免疫球蛋白结合性新型多肽的制作方法

免疫球蛋白结合性新型多肽的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种新型多肽，其对免疫球蛋白显示结合性，且对碱稳定性优异。本发明涉及包含序列编号1或2中记载的氨基酸序列的蛋白质。
【专利说明】免疫球蛋白结合性新型多肽
[0001]技术区域
[0002]本发明涉及新型多肽，其对免疫球蛋白显示结合性，且化学稳定性优异。
【背景技术】
[0003]抗体具有与被称为抗原的物质进行特异性结合的机能，及具有与其他生物体分子、细胞进行协同作用，将具有抗原的因子进行无毒化?除去的机能。所谓抗体，其为重视与所述抗原进行结合的这种机能而命名的名称，作为物质被称为“免疫球蛋白”。
[0004]与抗体中的恒定区(抗原结合部位以外)进行特异性结合的物质(配体)可以用于抗体的精制、检测，通过与恒定区进行结合也会扩大其适应范围，因此具有充分的产业化价值。作为代表性的与抗体中的恒定区进行特异性结合的配体，可以举例蛋白A、蛋白G。
[0005]随着抗体药物、检查诊断等抗体关联产业的发展，对这些配体的化学稳定性的要求方面有所增加。特别是为了病毒等的失活，或者为了清洗固定化有配体的担体(珠、芯片(Beads, chip)等)而使用碱，因此对于对碱具有高稳定性的配体的需求非常多。由于多肽型配体一般对碱的稳定性弱，因此一直在积极研究既能产生极为优异的结合特异性，同时又提高对碱的耐性的技术(非专利文献1、2)。
[0006]作为提高与抗体进行结合的配体的碱耐性的技术，可以列举通过将蛋白A的29位的Gly进行变异而 赋予碱耐性的技术(专利文献1、2)，通过将Asn取代为其他的氨基酸而赋予碱耐性的技术(专利文献3、4)，利用蛋白A的C结构域或者其变异体的技术(专利文献5、6)。
[0007]现有技术文献
[0008]专利文献:
[0009]专利文献1:特开昭62-190087号公报
[0010]专利文献2:国际公开第2010/110288号手册
[0011]专利文献3:特表2002-527107号公报
[0012]专利文献4:特表2005-538693号公报
[0013]专利文献5:特开2006-304633号公报
[0014]专利文献6:特表2010-504754号公报
[0015]非专利文献:
[0016]非专利文献1:Linhult M?等著，"PROTEINS:Structure, Function, andBioinformatics〃2004 年，第 55 卷，407-416 页
[0017]非专利文献2:Palmer B.等著，"Journal of Biotechnology", 2008 年，第 134卷，222-230 页

【发明内容】

[0018]发明要解决的问题
[0019]本发明的目的是提供新型多肽，其对免疫球蛋白显示结合性，且对碱的稳定性优[0020]解决问题的方法
[0021]本发明人等为了解决上述问题进行了深入研究，通过运用计算化学的手法和蛋白质工程学的手法，发明了与目前为止的技术开发中所得到的多肽的序列不同、且显示了更优异的碱耐性的新型多肽，从而完成了本发明。
[0022]S卩，本发明涉及多肽，其含有以下氨基酸序列:
[0023]Rfx1X2EqqnafyE i lhx3pnlteeqrnx4f i Qx5Lx6X7X8PsvsreX9LaeaX10X1: Lndaqapx12
[0024](所述氨基酸序列中:
[0025]X1=D, E, N,或 Q
[0026]X2=E,或，R
[0027]X3=L, M,或 I
[0028]X4=A, E，F，R，Y，或 W
[0029]X5=D, E，H，I，L，Q，R，S，T，或 V
[0030]X6=H, I，或 R
[0031]X7=D, I,或 R
[0032]X8=D,或 E
[0033]X9=I, L,或 V
[0034]X10=R,或 Q
[0035]X11=H,或 R
[0036]X12=R, G,或 K)
[0037]且能与含有免疫球蛋白的Fe区域的蛋白质结合。
[0038]另外，本发明还涉及多肽，其含有以下氨基酸序列:
[0039]Z1Z2Z3Rfx1X2Eqqnafyeilhx3Pnlteeqrnx4Fiqx5Lx6X7X8Psvsrex9Laeax10X11LndaqaPX12
[0040](所述氨基酸序列中，
[0041]X1=D, E, N,或 Q
[0042]X2=E,或，R
[0043]X3=L, M,或 I
[0044]X4=A, E，F，R，Y，或 W
[0045]X5=D, E，H，I，L，Q，R，S，T，或 V
[0046]X6=H, I，或 R
[0047]X7=D, I，或 R
[0048]X8=D,或 E
[0049]X9=I, L,或 V
[0050]X10=R,或 Q
[0051]X11=H,或 R
[0052]X12=R, G,或 K
[0053]Z1 ?Z3=A, D, E, G, H, I, L, N，Q, R, S, T, V,或 Y)
[0054]且能与含有免疫球蛋白的Fe区域的蛋白质结合。
[0055]所述多肽优选为与以下氨基酸序列的序列同一性为90%以上:[0056]ADNRFNREQQNAFYEILHLPNLTEEQRNAFIQSLRDDPSVSREILAEARRLNDAQAPG (序列编号
1)、或
[0057]ADNRFNREQQNAFYEILHLPNLTEEQRNAFIQSLRDDPSVSREILAEARRLNDAQAPG (序列编号2)。
[0058]发明的效果
[0059]本发明的多肽具有特别是对碱稳定性优异的特征。即使在极为苛酷的碱性条件下，例如在0.1?1.0M氢氧化钠(NaOH)中，在室温下暴露数小时，也几乎不会失去其与免疫球蛋白的结合性。
[0060]虽然已知有许多保留有与免疫球蛋白的结合性，且碱耐性优异的蛋白A变异体，但是本发明提供碱耐性显示比上述蛋白A变异体显著提高的新型肽。
[0061]例如，在用于蛋白质的确认的SDS-PAGE中，在碱条件下长时间暴露了的蛋白质，在一般情况下受到强烈的切断、修饰，难以维持碱处理前的条带的状态(浓度、位置和条数)。但是，本发明中所得到的新型肽，即使在严酷的碱性条件下进行暴露后，也可以维持处理前的条带的状态，其可以承受的条件可以比公知的碱耐性蛋白A变异体更严酷。
[0062]附图的简单说明
[0063][图1]显示实施例3和比较例I的结果。其为碱处理(0、4、8和24小时)后，序列编号13?15的多肽的SDS-PAGE图。
[0064][图2]显示实施例5和比较例2的结果。其为碱处理(0、4和24小时)后，序列编号38?46的多肽的SDS-PA GE图。
[0065]发明的实施方式
[0066]在本说明书中，所谓“多肽”的用语，包含具有多肽结构的一切分子。由于本发明的多肽约由50个氨基酸组成，一般情况下，也可以被称为“蛋白质”或者“(蛋白质的)结构域(Domain)”，基本上不与“多肽”进行区别。
[0067]就“含有免疫球蛋白的Fe区域的蛋白质”而言，其为包含免疫球蛋白分子、免疫球蛋白片段、和免疫球蛋白衍生物的表述。所谓“免疫球蛋白G衍生物”，其为对下列改变型人工蛋白质的总称:例如，将人免疫球蛋白G的一部分结构域替换为其他生物种类的免疫球蛋白G的结构域并使其融合的嵌合型免疫球蛋白G、将人免疫球蛋白G的CDR(互不决定区，Complementarity Determining Regions)部分置换为其他生物种类抗体的⑶R部分并使其融合的人型化免疫球蛋白G、在Fe区域的糖链中加入了分子修饰的免疫球蛋白G、使人免疫球蛋白G的Fv区域与Fe区域进行了融合的人工免疫球蛋白G等。另外，在保持了 Fe区域的立体结构的基础上，可以进一步实施修饰(片段化等)。因此，本发明中的“含有免疫球蛋白的Fe区域的蛋白质”，并不限定于将一般情况下被称为Fe区域的区域没有不足地全部包含在内的免疫球蛋白分子、及其衍生物。
[0068]本发明的新型多肽具有如下特征:含有以下氨基酸序列，能与包含免疫球蛋白的Fe区域的蛋白质结合。
[0069]Rfx1X2EqqnafyE i lhx3pnlteeqrnx4f i Qx5Lx6X7X8PsvsreX9LaeaX10X1: Lndaqapx12
[0070]X1=D, E, N,或 Q
[0071]X2=E,或，R
[0072]X3=L, M,或 I[0073]X4=A, E，F，R，Y，或 W
[0074]X5=D, E，H，I，L，Q，R，S，T，或 V
[0075]X6=H, I，或 R
[0076]X7=D, I，或 R
[0077]X8=D,或 E
[0078]X9=I, L,或 V
[0079]X10=R,或 Q
[0080]X11=H,或 R
[0081]X12=R, G,或 K
[0082]优选具有以下特征的多肽:含有以下氨基酸序列，能与包含免疫球蛋白的Fe区域的蛋白质结合。
[0083]Z1Z2Z3Rfx1X2Eqqnafyeilhx3Pnlteeqrnx4Fiqx5Lx6X7X8Psvsrex9Laeax10X11LndaqaPX12
[0084]X1=D, Ε, N,或 Q
[0085]X2=E,或，R
[0086]X3=L, Μ,或 I
[0087]X4=A, Ε，F，R，Y，或 W
[0088]X5=D, Ε，H，I，L，Q，R，S，Τ，或 V
[0089]X6=H, I，或 R
[0090]X7=D, I，或 R
[0091]X8=D,或 E
[0092]X9=I, L,或 V
[0093]X10=R,或 Q
[0094]X11=H,或 R
[0095]X12=R, G,或 K
[0096]Z1 ?Z3=A, D, Ε, G, H, I, L, N, Q, R, S，Τ, V,或 Y
[0097]进一步优选具有以下特征的多肽:与以下氨基酸序列的序列同一性为90%以上，能与包含免疫球蛋白的Fe区域的蛋白质结合。
[0098]ADNRFNREQQNAFYEILHLPNLTEEQRNAFIQSLRDDPSVSREILAEARRLNDAQAPG (序列编号
1)、或
[0099]ADNRFNREQQNAF YEILHLPNLTEEQRNAFIQSLRDDPSVSREILAEARRLNDAQAPG (序列编号2)。
[0100]上述序列同一性更加优选为95%以上，特别优选98%以上。另外，即使为比本发明的多肽短的多肽，只要是含有本发明的多肽中的80%以上、优选90%以上的序列(范围)的情况，都包括在本发明内。
[0101]多肽可以为上述氨基酸序列2个以上连接而成。进行连接的个数下限为2个以上，优选3个以上，进一步优选4个以上，更加优选5个以上，上限为20个以下，优选10个以下，进一步优选8个以下，更加优选6个以下。这些多聚体可以为均二聚体、均三聚体等均聚合物，其为由同一氨基酸序列组成的免疫球蛋白结合性多肽(结构域)之间的连接体。另外，也可以为杂二聚体、杂三聚体等杂聚合物，其为序列不同的多个种类的免疫球蛋白结合性多肽之间的连接体。
[0102]作为多肽的连接方法，可以列举:不通过作为连接物(linker)的氨基酸残基进行连接的方法，或者，以作为连接物的I个或多个氨基酸残基进行连接的方法，但并不限于这些方法。作为连接物的氨基酸残基的数目并无特别限制，优选是不使多肽的3次元立体结构不稳定的数目。
[0103]另外，本发明的多肽中也包括:将免疫球蛋白结合性多肽、或者2个以上免疫球蛋白结合性多肽连接而成的多肽作为I个构成成分，与机能不同的其他蛋白质进行融合所得到的融合蛋白质。作为融合蛋白质的示例，可以列举融合了白蛋白、GST (谷胱甘肽-S-转移酶)的蛋白质，但并不限于此。另外，也可以融合DNA适体等核酸、抗生物质等药物、PEG(聚乙二醇)等闻分子。
[0104]本发明的多肽具有在碱性条件下化学稳定性优异的特征。所谓“碱性条件下”系指可以达到清洗或者杀菌目的的程度的碱性。更具体而言，相当于约0.05-1.0N的氢氧化钠水溶液等，但并不限于此。所谓“化学稳定性”系指，对于氨基酸残基的化学变化等化学修饰，及酰胺键的转移、切断等化学变性，多肽仍能保持其机能的性质。本发明中的所谓多肽的机能保持系指，保持与免疫球蛋白的Fe区域的结合活性(不受化学变性而保持亲和性的多肽的比例)。“化学稳定性”越高，在碱性溶液浸泡处理后，与免疫球蛋白的Fe区域的结合活性降低的程度也会越小。另外，本说明书中的用语“耐碱性”也与“碱性条件下的化学稳定性”意义相同。
[0105]对包含免疫球蛋白的Fe区域的蛋白质的亲和性，可以通过利用表面等离子体共振原理的Biacore系统(GE Healthcare Japan Coropration,通用电气医疗集团日本有限公司制)等生物传感器进行试验，但并不限于此。作为检测条件，只要可以检测到本发明的多肽与免疫球蛋白的Fe区域结合了时的结合信号即可，通过在温度20-40°C (—定温度)下，pH6-8的中性条件下进行测定，可以容易地对其进行评价。
[0106]作为结合参数，可以使用例如亲和常数(KA)、解离常数(Kd)(永田他著，《生体物质相互作用のリフルタィム解析実験法》，Springer-Verlag Tokyo, 1998年,第41页)。本发明的多肽的对免疫球蛋白的Fe区域的亲和常数可以通过如下实验体系来计算:利用Biacore系统，将人IgG固定于传感器芯片，在温度25°C、pH7.4的条件下，通过流路添加各结构域变异体。关于本发明相关的蛋白质，可以选用对人IgG的未和常数(Ka)为1 X 105 (M1)Wl,进一步优选1 *106 (M—1)以上，更加优选1*lO7 (M—1)的蛋白质。
[0107]但是，计算碱处理后的残留结合活性的时候，Ka或Kd不适合作为结合参数。这是因为，通过化学处理，1分子蛋白质的对免疫球蛋白的结合能不发生改变。作为计算碱处理后的蛋白质的残留结合活性的方法，优选例如使用将蛋白质固定于传感器芯片，在对蛋白质进行化学处理之前与之后，添加了同一浓度的免疫球蛋白时的结合信号的大小的方法，或者是使用理论上的最大结合容量(Rmax)的结合参数，但不限于此方法。例如，将免疫球蛋白固定化，添加化学处理前后的蛋白质的实验体系中也是可以的。
[0108]碱性条件下的化学稳定性，不仅可以通过对免疫球蛋白的结合活性来决定，也可以以多肽自身的作为物质的稳定性来作为指标来决定。例如，可以通过电泳法对碱处理前后的多肽的电泳条带进行比较，从而对碱性条件下的化学稳定性进行评价。具体而言，进行很常见的SDS-PAGE,通过光密度测定法(Densitometry)对条带强度进行解析,据此可以比较化学稳定性。如果以通过光密度测定法进行了分析的条带强度为基准，本发明的多肽在
0.5M氢氧化钠水溶液中、25°C下静置24小时后，与进行该处理之前比较,优选为50%以上，进一步优选60%以上，更加优选70%以上，特别优选80%以上。另外，如果以通过光密度测定法进行了分析的条带强度为基准，本发明的多肽在0.5M氢氧化钠水溶液中、25°C下静置30小时后，与进行该处理之前比较，优选为30%以上，进一步优选40%以上，更加优选50%以上。
[0109]本发明的蛋白质可以通过将编码蛋白质的氨基酸序列的DNA插入载体，培养包含该载体的转化体来进行生产。
[0110]对于所述DNA而言，只要是翻译其碱基序列所得到的氨基酸序列是构成该蛋白质的序列，可以为任意序列。所述DNA可以利用通常所使用的公知的方法，例如聚合酶链反应(以下，简称PCR)法来获得。另外，也可以用公知的化学合成法来进行合成，此外，也可以通过DNA文库来获得。就构成该DNA的碱基序列而言，密码子可以被简并密码子所替换，只要在进行翻译时编码同一蛋白质，则没有必要与本来的碱基序列相同。
[0111]用于改变DNA的碱基序列的位点特异性突变的导入，可以通过重组DNA技术，PCR法等进行。即，通过重组DNA技术导入突变，可以通过盒式诱变法进行:例如，在编码本发明的蛋白质的基因中，在希望导入突变的目标部位的两侧，存在适当的限制性内切酶识别序列的情况下，用所述限制性内切酶将所述限制性内切酶识别序列部分切断，除去包含希望导入突变的部位的区域，然后，通过化学合成等，仅在目标部位插入导入有突变的DNA片段。另外，通过PCR的位点特异性突变的导入，可以通过双引物法进行，例如，以编码蛋白质的双链质粒作为模板，使用含有与+链和一链互补的突变的2种合成寡核苷酸引物进行PCR。
[0112]还有，通过将编码本发明单体蛋白质(I个结构域)的DNA以预定数目进行串联连接，也可以制作编码多聚体蛋白质的DNA。例如，编码多聚体蛋白质的DNA的连接方法可以通过如下方法来进行:将合 适的限制性内切酶部位导入DNA序列，将通过限制性内切酶而片段化的双链DNA通过DNA连接酶来进行连接。限制性内切酶部位可以为I种、也可以导入多个不同种类的限制性内切酶部位。
[0113]此外，在编码多聚体蛋白质的DNA中，当编码各个单体蛋白质的碱基序列相同的情况下，由于在转化时有可能诱发宿主细胞内的DNA的同源重组，编码相连接着的单体蛋白质的DNA的碱基序列间的序列同一性优选90%以下，进一步优选85%以下。
[0114]所述载体包含编码所述蛋白质或编码其部分氨基酸序列的碱基序列，以及在可与碱基序列作动连接的宿主中可以发挥作用的启动子。通常，对上述蛋白质进行编码的基因可以通过与适当的载体连接或插入其中来获得。用于插入基因的载体只要能在宿主中进行自主复制即可，并没有特别限制，可以使用质粒DNA、噬菌体DNA作为载体。例如，使用大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)作为宿主的情况下,可以列举pQE系列载体(Qiagen公司生产)、PET系列载体(默克公司生产)、和pGEX系列载体(GE Healthcare,日本)的载体等。作为对短小芽孢杆菌属(Brevibacillus)细菌的基因表达有用的质粒载体,可以列举例如，作为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)载体所公知的pUBllO，或者pHY500 (特开平 2-31682 号公报)、pNY700 (特开平 4-278091 号公报)、pNU211R2L5 (特开平 7-170984 号公报)、PHT210 (特开平6-133782号公报)、另外还有作为大肠埃希氏杆菌与短小芽孢杆菌属细菌的穿梭载体的PNCM02 (特开2002-238569号公报)等。
[0115]本发明的蛋白质可以作为与具有辅助蛋白质表达的作用、或者具有容易地进行精制的作用的公知蛋白质的融合蛋白质来获得。作为该蛋白质的示例，可以列举麦芽糖结合蛋白质(MBP)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)等，但并不限于这些蛋白质。使用下述载体可以生产融合蛋白质，所述载体包含:编码本发明的蛋白质的氨基酸序列的DNA，与编码MBP或者GST等的DNA，二者是相连结的状态。
[0116]转化体可以通过将载体导入到成为宿主的细胞来获得。作为载体到宿主的导入方法，可以列举例如，使用钙离子的方法、电穿孔法、原生质球法、醋酸锂法、土壤杆菌感染法、粒子轰击、或聚乙二醇法等，但并不限于此。另外，作为使所得到的基因的机能在宿主中进行表达的方法可以列举:将本发明中所得到的基因组入基因组(染色体)的方法等。
[0117]关于成为宿主的细胞并无特别限制，便宜且大量进行生产方面，可以适当使用大肠埃希氏杆菌、枯草芽孢杆菌、以及短小芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、链霉菌属(Streptomyces)、棒状杆菌属(Corynebacterium)等细菌(真细菌)。
[0118]本发明的蛋白质也可以通过如下方法制造:将上述转化细胞在培养基中进行培养，在培养菌体中(也包括菌体周质空间中)或者培养液中(菌体外)使本发明的蛋白质生成并蓄积，再从该培养物中获得希望的蛋白质。
[0119]另外，本发明的蛋白质可以通过下述方法制造:将上述转化细胞在培养基中进行培养，在培养菌体中(也包括菌体周质空间中)或者培养液中(菌体外)，使含有本发明的蛋白质的融合蛋白质生成并蓄积，从该培养物中获得该融合蛋白质，通过合适的蛋白酶将该融合蛋白质切断，采集希望的蛋白质。
[0120]转化细胞的培 养按照宿主培养中所使用的通常方法来进行。只要可以高效高产量地生产该蛋白质，培养所使用的培养基并无特别限制。具体而言，可以使用葡萄糖、蔗糖、甘油、多聚蛋白胨、肉提取物、酵母提取物、酪蛋白氨基酸等碳源和氮源。其他根据需要添加钾盐、钠盐、磷酸盐、镁盐、锰盐、锌盐、铁盐等无机盐类。使用营养缺陷型宿主细胞的情况下可以添加生长所需的营养物质。另外，根据需要也可以添加青霉素、红霉素、氯霉素、新霉素等抗生物质。
[0121]另外，为了抑制通过菌体内外所存在的宿主由来的蛋白酶而产生的该目的蛋白质的分解、低分子化，可以添加适当浓度地公知的各种蛋白酶抑制剂，即苯基甲烷磺酸氟(Phenylmethane sulfonyl fluoride, (PMSF)),苯甲脉(Benzamidine)，4-(2-氨基乙基)-苯磺酰氟(AEBSF)，抗痛素(Antipain),抑糜酶素(Chymostatin),亮肽酶素(Leupeptin),胃酶抑素 A (Pepstatin A),憐酸阿米酮(Phosphoramidon),抑妝酶(Aprotinin),乙二胺四乙酸(EDTA)，和/或其他市售蛋白酶抑制剂。
[0122]此外，为了使本发明的蛋白质进行正确折叠(Folding),可以利用例如GroEL/ES,、Hsp70/DNAK、Hsp90、Hspl04/ClpB等分子伴侣(例如用共表达，或者融合蛋白质化等手段，使其与本发明的蛋白质共存)。需要说明的是，以本发明的蛋白质的正确折叠为目的的情况下，可以在培养基中添加有助于正确折叠的添加剂，和在低温下进行培养等手段，但并不限于此。
[0123]作为对以大肠埃希氏杆菌为宿主所得到的转化细胞进行培养的培养基，可以列举LB培养基(胰胨(triptone) 1%、酵母提取物0.5%,NaCl 1%)，或者2xYT培养基(胰胨1.6%、酵母提取物1.0%、NaCl0.5%)等。
[0124]作为对以短小芽孢杆菌属细菌为宿主所得到的转化体进行培养的培养基，可以列举TM培养基(蛋白胨1%、肉提取物0.5%、酵母提取物0.2%、葡萄糖1%、pH7.0)，或者2SL培养基(蛋白胨4%、酵母提取物0.5%、葡萄糖2%、pH7.2)等。
[0125]另外，培养温度为15?42°C，优选20?37°C，通过在通风搅拌条件、有氧下进行数小时?数日培养，使本发明的蛋白质在培养细胞内(包括周质空间内)或者培养溶液(细胞外)蓄积并进行回收。根据需要也可以切断通风在厌氧下进行培养。
[0126]当重组蛋白质是分泌生产的情况下，在培养结束后，通过离心分离、过滤等一般分离方法，通过将培养细胞与含有分泌生产的蛋白质的上清进行分离，可以对所生产的重组蛋白质进行回收。
[0127]另外，在培养细胞内(包含周质空间内)进行蓄积的情况下，也可以通过下列方法进行:例如，通过将培养液离心分离、过滤等的方法采集菌体，接着通过超声波破碎法、弗氏细胞压碎法(French press)等将该菌体破碎,和/或添加表面活性剂等使其可溶来回收细胞内畜积生广的蛋白质。
[0128]本发明的蛋白质的纯化可以通过单独或者适宜组合亲和色谱法、阳离子或阴离子交换色谱法、凝胶过滤色谱等来进行。
[0129]所得到的纯化物质为目标蛋白质的确认，可以通过通常的方法来进行，例如SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、N末端氨基酸序列分析、Western blotting等。
[0130]本发明的蛋白质也可以用使用了上述DNA的无细胞蛋白质合成系来制造。作为上述无细胞蛋白质合成系的示例，.举例原核细胞由来、植物细胞由来、高等动物细胞由来的合成系。
[0131]本发明的蛋白质可以作为具有对免疫球蛋白亲和性的特征的亲和配体(Affinityligand)来利用。将该配体在由水不溶性的基材形成的担体上进行固定化，可以得到亲和分离基质(Affinity separation matrix)。
[0132]此处，所谓“亲和配体”，系指抗原与抗体的结合所代表的、以特异的分子间的亲和力为基础、从某分子的集合中选择性地捕集(结合)目标分子的物质(官能团)的用语，在本发明中，指对免疫球蛋白进行特异性结合的蛋白质。在本说明书中，在仅用“配体”书写的情况下，也与“亲和配体”意思相同。
[0133]作为用于使亲和配体固定化、且由水不溶性的基材所形成的担体，列举玻璃珠、硅胶等无机担体；由交联聚乙烯醇、交联聚丙烯酸酯、交联聚丙烯酰胺、交联聚苯乙烯等合成高分子、或结晶纤维素、交联纤维素、交联琼脂糖、交联葡聚糖等多糖类类所形成的有机担体；进一步还有通过将上述物质进行组合所得到的有机-有机、有机-无机等复合担体等。作为市售品，可以例示多孔纤维素凝胶如GCL2000、将亚甲基双丙烯酰胺和烯丙基葡聚糖共有结合而交联的Sephacryl S-1000、甲基丙烯酸酯系列的担体如Toyopearl、琼脂糖系的交联担体如Sepharose CL4B、和纤维素系的交联担体如Cellufine等。但是,水不溶性担体并不仅限定于所例示的上述担体。
[0134]另外，从该亲和分离基质的使用目的和方法来看，水不溶性担体最好为表面积大的，优选为具有多个适当大小的细孔的多孔质。作为担体的形式，为任意可能的珠状、块状(Monolith)、纤维状、膜状(含中空纤维)等，可以选自任意形式。[0135]关于配体的固定化方法，例如可以利用配体中所存在的氨基、羧基或巯基，在传统的偶联法中与担体进行结合。作为偶联法，列举将担体与溴化氰、环氧氯丙烷、二环氧甘油醚、甲苯磺酰氯、tresyl chloride、肼和高碘酸钠等进行反应使担体活性化(或在担体表面导入反应性官能团)，再与作为配体而固定化的化合物进行偶联反应的固定化方法，还有在担体与作为配体而固定化的化合物所存在的体系中，加入如碳二亚胺类缩合试剂或者如戊二醛类的分子中具有多个官能团的试剂，通过缩合、交联的固定化方法。另外，可以在配体与担体间导入由多个原子形成的间隔分子，也可以将配体在担体上直接固定化。此时，为了固定化，可以对本发明的蛋白质进行化学修饰，也可以加入对固定化有用的氨基酸残基。作为对固定化有用的氨基酸，举例侧链上具有对固定化的化学反应有用的官能团的氨基酸，列举例如侧链上含有氨基的Lys、或侧链上含有巯基的Cys。只要将本发明蛋白质作为配体而固定化的基质成功实现本发明蛋白质的效果，用于固定化的修饰、改变方法并无特别限制。
[0136]作为具体的固定化方法，通过配体中所存在的Lys的ε氨基，优选在传统的偶联法中与担体进行共价结合的方法。由于本发明蛋白质有时不含有Lys，在该情况下，如上所述，优选在多肽中添加给予了对固定化有用的Lys的序列，并优选将给予了 Lys的序列在多肽的末端进行给予。就本发明中的“给予了 Lys的序列”而言，其为至少含有I个以上的Lys的序列，Lys的数优选为I?10个,进一步优选为I?5个,更加优选为I?3个。另外，存在多个Lys的情况下,每个Lys不需要连续(邻接)起来。此外,关于末端给予了 Lys的序列的氨基酸残基数，也无特别限制，即使为由I个Lys所形成的序列也可以。给予了 Lys的序列的氨基酸残基数优选为I?20个，进一步优选为I?10个，更加优选为I?5个。就“给予末端”而言，基本上，其意思是对氨基酸序列的N末端或者C末端的给予。因此，可以通过突变本发明的多肽的末端来给予Lys。
[0137]就“含有免疫球蛋白的Fe区域的蛋白质”而言，其为含有本发明蛋白质所结合的Fe区域侧的部位的蛋白质，不必为完全地含有Fe区域的蛋白质。
[0138]上述含有免疫球蛋白的Fe区域的蛋白质的纯化法，可以通过比照使用已经作为市售品而存在的柱子的亲和柱色谱纯化法的步骤来达成。即，将含有包含免疫球蛋白的Fe区域的蛋白质的缓冲液调整为中性，然后使该溶液通过填充了亲和分离基质的亲和色谱柱，吸附包含免疫球蛋白的Fe区域的蛋白质。然后，用适量纯粹的缓冲液通过亲和色谱柱，洗净柱子内部。在此时，所希望的含有免疫球蛋白的Fe区域的蛋白质被吸附于柱子内的本发明的亲和分离基质中。接着，用调整为适当PH的酸性缓冲液(有时含有促进从该基质中的分离的物质)对柱子进行通液，通过洗脱所希望的含有免疫球蛋白的Fe区域的蛋白质，来达到高纯度的纯化。通过用完全不损害配体化合物或担体的基材的机能程度的、适当的强酸性或强碱性的纯粹的缓冲液(适当的变性剂，或有时为含有有机溶剂的溶液)进行洗涤，亲和分离基质可以再利用。
实施例
[0139](实施例1)新型多肽的调制
[0140]将具有序列编号3和4中记载的核苷酸序列的寡核苷酸混合，使用BlendTaq(东洋纺织株式会社制)作为聚合酶，按照所附的操作规程(protocol)进行重叠(overlap)PCR反应。在琼脂糖凝胶电泳中提取?纯化PCR反应生成物的双链DNA，通过限制性内切酶BamHI与HindIII (都为Takara Bio株式会社制)进行切断。用同样的方法，由具有序列编号5和6中记载的核苷酸序列的寡核苷酸，通过PCR反应得到目标双链DNA，再通过限制性内切酶HindIII与EcoRI (Takara Bio株式会社制)进行切断。
[0141]在质粒载体pGEX_2T (GE Healthcare Japan Coropration 制)的多克隆位点(Multiple cloning site)中的BamHI/EcoRI位点上，使上述2种双链DNA进行亚克隆(Subcloning)。将进行了用限制性内切酶BamHI与EcoRI的切断反应和用碱性磷酸酶(Takara Bio株式会社制)的脱磷酸化反应的载体pGEX_2T，与经上述2种限制性内切酶处理过的双链DNA混合，使用Ligation High (东洋纺织株式会社制)，按照所附的操作规程进行连接反应(Ligation reaction)。需要说明的是,上述2种双链DNA在HindIII切断位点结合，在PGEX-2T中进行了亚克隆时，设计了序列编号3、4、5、6的DNA，以使得编码序列编号I。使用含有编码该序列编号I的DNA的pGEX-2T (连接反应液)，进行大肠埃希氏杆菌HBlOl细胞(Takara Bio株式会社制)的转化，按照规定方法，扩增.提取质粒DNA。
[0142]以该表达质粒作为模板，(I)使用序列编号7和8的寡核苷酸引物进行PCR，用限制性内切酶PstI与cfrl3I (Takara Bio株式会社制)处理PCR反应纯化产物，来调制插入用双链DNA。另外，使用相同模板，(2)使用序列编号9和10的寡核苷酸引物进行PCR，用限制性内切酶cfrl3I与EcoRI处理PCR反应纯化产物，来调制插入用双链DNA。将上述2种插入用双链DNA，与(3)经限制性内切酶(Pstl/EcoRI)处理和脱磷酸化处理了的短小芽孢杆菌(Brevibacillus)用表达载体pNK3260’(国际公开第2006/004067号册子)进行混合，通过连接反应，构建了持有编码多肽的DNA的表达质粒，所述多肽具有连接有序列编号I的氨基酸序列的氨基酸序列。
[0143]另外，与上述同时进行，关于寡核苷酸引物，(I)中使用序列编号7和11、(2)中使用序列编号9和12，关于限制性内切酶，(I)中使用PstI与X hoi (Takara Bio株式会社制)，(2)中使用X hoi与EcoRI，从而构建了持有编码多肽的DNA的表达质粒，所述多肽具有连接有序列编号2的氨基酸序.列的氨基酸序列。需要说明的是，从基因操作的情况出发，C末端(第2次重复的最后)的氨基酸残基被取代为Lys，但是因为是C末端，不论有无取代，评价结果不变。
[0144]使用这些表达质粒，进行桥石短小芽孢杆菌(Brevibacillus.choshinensis)FY-1株的转化。转化是根据公知的方法使用电导入法实施(《Biosc1.Biotech.Biochem.》、1997年、61号、202-203页)。需要说明的是桥石短小芽孢杆菌FY-1株为桥石短小芽孢杆菌HPD31-0K株(特开平6-296485号公报)中进行突变处理所得到的Phe.Tyr缺陷型株(Phe-and Tyr-requiring strain)。
[0145]将桥石短小芽孢杆菌FY-1重组菌，在含有60 μ g/mL的新霉素的5mL的3YC培养基(聚胨3%、酵母提取物0.2%、葡萄糖3%、硫酸镁0.01%、硫酸铁0.001%、氯化锰0.001%、氯化锌0.0001%)中，30°C下振荡培养3天。
[0146]通过离心处理培养物来分离菌体，从所得到的培养上清中，利用SP FastFlow柱(GE Healthcare Japan Coropration制)通过阳离子交换色谱法来纯化目标多肽。具体为，对培养上清添加醋酸钠使其最终浓度成为50mM，进一步加入盐酸调整到pH4.0，将其加入到使用阳离子交换缓冲液A (50mMCH3C00H-CH3C00Na, pH4.0)所平衡化的SP Fast Flow柱中，用阳离子交换缓冲液A洗净后，通过利用阳离子交换缓冲液A与阳离子交换缓冲液B(50mM CH3COOH-CH3COONa, IM NaCl, pH4.0)的梯度盐浓度，分取出中途所洗脱的目标多肽。接着，用利用 DEAE Fast Flow 柱(GE Healthcare Japan Coropration 制)的阴离子交换色谱法，来纯化目标多肽。具体为，所分取的目标蛋白质溶液用超纯水进行透析，再将其加入到使用阴离子交换缓冲液A (50mM Tris-HCl,pH8.0)所平衡化的DEAE Fast Flow柱中，用阴离子交换缓冲液A洗净后，通过利用阴离子交换缓冲液A与阴离子交换缓冲液B (50mMTris-HCl,0.3M NaCl，pH8.0)的梯度盐浓度，分取出中途所洗脱出的目标多肽。所分取的目标多肽溶液再用超纯水进行透析，将只含有目标多肽的水溶液作为最终纯化样品。需要说明的是，以上的通过使用柱子的色谱法所做的蛋白质纯化，都是利用AKTAprime plus系统(GE Healthcare Japan Coropration 制)实施的。
[0147]将经以上步骤所调制的、在以后的实施例中所使用的、2种多肽的氨基酸序列，作为序列编号13 (序列编号I的2连接型)、序列编号14 (序列编号2的2连接型)表示。
[0148](实施例2)各种多肽与人IgG的亲和性解析
[0149]使用利用表面等离子体共振的生物传感器Biacore3000 (GE Healthcare JapanCoropration制),解析了实施例1中取得的各种多肽与免疫球蛋白的亲和性。
[0150]将从人血衆中分尚的人免疫球蛋白G制剂(以后记作人IgG)在传感器芯片上固定化，将各种蛋白质流于芯片上，检测两者的相互作用。人IgG对传感器芯片CM5的固定化通过使用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、和N-乙基-N’ - (3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)的胺偶联法进行，封闭时使用乙醇胺(传感器芯片和固定化用试剂都是GEHealthcare JapanCoropration 制)。作为人 IgG 溶液使用 Gamma guard (Baxter 公司制)，用标准缓冲液(20mM NaH2PO4-Na2HPO4,150mM NaCl、pH7.4)溶解使其成为1.0mg/mL进行调制。该人IgG溶液用固定化用 缓冲液(IOmMCH3COOH-CH3COONa、pH4.5)稀释100倍。按照Biacore3000所附的操作规程，将人IgG固定于传感器芯片上。另外，对于芯片上其他流通池，通过在用EDC/NHS活性化后进行将乙醇胺进行固定化处理，也准备了作为阴性对照的参考细胞。
[0151]使用电泳缓冲液(20mMNaH2PO4-Na2HPO4、150mM NaCl,0.005%Ρ_20、ρΗ7.4)，在10?IOOOnM的范围下适宜调制(各个不同蛋白质浓度的溶液分别调制3种)实施例1中记载的方法所制造的各种多肽，将各个多肽溶液以流速20 μ L/min30秒添加到传感器芯片上。在测定温度25°C下，按顺序观测添加时(结合相、90秒间)和添加结束后(解离相、90秒间)的结合反应曲线。各个观测结束后，添加40mM NaOH (15秒)使传感器芯片再生。该操作的目的是去除传感器芯片上残留的添加蛋白质，确认固定化了的人IgG的结合活性几乎完全恢复。对于所得到的结合反应曲线(减去参考细胞的结合反应曲线的结合反应曲线)，使用系统附属软件BIA evaluation中1:1的结合模型通过拟合分析,算出对人IgG的亲和常数(KA=kon/koff)。
[0152]对序列编号I的多肽抗体的亲和常数(Ka)是，序列编号13的多肽为2.1XlO8(M—1)，序列编号14的多肽为2.6X IO8 (M—1)。这可以说是对人免疫球蛋白具有充分的亲和性的测定结果。
[0153](实施例3)通过SDS-PAGE解析的新型多肽的对碱的稳定性评价
[0154]对于实施例1中所取得的各种多肽，在碱性条件下进行一定时间的温育处理后，通过比较SDS-PAGE上的条带状态来进行评价。
[0155]碱处理按照下面的方法进行。对于200 μ M的各种多肽，加入NaOH使最终浓度成为0.5M，25°C下温育4、8、和24小时，通过对多肽溶液添加0.5M HCl (预先确认了 pH恢复至中性的一定容量)来中和，作为SDS-PAGE用样品。碱处理前(处理后O小时)的SDS-PAGE用样品，通过添加碱处理时加入的NaOH溶液和中和处理时加入的HCl溶液预先混合了的溶液来调制，从而使多肽浓度、溶液的组成相同。在电源搭载型min1-slab电泳槽pageRun中使用 15% 聚丙烯酰胺预制凝胶(Polyacrylamide precast gel) “e.PAGEL”(都为 ATTO 株式会社制)，按照附属的手册(定法)进行SDS-PAGE。利用染色.脱色处理后的电泳凝胶用图像读取装置ChemiDoc XRS (Bio-Rad Laboratories株式会社制)使其电子图像化,条带解析(Densitometry)用附属的 Quantity One Soft (Bio-Rad Laboratories 株式会社制)，按照手册进行。图1表示SDS-PAGE的电子图像。
[0156]关于碱处理24小时后的条带强度比(将碱处理前作为100%时的残存率)，公知的高耐碱性多肽(比较例1、序列编号15、2连接型)为55.0%，与此相比，序列编号13的多肽为60.9%、序列编号14的多肽为91.6%ο
[0157]可知本发明中所得到的多肽即使在严酷的碱条件下也显示优良的稳定性。特别地，序列编号14 (序列编号2为基础)的多肽即使在0.5M Na0H、25°C下温育4小时，条带强度也几乎不变化(99.8%)，因此，可以说是各种局面下实用性极高的多肽。
[0158](实施例4)新型多肽的调制
[0159]将含有实施例1中所取得的编码序列编号I的DNA的pGEX_2T作为模板DNA，使用2种引物,实施Quick change法,取得了包含新突变的表达质粒。使用DNA聚合酶PfuTurbo和甲基化DNA (模板DNA)切割酶DpnI (都为Stratagene公司制)，按照Stratagene公司的操作规程实施Quick change法。用“序列编号16与17，或序列编号18与19、或序列编号20与21、或序列编 号22与23、序列编号24与25、序列编号26与27、序列编号28与29”这7个不同的引物组合，调制了导入新的突变的表达质粒。进一步地，将使用序列编号16与17的引物所调制的表达质粒作为模板DNA，用序列编号18与19的引物，也调制了再次导入突变的表达质粒。因此，重新调制了 8种表达质粒。
[0160]将上述表达质粒作为模板，使用实施例1中所记载的步骤(I)?(3)的方法，对于以下所示各个氨基酸序列(序列编号30?37)，取得了含有编码4种多肽的DNA的表达质粒，所述4种多肽具有成为相同序列重复的氨基酸序列。
[0161]ADNRFNREQQNAFYEILHLPNLTEEQRNAFIQSLRDDPSVSREILAEAQRLNDAQAPR (序列编号 30)
[0162]ADNRFNREQQNAFYEILHLPNLTEEQRNAFIQSLIDDPSVSREILAEAQRLNDAQAPR (序列编号 31)
[0163]ADNRFNREQQNAFYEILHLPNLTEEQRNAFIQSLIDDPSVSREILAEARRLNDAQAPR (序列编号 32)
[0164]ADNRFNREQQNAFYEILHLPNLTEEQRNAFIQSLHDDPSVSREILAEARRLNDAQAPR (序列编号 33)
[0165]ADNRFNREQQNAFYEILHLPNLTEEQRNAFIQELRDDPSVSREILAEARRLNDAQAPR (序列编号 34)
[0166]ADNRFNREQQNAFYEILHLPNLTEEQRNAFIQLLRDDPSVSREILAEARRLNDAQAPR (序列编号 35)
[0167]ADNRFNREQQNAFYEILHLPNLTEEQRNAFIQTLRDDPSVSREILAEARRLNDAQAPR (序列编号 36)
[0168]ADNRFNREQQNAFYEILHLPNLTEEQRNAFIQSLRIDPSVSREILAEARRLNDAQAPR (序列编号 37)
[0169]各个多肽的氨基酸序列如序列编号38?45所示。需要说明的是，与实施例1同样，C末端(第2次重复的最后)的氨基酸残基被取代为Lys，但是因为是C末端，不论有无取代，评价结果不变。
[0170]使用上述表达质粒，用与实施例1同样的方法使多肽表达、纯化。
[0171](实施例5)通过SDS-PAGE解析的新型多肽的对碱的稳定性评价
[0172]关于实施例4中所取得的各种多肽，用与实施例3同样的手法，在碱性条件下进行一定时间的温育处理后，通过比较SDS-PAGE上的条带状态来进行评价。关于序列编号38?41的多肽，评价了温育4小时和24小时后的稳定性。关于序列编号42?45的多肽，评价了温育30小时后的稳定性。需要说明的是，作为参照，对于序列编号14的多肽也进行了同样的操作。
[0173]图2表示SDS-PAGE的电子图像。关于从开始碱处理到24小时后的条带强度比，序列编号38的多肽为73.4%、序列编号39的多肽为79.0%、序列编号40的多肽为85.6%、序列编号41的多肽为82.8%。同样地，关于从开始碱处理到30小时后的条带强度比，公知的耐碱性多肽(比较例2、序列编号46、2连接型)为23.1%，与此相比，序列编号14的多肽为45.1%、序列编号42的多肽为45.8%、序列编号43的多肽为43.8%、序列编号44的多肽为49.6%、序列编号45的多肽为65.0%。因此，可知上述多肽即使在严酷的碱条件下也显示优良的稳定性。
[0174](比较例I)C-G29A.2d的调制和评价
[0175]C-G29A.2d为蛋白A的C结构域导入了突变G29A的等机能变异体，其为公知(专利文献5)的耐碱性非常高的的多肽。将编码该等机能变异体串联连接而成的多肽(序列编号15)的DNA，在PCR中扩增，以使得能够在Pstl/EcoRI位点切断，然后在载体pNK3260’上进行亚克隆。与实施例1同样的方法进行表达.纯化，与实施例3同样的方法进行耐碱性评价。
[0176](比较例2)C-G29A/S33 E.2d的调制和评价
[0177]在C-G29A中导入了突变S33E的多肽，为显示与C-G29A同等的耐碱性的公知的多肽(国际公开第2011/118699号公报)。对于该序列串联连接而成的多肽(序列编号46)，用与实施例1同样的方法进行表达.纯化，与实施例3同样的方法进行耐碱性评价。
【权利要求】
1.一种多肽，其含有以下氨基酸序列，且能与含有免疫球蛋白的Fe区域的蛋白质结合:
Rfx1X2Eqqnafyeilhx3Pnlteeqrnx4Fiqx5Lx6X7X8Psvsrex9Laeax10X11LndaqaPX12
(在所述氨基酸序列中:
X1=D, E，N 或 Q
X2=E 或 R
X3=L, M 或 I
X4=A, E，F，R，Y 或 W
X5=D, E, H，I, L, Q，R，S，T 或 V
X6=H, I 或 R
X7=D,I 或 R
X8=D 或 E
X9=I, L 或 V
X10=R 或 Q
X11=H 或 R
X12=R, G 或 K)。
2.一种多肽，其含有以下氨基酸序列，且能与含有免疫球蛋白的Fe区域的蛋白质结合:
Z1Z2Z3Rfx1X2Eqqnafyeilhx3Pnlteeqrnx4Fiqx5Lx6X7X8Psvsrex9Laeax10X11LndaqaPX12
(在所述氨基酸序列中，
X1=D, E，N 或 Q
X2=E 或 R
X3=L, M 或 I
X4=A, E，F，R，Y 或 W
X5=D, E, H，I, L, Q，R，S，T 或 V
X6=H, I 或 R
X7=D,I 或 R
X8=D 或 E
X9=I, L 或 V
X10=R 或 Q
X11=H 或 R
X12=R, G 或 K
Z1 ?Z3=A, D, E, G, H，I, L, N，Q, R, S，T, V 或 Y)。
3.根据权利要求1或2中记载的多肽，其与以下氨基酸序列的序列同一性为90%以上: ADNRFNREQQNAFYEILHLPNLTEEQRNAFIQSLRDDPSVSREILAEARRLNDAQAPG (序列号 I)、或 ADNRFNREQQNAFYEILHLPNLTEEQRNAFIQSLRDDPSVSREILAEARRLNDAQAPR (序列号 2 )。
【文档编号】C07K14/00GK103443120SQ201280015181
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2012年3月26日 优先权日:2011年3月25日
【发明者】吉田慎一, 村田大, 平良俊一 申请人:株式会社钟化