl或者Na2SO4,盐的用量为O. 3 O. 4g/mL水的用量；连续揽拌的时间为30 60min。优选步骤(2)中所述碱液为NaOH或KOH的水溶液，浓度为O. 35 O. 45g/mL，用量为2 3mL/g湿滤饼的量；酸化所用酸溶液为HCl或H2SO4溶液；静置时间为I 2h。优选步骤(3)中所述有机溶剂为乙酸乙酯或丙酮，有机溶剂的用量为3 5mL/g滤饼量；活性炭和滤饼的质量比为O. 06 O. 09 1 ;脱水剂为无水硫酸钠或无水硫酸镁，脱水剂的用量为O. 2 O. 3g/mL有机溶剂的量。优选步骤(3)和(8)中所述的真空干燥箱的温度均为60 80°C ;真空度均为-O. 075 -O. OlMPa ;干燥时间均为12 24小时。优选步骤(4)中溶解猪去氧胆酸粗品的有机溶剂和洗涤滤饼所用的有机溶剂均为甲醇或乙醇；溶解猪去氧胆酸粗品所用的有机溶剂量为5 8mL/g猪去氧胆酸粗品量；浓硫酸的浓度为96% 99%，用量为O. 05 O. 15mL/g猪去氧胆酸粗品量；用来调节pH的是无水NaHCO3 ；TLC监测过程中所用的展开剂为V [配酷:V石油醚:V甲酸=4. 8 5. 2 :4· 8 5. 2 :O. 8 I. 2，O. 9 I. 0%磷钥酸乙醇溶液显色。优选步骤(5)中所述的湿法装柱所用硅胶与猪去氧胆酸粗品的质量之比为30 40 1 ;用洗脱剂进行梯度洗脱为以乙酸乙酯和石油醚系统进行梯度洗脱，首先用将
酷(乙酸乙酯和石油醚的体积比)=17 19 21 23作为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，并用TLC进行监测，直至第一个点消失，将第一次收集到的洗脱液弃去；将洗脱剂换成V:V5_(乙酸乙酯和石油醚的体积比)=19 21 19 21，收集洗脱液，直至第二个点消失，停止收集。优选步骤(6)中所述的碱为NaOH或Κ0Η，其用量与淡黄色粘稠状固体的质量比为
O.08 O. 11 1 ;水的用量为4 6mL/g淡黄色粘稠状固体的量；调节pH所用的酸为HCl或H2SO4溶液。
优选步骤(7)中所述的有机溶剂为无水乙醇或乙酸，其用量为6 10mL/g猪去氧胆酸；水为蒸馏水或去离子水，共分3 4次加入，每次用量均为2 4mL/g猪去氧胆酸。有益效果根据本发明所得到的产品经过HPLC检测纯度达到99%，且易于操作，成本低，操作简单、安全，可用于工业化生产。乙酸乙酯、丙酮等有机溶剂可回收再利用。该发明所用原料在生产猪去氧胆酸后还可以进一步提取鹅去氧胆酸和猪胆酸。
具体实施例方式以下结合实例来进一步解释本发明，但实施案例并不对本发明做任何形式的限
定。 实施例I(I)盐析将50. Og提取胆红素的下脚料作为原料，加入反应釜中，加入225mL的水，制得溶液，用HCl溶液调节pH至3. O，温度控制在20°C左右，边搅拌边加入79g NaCl，当盐完全溶解后继续搅拌45min，抽滤，得滤饼；(2)碱液水解将步骤(I)中的滤饼取出，称量为35. 4g，加入反应釜中，再加入
O.4g/mL KOH溶液90mL，进行水解，水解45min，用HCl溶液酸化至刚果红变蓝，析出沉淀后静置I. 5h，抽滤，得滤饼；(3)吸附脱色将步骤(2)中的滤饼取出，称量为18. 6g，加入反应釜中，加入74mL乙酸乙酯和I. 5g医用活性炭，加热至77°C，冷凝回流45min，冷却至25°C，抽滤，滤液中加入18. 5g无水硫酸钠脱水20h，抽滤，滤液旋蒸，滤液浓缩至原体积的1/2，冷却，收集结晶，放入真空干燥箱干燥，温度设定70°C，真空度为一 O. 085MPa，干燥18小时，得到猪去氧胆酸粗品15. 6g；(4)甲酯化取10. Og猪去氧胆酸粗品，将其溶于60mL甲醇中，搅拌溶解后，加入lmL98%浓硫酸进行酯化，于20°C下搅拌40h，向体系中加入无水NaHCO3调节pH至7. O,继续搅拌I. 5h。进行抽滤，滤饼用甲醇洗涤3次，合并滤液及洗液，减压蒸去甲醇，得到棕色粘稠状物，通过TLC监测得到3个点，使用的展开剂为VWM V￥ig=5 5 :1，1.0%磷钥酸乙醇溶液显色；(5)柱层析取300g硅胶经湿法装入层析柱中。将步骤(4)中所得棕色粘稠状物加入层析柱中，以乙酸乙酯和石油醚体系进行梯度洗脱，首先将Vwm=18 :22作为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，进行TLC监测直至第一个点消失，弃去洗脱液。将洗脱剂换为V己酸己酷Vwm=20 :20，进行洗脱，收集洗脱液，进行TLC监测直至第二个点消失。所得洗脱液进行减压浓缩，得到淡黄色粘稠状固体；(6)水解将步骤(5)所得9. 6g淡黄色固体加入反应釜中，再加入O. 87g NaOH,48mL水，进行水解，用HCl溶液调节pH至刚果红变蓝，抽滤，收集沉淀，水洗至流出液无色；(7)纯化将步骤(6)所得猪去氧胆酸9. 4g，加入80mL无水乙醇中，在机械搅拌条件下加热，待猪去氧胆酸溶解后，分3次加入蒸馏水，每次加入25mL，将溶液在机械搅拌条件下降温至15°C，再机械搅拌45min，进行抽滤，得到猪去氧胆酸晶体；(8)真空干燥将步骤(7)中的晶体放入真空度干燥箱，温度设定70°C，真空度为一 O. 085MPa,干燥18小时，即得猪去氧胆酸9. 2g，本步收率为92%，总收率为27. 6%，经HPLC检测，纯度> 99%。实施例2(I)盐析将50. Og提取胆红素的下脚料作为原料，加入反应釜中，加入300mL的7jC,制得溶液，用H2SO4溶液调节pH至4. 0，温度控制在25 °C左右，边搅拌边加入120g NaCl，当盐完全溶解后继续搅拌60min，抽滤，得滤饼；(2)碱液水解将步骤(I)中的滤饼取出，称量为36. 2g，加入反应釜中，再加入
0.4g/mL NaOH溶液108mL，水解60min，用H2SO4溶液酸化至刚果红变蓝，析出沉淀后静置2h，抽滤，得滤饼；(3)吸附脱色将步骤(2)中的滤饼取出，称量为17. 7g，加入反应釜中，加入88mL丙酮和I. 5g医用活性炭，加热至80°C,冷凝回流60min,冷却至30°C,抽滤，滤液中加入26g无水硫酸镁脱水24h，抽滤，滤液旋蒸，滤液浓缩至原体积的2/3，冷却，收集结晶，放入真空干燥箱干燥，温度设定80°C，真空度为一 O. OlMPa，干燥24小时，得到猪去氧胆酸粗品14. 9g ；(4)甲酯化取10. Og猪去氧胆酸粗品，将其溶于SOmL乙醇中，搅拌溶解后，加入
1.5mL 98%浓硫酸进行酯化，于25°C下搅拌48h，向体系中加入无水NaHCO3调节pH至中
7.2，继续搅拌2h。经行抽滤，滤饼用乙醇洗涤3次，合并滤液及洗液，减压蒸去乙醇，得到棕色粘稠状物，通过TLC监测得到3个点，使用的展开剂为:V石油醚V￥ig=5. 2 5. 2 1.2,1.0%磷钥酸乙醇溶液显色；(5)柱层析取400g硅胶经湿法装入层析柱中。将步骤(4)中所得棕色粘稠状物加入层析柱中，以乙酸乙酯和石油醚体系进行梯度洗脱，首先将Visg^i Vwm=17 21作为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，进行TLC监测直至第一个点消失，弃去洗脱液。将洗脱剂换为V己酸己酷Vwm=19 :19，进行洗脱，收集洗脱液，进行TLC监测直至第二个点消失。所得洗脱液进行减压浓缩，得到淡黄色粘稠状固体；(6)水解将步骤(5)所得9. 7g淡黄色固体加入反应釜中，再加入lgK0H、58mL水，进行水解，用H2SO4溶液调节pH至刚果红变蓝，抽滤，收集沉淀，水洗至流出液无色；(7)纯化将步骤(6)所得猪去氧胆酸9. 4g，加入94mL乙酸中，在机械搅拌条件下加热，待猪去氧胆酸溶解后，分3次加入去离子水，每次加入37mL，将溶液在机械搅拌条件下降温至20°C，再机械搅拌60min，进行抽滤，得到猪去氧胆酸晶体；(8)真空干燥将步骤(7)中的晶体放入真空干燥箱干燥，温度设定80°C，真空度为一 O. OlMPa,干燥24小时，即得猪去氧胆酸9. 3g，本步收率为93%，总收率为27. 7%，经HPLC检测，纯度> 99. 2%。实施例3(I)盐析将100. Og提取胆红素的下脚料为原料，加入反应釜中，加入300mL的水，制得溶液，用HCl溶液调节pH至2. 0，温度控制在15°C左右，边搅拌边加入90g NaCl,当盐完全溶解后继续搅拌30min,抽滤,得滤饼；(2)碱液水解将步骤(I)中的滤饼取出，称量为72. 5g，加入反应釜中，再加入
O.35g/mL KOH溶液145mL，水解30min，用HCl溶液酸化至刚果红变蓝，析出沉淀后静置lh，抽滤，得滤饼；、(3)吸附脱色将步骤(2)中的滤饼取出，称量为37. 2g，加入反应釜中，加入112mL丙酮和2. 3g医用活性炭，加热至65°C，冷凝回流30min，冷却至20°C，抽滤，滤液中加入23g无水硫酸镁脱水15h，抽滤，滤液旋蒸，滤液浓缩至原体积的1/3，冷却，收集结晶，放入真空干燥箱干燥，温度设定60°C，真空度为一 O. 075MPa，干燥12小时，得到猪去氧胆酸粗品29. 8g ；(4)甲酯化取25. Og猪去氧胆酸粗品，将其溶于125mL乙醇中，搅拌溶解后，加入
I.25mL 98%浓硫酸进行酯化，于15°C下搅拌40h，向体系中加入无水NaHCO3调节pH至6. 8，继续搅拌lh。进行抽滤，滤饼用乙醇洗涤2次，合并滤液及洗液，减压蒸去乙醇，得到棕色粘稠状物，通过TLC监测得到3个点，使用的展开剂为:V石油醚V ψλ=4. 8 4. 8 :0. 8，
O.9%磷钥酸乙醇溶液显色；
(5)柱层析取750g硅胶经湿法装入层析柱中。将步骤(4)中所得棕色粘稠状物加入层析柱中，以乙酸乙酯和石油醚体系进行梯度洗脱，首先将Vwm=19 :23作为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，进行TLC监测直至第一个点消失，弃去洗脱液。将洗脱剂换为V己酸己酷Vwm=21 :21，进行洗脱，收集洗脱液，进行TLC监测直至第二个点消失。所得洗脱液进行减压浓缩，得到淡黄色粘稠状固体；(6)水解将步骤(5)所得23. 7g淡黄色固体加入反应釜中，再加入I. 89g Κ0Η、95mL水，进行水解，用HCl溶液调节pH至3. 0，抽滤，收集沉淀，水洗至流出液无色；(7)纯化将步骤(6)所得猪去氧胆酸23. 3g，加入140mL乙酸中，在机械搅拌条件下加热，待猪去氧胆酸溶解后，分4次加入蒸馏水，每次加入47mL，，将溶液在机械搅拌条件下降温至10°C，再机械搅拌30min，进行抽滤，得到猪去氧胆酸晶体；(8)真空干燥将步骤(7)中的晶体放入真空干燥箱干燥，温度设定60°C，真空度为一 O. 075MPa，干燥12小时，即得猪去氧胆酸22. 5，本步收率为90%，总收率为26. 82%，经HPLC检测，纯度> 99%。
权利要求
1.一种制备猪去氧胆酸的工艺，其具体步骤如下 (1)盐析将提取胆红素的下脚料作为原料，加入反应釜中，再向反应釜中加水，用酸溶液调节pH至2. O 4. O，温度控制在15 25°C之间，边搅拌边加入盐，连续搅拌，抽滤，得滤饼； (2)碱液水解将步骤(I)中的滤饼加入反应釜中，再加入碱液进行水解，水解时间为30 60min，以酸溶液酸化至刚果红变蓝，静置，抽滤，得到滤饼； (3)吸附脱色将步骤(2)中得到的滤饼加入反应釜中，再向反应釜中加入有机溶剂和活性炭，加热至65 8(TC,冷凝回流30 60min ;冷却至20 3(TC,抽滤，得滤液，向滤液中加入脱水剂，脱水15 24h ;抽滤，滤液旋蒸，浓缩至原体积的1/3 2/3，静置结晶，过滤收集晶体，真空干燥，得到猪去氧胆酸粗品； (4)甲酯化取猪去氧胆酸粗品溶于有机溶剂中，加入浓硫酸进行酯化，于15 25V下搅拌36 48h，调节pH至6. 8 7. 2，继续搅拌I 2h ;进行抽滤，滤饼用有机溶剂洗涤2 3次，合并滤液及洗液，减压蒸去有机溶剂，得到棕色粘稠状物；并经过TLC监测； (5)柱层析湿法装柱；将步骤(4)中所得棕色粘稠状物加入硅胶柱中；用洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱液，经过TLC监测；再进行减压浓缩，得到淡黄色粘稠状固体； (6)水解将步骤(5)所得淡黄色粘稠状固体加入反应釜中，加入碱和水，用酸溶液调节PH至刚果红变蓝，抽滤，收集沉淀，水洗至流出液无色，得猪去氧胆酸； (7)纯化将步骤(6)所得猪去氧胆酸加入有机溶剂中，在机械搅拌条件下加热至有机溶剂水溶液完全沸腾，待猪去氧胆酸溶解后，分次加入水，继续搅拌，待温度降至10 20°C，再机械搅拌30 60min，进行抽滤，得到猪去氧胆酸晶体； (8)真空干燥将步骤(7)中的晶体用恒温真空度干燥箱进行干燥，即得猪去氧胆酸纯品O
2.根据权利要求I所述的工艺，其特征在于步骤(I)中所述的水的用量为3 6mL/g原料量；调节PH所用的酸溶液为HCl或H2SO4溶液；所用盐为NaCl或者Na2SO4,盐的用量为O. 3 O. 4g/mL水的用量；连续搅拌的时间为30 60min。
3.根据权利要求I所述的工艺，其特征在于步骤(2)中所述碱液为NaOH或KOH的水溶液，浓度为O. 35 O. 45g/mL，用量为2 3mL/g湿滤饼的量；酸化所用酸溶液为HCl或H2SO4溶液；静置时间为I 2h。
4.根据权利要求I所述的工艺，其特征在于步骤(3)中所述有机溶剂为乙酸乙酯或丙酮，有机溶剂的用量为3 5mL/g滤饼量；活性炭和滤饼的质量比为O. 06 O. 09 :1 ;脱水剂为无水硫酸钠或无水硫酸镁，脱水剂的用量为O. 2 O. 3g/mL有机溶剂的量。
5.根据权利要求I所述的工艺，其特征在于步骤(3)和(8)中所述的真空干燥箱的温度均为60 80°C ;真空度均为-O. 075 -O. OlMPa ;干燥时间均为12 24小时。
6.根据权利要求I所述的工艺，其特征在于步骤(4)中溶解猪去氧胆酸粗品的有机溶剂和洗涤滤饼所用的有机溶剂均为甲醇或乙醇；溶解猪去氧胆酸粗品所用的有机溶剂量为5 8mL/g猪去氧胆酸粗品量；浓硫酸的浓度为96% 99%，用量为O. 05 O. 15mL/g猪去氧胆酸粗品量；用来调节PH的是无水NaHCO3 ；TLC监测过程中所用的展开剂为V =V5油醚V甲酸=4· 8 5. 2 :4· 8 5. 2 :0· 8 I. 2，O. 9 I. 0%磷钥酸乙醇溶液显色。
7.根据权利要求I所述的工艺，其特征在于步骤(5)中所述的湿法装柱所用硅胶与猪去氧胆酸粗品的质量之比为30 40 1 ;用洗脱剂进行梯度洗脱为以乙酸乙酯和石油醚系统进行梯度洗脱，首先用将Visg^i Vwm=17 19 21 23作为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，并用TLC进行监测，直至第一个点消失，将第一次收集到的洗脱液弃去；将洗脱剂换成Viigiii =Vwm = 19 21 :19 21，收集洗脱液，直至第二个点消失，停止收集。
8.根据权利要求I所述的工艺，其特征在于步骤(6)中所述的碱为NaOH或KOH，其用量与淡黄色粘稠状固体的质量比为O. 08 O. 11 :1 ;水的用量为4 6mL/g淡黄色粘稠状固体的量；调节PH所用的酸为HCl或H2SO4溶液。
9.根据权利要求I所述的工艺，其特征在于步骤(7)中所述的有机溶剂为无水乙醇或乙酸，其用量为6 10mL/g猪去氧胆酸；水为蒸馏水或去离子水，共分3 4次加入，每次用量均为2 4mL/g猪去氧胆酸。
全文摘要
本发明公开了一种制备猪去氧胆酸的工艺，属于生物制药领域。该提取纯化工艺包括下脚料盐析、碱液水解、溶解脱色、过滤脱水、浓缩结晶、真空干燥得粗品、甲酯化、柱层析分离、再次碱液水解、纯化、成品真空干燥等。本发明的优点是所得到的产品纯度高、无异味、环境友好、溶剂可回收再利用，且易于操作，成本低，操作简单、安全，可用于工业化生产。
文档编号C07J9/00GK102775459SQ20121026545
公开日2012年11月14日 申请日期2012年7月30日 优先权日2012年7月30日
发明者于辉, 冯旌, 曹峥, 李栋芸, 杨文革, 沈飞, 胡永红 申请人:南京工业大学, 南京新百药业有限公司