血栓形成试剂减少的免疫球蛋白及其制备方法

血栓形成试剂减少的免疫球蛋白及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及血栓形成试剂减少的免疫球蛋白组合物及其制备方法。一种方法包括在高于3.8至等于或低于5.3范围内的pH下对含免疫球蛋白溶液实施负相阳离子交换剂色谱法。还可在7—8.2范围内的pH下对该溶液实施负相阴离子交换剂色谱法。
【专利说明】血栓形成试剂减少的免疫球蛋白及其制备
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及包含低水平血栓形成试剂的免疫球蛋白制剂。
【背景技术】
[0002]静脉内免疫球蛋白(IVIG)制剂越来越多地用于治疗多种免疫缺陷和自身免疫病症，包括皮肌炎、特发性血小板减少性紫癜、川崎病和格-巴二氏综合征。少数血栓栓塞不利事件已与 IVIG制剂使用相关联(Brannagan等人Complications of intravenous immuneglobulin treatment in neurologic disease。(在神经病学疾病中的静脉内免疫球蛋白治疗并发症)Neurology (《神经病学》)1996 年；47:674-677 ；Rosenbaum JT.Myocardialinfarction as a complication of immunoglobulin therapy。(作为免疫球蛋白治疗并发症的心肌梗塞)Arthritis Rheum(《关节炎与风湿病》)1997年；40:1732—1733 ;和Dalakas MC.High—dose intravenous immunoglobulin and serum viscosity:risk ofprecipitating thromboembolic events。(高剂量静脉内免疫球蛋白和血清粘度:促成血栓栓塞事件的危险)Neurology (《神经病学》)1994年；44:223— 226)。
[0003]包括深静脉血栓和心肌梗塞的这些事件已主要在接受高剂量IVIG的患者中观察至丨J，并且它们已归于血液粘度中的增加(Dalakas MC.1994年JPReinhart WH, BerchtoldPE.Effect of high—dose intravenous immunoglobulin therapy on blood rheology。(高剂量静脉内免疫球蛋白治疗对血液流变特性的作用)Lancet (《柳叶刀》)1992年；339:662-664)。
[0004]血液凝固的接触系统的组分先前已在人免疫球蛋白制剂中得到鉴定(Alving等人 Contact-activated fact ors:contaminants of immunoglobulin preparations withcoagulant and vasoactive properties。(接触活化因子:具有凝结剂和血管活性性质的免疫球蛋白制剂的污染物)J Lab Clin Med(《实验室与临床医学杂志》)1980年；96:334-346)。免疫血清球蛋白的商业制剂显示含有广泛多样水平的前激肽释放酶激活剂(PKA)和激肽释放酶活性。由于其产生可增加血管渗透性的生物活性肽的潜力，这些活性是有利的。这些蛋白质的血管活性片段的存在被认为与免疫球蛋白制剂施用过程中的偶发不良反应有关。这些作者还在免疫球蛋白制剂中发现因子XI (FXI) (Alving等人1980年)。
[0005]在Alving等人(1980年)中，就PKA和激肽释放酶分析二十五批商业免疫血清球蛋白(ISG)，所述PKA和激肽释放酶是接触活化系统的组分，可通过受体中的激肽生成来介导此类反应。激肽释放酶活性范围为正常血浆中无法检测的水平到>60%的总潜在激肽释放酶活性。PKA范围为已引起低血压的参考血浆蛋白质级分中的5%到3950%活性。除五批外的全部均在豚鼠中增加血管渗透性。未引起增加的五批在PKA和激肽释放酶活性中也是最低的。当对免疫球蛋白制剂实施凝胶色谱法以分离酶污染物与免疫球蛋白G时，仅含有PKA和/或激肽释放酶的级分增加血管渗透性。若干批IVIG使正常血浆的非活化的部分促凝血酶原时间从236秒缩短到38至55秒。在凝胶色谱法过程中，凝结剂活性在对应于分子量150，000的位置中被洗脱；这通过针对人因子XI的抗体得到抑制。这些数据指示因子Xla负责观察到的促凝剂活性，并且PKA和/或激肽释放酶是关于IVIG制剂的血管活性反应的潜在介质。
[0006]免疫球蛋白也已发现污染因子XI制剂。因子XI和免疫球蛋白通过相继的离子交换柱共纯化，并且需要添加特异性伴刀豆球蛋白A亲和色谱柱，以去除来自因子XI的痕量IgG 污染(Bonno BN, Griffin JH.Human blood coagulation factor XI !purification,properties,and mechanism of activation by activated factor XII。(人凝血因子XI:纯化、性质和通过活化因子XII的活化机制)J Biol Chem(《生物化学杂志》)1977年；252:6432-6437)。
[0007]Wolberg 等人(Coagulation Factor XI Is a Contaminant in IntravenousImmunoglobulin Preparations。(凝血因子XI是静脉内免疫球蛋白制剂中的污染物)AmJ Hem(《美国血液学杂志》)2000年；65:30-34)证实鉴定为活化因子XI的促凝剂存在于IgG制剂中。在这项研究中，就促凝剂活性测定来自八个不同制造商的二十九个静脉内免疫球蛋白(IVIG)样品。这些样品中的二十六个缩短因子XI缺乏血浆的凝血时间。在这些中，十四个样品具有大于0.0OlU / ml正常合并血浆的因子XI活性。剩余样品具有小于0.0OlU / ml的正常血浆活性。这些样品中的促凝剂活性可通过抗因子XI多克隆抗体得到抑制，暗示促凝剂活性是因子XI。两个样品中的促凝剂活性在4°c储存4周后增加，可能是因子XIa自体活化的结果。另外，一些IVIG样品中的活性能够直接活化因子IX，指示活化的因子XI存在于这些样品中。
[0008]在近3百年过程中，已经开发出用于纯化静脉内免疫球蛋白的众多方法，以满足增长中的关于IVIG的需求。绝大多数制造过程包括用于捕获专用树脂通常为离子交换树脂上的免疫球蛋白的多种技术(Jerry Siegel.The Product:A11 IntravenousImmunoglobulins Are Not Equivalent。(产品:并非所有静脉内免疫球蛋白均为等同的)The Journal of Human Pharmacology and Drug Therapy.(《人体药理学与药物疗法杂志》)第25卷，第11期部分2，2005年11月)。捕获树脂上的免疫球蛋白是非常昂贵和耗时的，因为它需要大量树脂。平均地，每升离子交换树脂捕获约30-50g免疫球蛋白。因此，当使用具有约IOOL树脂容量的常规大型柱时，可捕获3 — 5Kg免疫球蛋白。通过小型柱捕获免疫球蛋白溶液中存在的试剂具有经济利益。
[0009]美国专利5252217公开通过对冷沉淀的血浆上清液施加过滤-吸附步骤和在阳离子交换树脂上的单个色谱法步骤制备的人因子XI浓缩物。所获得的浓缩物非常适合于在因子XI缺乏症的情况下的替代疗法中的治疗用途。阳离子交换树脂用PH5.5-6.5且优选PH6的缓冲溶液进行平衡。
[0010]美国专利4272521公开使用pH > 7.2的离子交换材料，用于从免疫血清球蛋白(ISG)溶液中去除前激肽释放酶激活剂(PKA)和关于PKA的激肽释放酶可激活前体(因子XII)的方法。
[0011]美国专利5164487公开制备静脉内可耐受的免疫球蛋白G制剂的方法，所述制剂不含聚集体、血管活性物质和蛋白分解酶。原材料用按体积计0.4至1.5%的辛酸处理，并且随后尤其在离子或阳离子交换剂或疏水基质上进行色谱处理。
[0012]美国专利申请2010 / 0311952公开用于纯化免疫球蛋白的方法，其中所述方法包括在下述条件下对阳离子交换材料施加包含以单体和聚集形式的免疫球蛋白的含水缓冲溶液，所述条件使得单体形式的免疫球蛋白不与阳离子交换材料结合，并且在与阳离子交换材料接触后，从溶液中回收以单体形式的免疫球蛋白。
[0013]PCT申请W02010 / 072381公开用于纯化免疫球蛋白的方法，其中所述方法包括在下述条件下对阴 离子交换色谱材料施加包含以单体、聚集和断裂形式的免疫球蛋白的含水缓冲溶液，所述条件使得单体形式的免疫球蛋白不与阴离子交换材料结合，并且在来自阴离子交换色谱材料的流通物中回收以单体形式的免疫球蛋白，从而缓冲水溶液具有
8.0-8.5的pH值。在一个实施例中，阴离子交换色谱材料是膜阴离子交换色谱材料。
[0014]Jose等人(2010年)公开在免疫球蛋白静脉内生产过程中的巴氏灭菌使一些血栓形成试剂例如凝血酶失活。然而，这种方法不使凝血酶选择性失活，并且因此可改变免疫球蛋白溶液的活性。
[0015]因此，存在用于从免疫球蛋白溶液中选择性去除血栓形成试剂而不影响免疫球蛋白的方法的需要。

【发明内容】

[0016]本发明涉及用于从免疫球蛋白制剂中特异性去除PKA、激肽释放酶和/或FXI (a)的方法。在一个实施例中，免疫球蛋白制剂衍生自血液或血液级分。
[0017]在一个方面，本发明提供用于从含免疫球蛋白溶液中去除血栓形成试剂的方法，该方法包括以下步骤:提供在高于3.8至等于或低于5.3范围内的pH下的含免疫球蛋白溶液；提供包含固定带负电基团的载体；使该溶液与该载体接触；以及收集未结合级分I。
[0018]在本发明的一个实施例中，溶液具有在高于3.8至等于或低于5.0范围内的pH。
[0019]在本发明的另一个实施例中，溶液具有在等于或高于4.0至等于或低于5.0范围内的pH。
[0020]在本发明的另外一个实施例中，溶液具有在高于3.8至等于或低于4.7范围内的pH。
[0021]再在本发明的另一个实施例中，溶液具有约4.0,4.1,4.2,4.3,4.4,4.5,4.6或4.7 的 pH。
[0022]再在本发明的另外一个实施例中，溶液具有在高于3.8至等于或低于4.3范围内的pH。
[0023]在本发明的另一个实施例中，溶液具有在等于或高于4.0至等于或低于4.3范围内的pH。
[0024]在本发明的另外一个实施例中，溶液具有在等于或高于4.1至等于或低于4.3范围内的pH。
[0025]在本发明的一个实施例中，还使未结合级分I与包含固定带负电基团的载体在相同PH下接触；以及收集未结合级分II。
[0026]在本发明的另一个实施例中，载体为色谱材料或色谱膜的形式。
[0027]在本发明的另一个实施例中，载体材料或膜是亲水的，并且选自琼脂糖、琼脂糖凝胶、丙烯酸珠、纤维素、可控孔度玻璃、硅胶和葡聚糖类；疏水的，并且选自树脂；或选自基于聚丙烯酰胺或聚苯乙烯的材料或膜的有机合成聚合物。
[0028]在本发明的一个实施例中，带负电基团经由存在于载体和带负电基团之间的连接基固定至载体。[0029]在本发明的一个实施例中，连接基选自蛋白质、氣基酸和妝。
[0030]在本发明的一个实施例中，载体是化学修饰的。
[0031 ] 在本发明的一个实施例中，载体是弱或强阳离子交换剂。
[0032]在本发明的一个实施例中，固定带负电基团选自磺酸及其它含硫的酸、甲酸及其它羧酸、磷酸及其它含磷的酸、硝酸及其它含氮的酸的衍生物以及它们的组合。
[0033]在本发明的一个实施例中，固定带负电基团是含硫的酸例如磺丙基。
[0034]在本发明的一个实施例中，固定带负电基团是羧酸例如羧甲基。
[0035]在本发明的一个实施例中，该方法还包括以下步骤:将未结合级分I或未结合级分II调整至在7 — 8.2范围内的pH ;使未结合级分I或未结合级分II与包含固定带正电基团的载体在7 — 8.2范围内的pH下接触；以及收集未结合级分。
[0036]在本发明的一个实施例中，该方法还包括以下步骤:在与包含固定带负电基团的载体接触前，调整溶液且使其与包含固定带正电基团的载体在7—8.2范围内的pH下接触；以及收集未结合级分。
[0037]在本发明的一个实施例中，固定带正电基团选自铵、烷基铵、二烷基铵、三烷基铵、季铵、烷基、H+、Na+、K+、Ca2+、Mg2+、氨基官能团以及它们的组合。
[0038]在本发明的一个实施例中，固定带正电基团是季铵。季铵可以是二乙氨基乙基(DEAE)。
[0039]再在本发明的另一个实施例中，该方法包括使溶液与包含固定带正电基团的载体在7—8.2范围内的pH下接触；收集未结合级分；将未结合级分的pH调整至在高于3.8至等于或低于5.3范围内的pH ;使未结合级分与包含固定带负电基团的载体在高于3.8至等于或低于5.3范围内的pH下接触；以及收集未结合级分I。
[0040]再在本发明的另外一个实施例中，调整未结合级分和使未结合级分与包含固定带负电基团的载体接触在高于3.8至等于或低于5.0范围内的pH下执行。
[0041]在本发明的一个实施例中，调整未结合级分和使未结合级分与包含固定带负电基团的载体接触在等于或高于4.0至等于或低于5.0范围内的pH下执行。
[0042]在本发明的一个实施例中，调整未结合级分和使未结合级分与包含固定带负电基团的载体接触在高于3.8至等于或低于4.7范围内的pH下执行。
[0043]在本发明的一个实施例中，调整未结合级分和使未结合级分与包含固定带负电基团的载体接触在约4.0,4.1,4.2,4.3,4.4,4.5,4.6或4.7的pH下执行。
[0044]在本发明的一个实施例中，调整未结合级分和使未结合级分与包含固定带负电基团的载体接触在高于3.8至等于或低于4.3范围内的pH下执行。
[0045]在本发明的一个实施例中，调整未结合级分和使未结合级分与包含固定带负电基团的载体接触在等于或高于4.0至等于或低于4.3范围内的pH下执行。
[0046]在本发明的一个实施例中，调整未结合级分和使未结合级分与包含固定带负电基团的载体接触在等于或高于4.1至等于或低于4.3范围内的pH下执行。
[0047]在本发明的另一个实施例中，使溶液与包含带正电基团的载体接触在处于I一2ml /分钟/ cm2范围内的线速度下执行，并且含免疫球蛋白溶液具有在8 — 37°C范围内的温度。[0048]在本发明的一个实施例中，该方法还包括以下步骤:在与包含固定带负电基团的载体接触前，使溶液与包含三维交联疏水性丙烯酸类聚合物的色谱材料接触；以及收集未结合级分III。
[0049]在本发明的一个实施例中，该方法还包括以下步骤:使未结合级分、未结合级分I或未结合级分II与包含三维交联疏水性丙烯酸类聚合物的色谱材料接触；以及收集未结合级分III。
[0050]在本发明的一个实施例中，包含固定带正电基团的载体是弱或强阴离子交换剂。
[0051]本发明的另一方面涉及用于制备免疫球蛋白组合物的方法，其包括以下步骤:使含免疫球蛋白溶液经历至少两个负相色谱法步骤:在7—8.2范围内的pH下的阴离子交换剂色谱法；随后为在高于3.8至等于或低于5.3范围内的pH下的阳离子交换剂色谱法。
[0052]在本发明的一个实施例中，阳离子交换剂色谱法执行两次。在一个实施例中，两个阳离子交换剂色谱串联执行。
[0053]在本发明的一个实施例中，阳离子交换剂色谱法在高于3.8至等于或低于5.0范围内的PH下执行。
[0054]在本发明的另一个实施例中，阳离子交换剂色谱法在等于或高于4.0至等于或低于5.0范围内的pH下执行。
[0055]在本发明的另外一个实施例中，阳离子交换剂色谱法在高于3.8至等于或低于4.7范围内的pH下执行。
[0056]再在本发明的另一个实施例中，阳离子交换剂色谱法在约4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6或4.7的？!1下执行。`
[0057]再在本发明的另外一个实施例中，阳离子交换剂色谱法在高于3.8至等于或低于4.3范围内的pH下执行。
[0058]再在本发明的另一个实施例中，阳离子交换剂色谱法在等于或高于4.0至等于或低于4.3范围内的pH下执行。
[0059]再在本发明的另外一个实施例中，阳离子交换剂色谱法在等于或高于4.1至等于或低于4.3范围内的pH下执行。
[0060]在本发明的一个实施例中，该方法还包括使用包含三维交联疏水性丙烯酸类聚合物的色谱材料的负相色谱法。
[0061]在本发明的一个实施例中，阳离子交换剂为膜的形式。
[0062]在本发明的一个实施例中，阳离子交换剂包含磺酸基官能团。
[0063]在另一方面，本发明涉及衍生自血液或血液级分的免疫球蛋白组合物，其包含4% -10%的蛋白质且可根据本发明的方法获得。
[0064]本发明还提供含有根据本发明的免疫球蛋白组合物的容器。
[0065]在另一方面，本发明提供用于治疗患有免疫缺陷、炎性疾病、自身免疫疾病或急性感染的受试者的方法，其包括向该受试者施用有效量的根据本发明的免疫球蛋白组合物。
[0066]本发明实施例的【具体实施方式】
[0067]本发明涉及用于从免疫球蛋白制剂中去除血栓形成试剂的方法。在本发明的一个实施例中，免疫球蛋白制剂衍生自血液或血液级分。在另一个实施例中，血液或血液级分来自超过一个供体或来自多个供体。[0068]根据本发明发现通过对免疫球蛋白溶液实施以低于6的pH水平的阳离子交换剂色谱法，FXI和/或其活性形式FXIa可从含免疫球蛋白溶液中有效去除。最佳结果在高于
3.8至等于或低于5.3范围内的pH下获得。发现该pH范围有效去除FXIa且同时基本上保存免疫球蛋白(IgG)水平。
[0069]这些发现是令人惊讶的，鉴于免疫球蛋白(具有6-8的等电点，美国专利6592905和4296027)在低于6的pH水平下具有净正电荷，并且像这样预期同样与阳离子交换剂结合，从而导致在溶液中剩余低免疫球蛋白水平(美国专利6592905)。
[0070]不受机制束缚，看起来在低于6的pH下，FXIa和免疫球蛋白竞争阳离子交换剂上的带负电基团，并且FXIa的结合是更有利的。
[0071]另外，根据本发明惊讶地发现通过对免疫球蛋白溶液实施在4.0-4.3范围内的pH下的阳离子交换剂，可实现产品能够从含免疫球蛋白溶液更高效率的去除FXIa。由于FXIa在广泛的pH范围内和最高至约pH9 (它的等电点是8.9-9.1 ；Haematologic TechnologiesInc.研究试剂目录)具有净正电荷的事实，这些发现也是令人惊讶的。令人惊讶的是，这些结果用弱阳离子交换剂或强阳离子交换剂获得。
[0072]根据本发明还发现通过对该溶液实施在4.1-4.3的pH水平下的阳离子交换剂色谱法，可从含免疫球蛋白溶液中有效去除激肽释放酶(具有8.6-9.5的等电点)，同时基本上保存IgG水平。这些发现是令人惊讶的，考虑到免疫球蛋白在该pH范围下具有净正电荷，并且因此已预期同样与阳离子交换剂结合，导致在溶液中剩余低免疫球蛋白水平。
[0073]结果显示通过在极窄的pH范围下对该溶液实施阳离子交换剂，从含IgG溶液中最大去除血栓形成试剂，同时维持溶液中未改变水平的免疫球蛋白。
[0074]这些发现为方法开发铺平道路，所述方法用于从含免疫球蛋白溶液中去除血栓形成试剂，同时保存溶液内的大多数免疫球蛋白和/或不改变IgG亚类分布(例如IgGl-约65%、1862-约30%、1863-约6%和IgG4_约1% )。“保存溶液内的大多数免疫球蛋白”意指与根据本发明使溶液与载体接触前的初始免疫球蛋白含量相比较，该方法允许回收等于或大于75%的免疫球蛋白。在一个实施例中，与根据本发明使溶液与载体接触前的初始免疫球蛋白含量相比较，该方法允许回收80%、85%、90%、95%和99%的免疫球蛋白。
[0075] 本发明提供用于从含免疫球蛋白溶液中去除血栓形成试剂的方法，该方法包括以下步骤:提供在高于3.8至等于或低于5.3范围内的pH下的免疫球蛋白溶液；提供包含固定带负电基团的载体；使该溶液与该载体接触；以及收集未结合级分。在本发明的一个实施例中，溶液具有在高于3.8至等于或低于5.0范围内的pH。在本发明的另一个实施例中，该范围是等于或高于4.0至等于或低于5.0。在另一个实施例中，该范围是高于3.8至等于或低于4.7，例如pH为约4.0,4.1、4，2,4.3,4.4,4.5,4.6或4.7。再在另一个实施例中，该范围是高于3.8至等于或低于4.3。再在另一个实施例中，该范围是等于或高于4.0至等于或低于5.3。在另外一个实施例中，该范围极窄，等于或高于4.0至等于或低于4.3，或约
4.1至约4.3，并且特别允许去除FXIa和激肽释放酶。
[0076]术语“血栓形成试剂”是指具有诱导纤维蛋白凝块形成的潜力的试剂。术语“血栓形成试剂”在本文中可与术语止血、血栓性和促凝试剂互换使用。血栓形成试剂可以是例如激肽释放酶、FX1、FXIa、因子XI1、凝血酶和PKA。术语“血栓形成试剂”包括血栓形成诱导剂和“血栓生成剂”，例如在凝血级联中活化血栓形成因子的试剂。[0077]如本文所用，术语“载体”包括运载体或用于附着、固定、携带或稳定带负电基团的任何基质。载体在本领域中是熟知的，如Hermanson等人Immobilized Affinity LigandTechniques《固定亲和配体技术》(美国学术出版社(Academic Press Inc.) 1992年)中所述。用于执行本发明方法的载体可由任何材料制成，所述任何材料能够结合包含带负电基团的分子。固体载体包括但不限于基质、柱、盖玻片、色谱材料、过滤器、显微镜载玻片、试管、小瓶、瓶、ELISA载体、玻璃或塑料表面、色谱膜、薄片、颗粒、珠包括磁珠、凝胶、粉末、纤维等。
[0078]在本发明的一个实施例中，载体为色谱材料的形式。在本发明的另一个实施例中，载体为色谱膜的形式。载体可由下述构成:亲水材料，例如琼脂糖、琼脂糖凝胶、丙烯酸珠、纤维素、可控孔度玻璃、硅胶、葡聚糖类；疏水材料例如树脂；或有机人工/合成聚合物，例
如基于聚丙烯酰胺或聚苯乙烯的材料。代表性材料/聚合物可以商品名Sephacryle (瑞典法玛西亚公司(Pharmacia，Sweden))、LMtragelK (法国 Biosepara 公司(Biosepara，France))、TSK-Gel To\opcarl? (日本东曹公司(Toso Corp.，Japan))、HEMA(奥泰公司
(美国伊利诺斯州迪尔菲尔德(Alltech Ass.(Deer-field, II1.,USA)), Euperglt* (德国
达姆施塔特的罗姆公司(Rohm Pharma, Darmstadt, Germany))商购获得。材料还可以是基于二氢唑酮的(美国明尼苏达州圣保罗的3M公司(3M，St.Paul，Minn.，USA))。特别优选的
是Agarosex或Scpharoseu。这些材料例如从圣路易斯的西格玛公司(Sigma, St.Louis)
可商购获得。色谱材料可悬浮于合适的介质中，并且所得的浆料可用于例如色谱柱中。然而，本发明的方法还可例如通过使用试管或分批反应器分批执行。在本发明的一个实施例
中，载体是 FRACTOGEL? EMD, T OYOPEARL? 或 TSK-GFl8聚合物基质。
[0079]柱色谱法在本领域中是已知的(由Kenney和Fowell编辑的Practical ProteinChromatography《实践蛋白质色谱法》,第11卷，美国胡马纳出版社(Humana Press), 1992年)，并且一般是指其中允许溶液(移动相)穿越柱向下，并且个别组分通过固定相例如通过色谱材料吸附的技术。术语“带负电基团”是指包含化学基团的分子，所述化学基团携带负电荷，例如磺酸或其它含硫的酸(例如SO/—和SO3-)、甲酸及其它羧酸(例如COO—)、以及磷酸及其它含磷的酸(例如PO43O、硝酸及其它含氮的酸(例如NO2)的衍生物以及它们的组合。在本发明的一个实施例中，带负电基团是含硫的酸。在本发明的另一个实施例中，带负电基团是磺丙基(SP)。在本发明的另外一个实施例中，带负电基团是羧酸。在本发明的另一个实施例中，带负电基团是羧甲基(CM)。
[0080]载体可具有疏水或亲水表面，其通过疏水/亲水共价相互作用结合带负电基团的部分。载体的疏水/亲水表面也可以是聚合物例如塑料和任何其它聚合物，其中疏水/亲水基团已连接至例如聚乙烯、聚苯乙烯和聚乙烯基。作为另外一种选择，带负电基团可经由载体和带负电基团之间的连接基桥接与载体共价结合。如上文所用的术语“连接基”是指具有数十到百万道尔顿分子量的间隔臂或束缚带(leash)，其用作载体和带负电基团之间的中间连接物。例如连接基可以是蛋白质、肽和/或氨基酸。在载体直接结合包含带负电基团的分子(不含连接基)的情况下，在包含带负电基团的分子内的反应基团例如羟基、酯或氨基或羧基，可用于接合至载体上存在的反应基团，以产生共价键。载体还可具有荷电表面或可修饰为携带荷电基团，所述荷电表面或荷电基团与带负电基团相互作用。载体可具有其它反应基团，其可以是化学活化的，以便附接带负电基团例如溴化氰活化基质、环氧化物活化基质等。载体还可包含荷电基团可与之共价连接的无机载体例如氧化硅材料例如硅胶。在另一个实施例中，荷电基团附接至膜表面或掺入膜内。荷电基团与膜的附着可以与上文所述相同的方式执行。
[0081]根据本发明使用的阳离子交换剂可为膜的形式或为如上定义的色谱材料的形式。
[0082]包含固定带负电基团的载体一般被称为阳离子交换剂。“阳离子交换剂”因其吸引或结合阳离子或带正电粒子的能力而命名。通常，载体系统是带负电的，并且分子将在致使分子的净电荷为正的PH下结合。以膜形式的可商购获得的阳离子交换剂的例子是
Mustang? S膜和MusUmge S胶囊，其包含磺酸基官能团。
[0083]在使用膜作为载体的情况下(例如Mustangli S膜、Mustangk S胶囊)，免疫球
蛋白溶液可在2-4.3膜体积(MV) /分钟范围内的流体流速下与膜接触。术语“流体流速”通常是指溶液通过载体的流动。
[0084]术语“等电点”是指其中分子不携带净电荷的pH。低于等电点，分子携带净正电荷，高于等电点，分子携带净负电荷。
[0085]包含带负电基团的载体可以是弱(例如羧甲基(CM)-柱)或强阳离子交换剂(例
如Mustang? S膜)。弱阳离子交换剂一般是指包含弱酸的交换剂，所述弱酸随着pH降低
逐渐丧失其电荷，而强阳离子交换剂一般是指由强酸构成的交换剂，所述强酸能够在广泛PH范围上维持其电荷。`
[0086]术语“接触”是指组合动作的任何类型，所述组合动作以这样的方式使溶液或级分与载体且更特别与载体的荷电基团足够亲密接触，在所述方式下结合相互作用将在荷电基团和溶液/级分中存在的任何结合配偶体例如血栓形成试剂之间发生。溶液/级分可与载体一起温育足够时间段，所述时间段允许荷电基团和血栓形成试剂之间的结合。在接触载体时，溶液/级分可在7V至37°C的温度范围内。
[0087]与执行单个阳离子交换剂色谱法步骤相比较，根据本发明发现执行第二阳离子交换剂色谱法步骤导致FXIa从含免疫球蛋白溶液中的去除增加。执行该第二阳离子交换剂色谱法步骤，同时基本上保存IgG水平。因此，溶液可与载体接触数次。作为另外一种选择，当载体是过滤器时，超过一个过滤器可组合成单个功能单元。在本发明的一个实施例中，第一过滤步骤导致未结合级分I，其在上文指定的相同PH范围下与包含固定带负电基团的载体接触，以及收集第二未结合级分II。
[0088]例如通过用含免疫球蛋白溶液的缓冲液洗涤载体，载体可在使溶液/级分与缓冲液接触前进行平衡。
[0089]术语“平衡” 一般是指允许柱或载体达到特定的缓冲条件，诸如特定的pH水平和/或离子强度。
[0090]术语“未结合级分”通常是指在使含免疫球蛋白溶液与包含荷电基团的载体接触后获得或收集的流通物材料，或在使含免疫球蛋白溶液/级分与色谱载体接触后获得或收集的流通物材料。[0091]在一个实施例中，荷电基团是带负电的。在另一个实施例中，所获得的流通物材料被称为“未结合级分I”。在另一个实施例中，对“未结合级分I”实施包含带负电基团的载体，并且流通物材料被称为“未结合级分II”。
[0092]色谱柱可通过将干燥色谱材料或预膨胀的材料填充到柱内进行制备。干燥色谱材料可通过将材料在2体积的0.5N HCl (用于获得包含带负电基团的载体)或0.5N NaOH(用于获得包含带正电基团的载体)中搅动进行预处理。随后可允许材料沉降例如约30分钟。可滗出上清液，并且材料可用H2O洗涤直到分别达到4或8的pH值。材料随后可悬浮于2体积的0.5N NaOH(用于获得包含带负电基团的载体)或0.5N HCl (用于获得包含带正电基团的载体)中，并且上清液可例如在30分钟后滗出。可重复第二悬浮步骤，并且柱随后可用H2O洗涤直到滤液是中性的。
[0093]预膨胀的材料(和如上文段落中所述处理的干燥材料)可通过将材料用缓冲液搅动例如5分钟进行预处理，所述缓冲液用于装载6ml缓冲液/克预膨胀的材料(或30ml缓冲液/克干燥材料)比率的含免疫球蛋白溶液。PH随后可根据本发明进行调整，并且允许材料沉降例如约30分钟且滗出上清液。浆料随后可再分散在平衡缓冲液(如上文的比率)中。对于柱填充，随后允许材料沉降。
[0094]作为另外一种选择，可商购获得的预填充的即用型柱可无需任何预处理而使用。
[0095]其后，将柱(由干燥材料、预膨胀的材料或预填充的即用型柱制备)填充，并且平衡至所需PH条件(例如通过使用平衡缓冲液)。
[0096]在柱平衡后，装载具有所需pH的免疫球蛋白溶液，并且柱可用约五床体积的平衡缓冲液洗涤，以洗掉所有未结合的材料。柱可进行清洁用于二次使用。
[0097]色谱材料的制备和预处理、柱填充、柱平衡、含免疫球蛋白溶液的装载、未结合材料的收集和用于二次使用的柱清洁在本领域中是熟知的，参见例如由Michael Kastner编辑的Protein liquid chromatography《蛋白质液相色谱法》,埃尔塞维尔科学出版社(Elsevier science B.V.) 2000 年，第 45-49 页。
[0098]可在色谱法前对含免疫球蛋白溶液实施过滤步骤，以便减少溶液中的聚集体。可例如通过1.2 μ m深度过滤器或0.2 μ m过滤器执行过滤。在本发明的一个实施例中，在执行阴离子交换色谱法前，对该溶液实施0.2 μ m带正电的深度过滤器。有利地，带正电的深度过滤器用于去除带负电的材料例如磷脂、脂质等。阴离子交换剂色谱法可使用例如在具有35cm直径和15cm床高的柱中填充的7.5L树脂例如二乙氨基乙基(DEAE)树脂执行。填充柱可用至少48柱体积的纯化水(PuW)或注射用水(WFI)以100— 120L /小时的流体流速例如以IlOL /小时的流体流速进行平衡。平衡后，可将18柱体积的含免疫球蛋白溶液装载到柱内。含免疫球蛋白溶液的装载可以50-70L /小时的流体流速例如以60L /小时的流体流速执行。溶液可在2—10°C例如8—10°C的温度下。色谱法可在室温下(22±2°C)执行。
[0099]阳离子交换剂色谱法可使用具有1560ml膜体积的阳离子交换滤膜执行。膜尺寸的多种组合可用于获得1560ml的最终膜体积，例如具有780ml体积的两个滤膜可串联连接以形成1560ml的膜总体积。
[0100]阳离子交换剂可用至少38膜体积的IN NaOH,随后用至少64膜体积的IN NaCl以1.6-2.3L /分钟的流体流速预条件化。术语“预条件化” 一般指在使用前洗涤载体或膜，以便去除可能存在于载体或膜表面上的不需要的物质。其后，滤膜可用至少64膜体积的20mM乙酸钠(调整至所需pH)以1.6-2.3L /分钟的流体流速进行平衡，直至达到所需pH。平衡后，至少50—140膜体积的含免疫球蛋白溶液可过滤通过滤膜。色谱法可在室温下(22±2°C)以1.6-2.3L /分钟的流体流速执行。装载溶液的温度可以是6— I (TC。
[0101]含免疫球蛋白溶液中的蛋白质浓度在装载至阳离子或阴离子交换剂的过程中可在 40-75mg / ml 范围内，例如 45、50、55、60、65、70、75mg / ml 的蛋白质浓度。
[0102]I在柱色谱法的情况下，未结合级分可在由用于平衡的相同缓冲液和/或用于将含免疫球蛋白溶液装载到柱上的缓冲液(有时被称为“结合缓冲液”)洗涤装载柱后获得。
[0103]根据本发明还发现苄脒琼脂糖凝胶(其亲和结合丝氨酸蛋白酶例如FXIa)亲和色谱法不适合于从含免疫球蛋白溶液中去除FXIa。然而，惊讶地发现通过在低pH水平(例如
5.3的pH水平)下对免疫球蛋白溶液实施肝素亲和色谱法，可从免疫球蛋白溶液中有效去除 FXIa。
[0104]不受机制束缚，看起来在低pH水平下，肝素亲和色谱法充当阳离子交换剂(具有酸性基团例如COOH和H2SO4)，并且因此可有利地用于根据本发明从含免疫球蛋白溶液中有效去除FXIa。
[0105]“亲和色谱法” 一般基于例如在抗原和抗体、酶和底物、或受体和配体之间的高度特异性生物相互作用。
[0106]在本发明的一个实施例中，与初始FXIa含量(在根据本发明使溶液或级分与包含固定带负电基团的载体接触前)相比较，来自含免疫球蛋白溶液或级分的超过75%例如80%、85%、90%、95%和99%的FXIa去除视为有效的。
[0107]在本发明的一个实施例中，与初始激肽释放酶含量(在根据本发明使溶液或级分与包含固定带负电基团的载体接触前)相比较，来自含免疫球蛋白溶液或级分的超过75%例如80%、85%、90%、95%、97%和99%的激肽释放酶去除视为有效的。
[0108]PKA在7—8.2范围内的pH水平下具有零净电荷(PKA的等电点是约8 ;http: / /WWW.expasy.0rg),并因此预期其不与带正电基团结合。然而，根据本发明发现对阴离子交换剂实施具有在7 — 8.2范围内的pH水平的免疫球蛋白溶液导致有效的PKA去除。结果还显示在阴离子交换剂色谱法中使用7—8.2的pH水平范围还导致未结合级分中的高IgG回收。pH7 — 8.2是其中IgG具有零净电荷或净负电荷的水平，并且因此预期其中一些将由于与阴离子交换剂的结合而丧失。惊讶地发现对含免疫球蛋白溶液实施在7—8.2的pH水平范围下的阴离子交换剂导致PKA的最大去除，并且实际上无IgG的丧失。
[0109]因此，为了去除PKA和同时获得高免疫球蛋白回收，根据本发明的方法还可包括以下步骤:在7—8.2范围内的pH下使含免疫球蛋白溶液/级分与包含固定带正电基团的载体接触，以及收集未结合级分。因此，对含免疫球蛋白溶液实施在7—8.2范围内的pH下的阴离子交换剂。
[0110]在一个实施例中，该方法首先采用阴离子交换剂步骤，随后为本发明的阳离子交换剂步骤。在另一个实施例中，该方法首先采用阳离子交换剂步骤，随后为阴离子交换剂步骤。
[0111]在一个实施例中，将含免疫球蛋白溶液的PH用酸或碱溶液调整至在7 — 8.2范围内的pH，并且使溶液与用具有与溶液相同pH的缓冲液或PuW预平衡的带正电基团接触，且收集未结合级分。收集级分的PH可用酸溶液调整至在高于3.8至等于或低于5.3范围内的PH，并且可使级分与用具有与级分相同pH的缓冲液预平衡的带负电基团接触，且收集未结合级分。
[0112]在另一个实施例中，将含免疫球蛋白溶液的pH用酸或碱溶液调整至在高于3.8至等于或低于5.3范围内的pH，并且与用具有与溶液相同pH的缓冲液预平衡的带负电基团接触，且收集未结合级分。收集级分的pH可用碱溶液调整至在7 — 8.2范围内的pH，并且与用具有与级分相同PH的缓冲液或PuW预平衡的带正电基团接触，且收集未结合级分。
[0113]在本发明的一个实施例中，阴离子和阳离子交换剂步骤一个紧接另一个后。在本发明的另一个实施例中，在本发明的阴离子和阳离子交换剂步骤之间存在另外的步骤。
[0114]阴离子或阳离子交换剂的步骤可执行数次，以增加纯化。
[0115]如本文所用，术语“带正电基团”是指包含下述化学基团的分子，所述化学基团携带正电荷，例如铵、烷基铵、二烷基铵、三烷基铵、季铵[例如二乙氨基乙基(DEAE)、二甲氨基乙基或三甲氨基乙基]、烷基、H+、Na+、K+、Ca2+、Mg2+、氨基官能团(例如NR2H+)，以及它们的组合。
[0116]在本发明的一个实施例中，带正电基团是季铵(Q)。在本发明的另一个实施例中，带正电基团是二乙氨基乙基(DEAE)。
[0117]在本发明的一个实施例中，含免疫球蛋白溶液首先与包含固定带正电基团的载体在7—8.2范围内的pH下接触，收集未结合级分；随后使未结合级分与包含固定带负电基团的载体接触；以及收集未结合级分I。作为另外一种选择，含免疫球蛋白溶液可首先与包含固定带负电基团的载体接触；收集“未结合级分I”;并且随后使未结合级分I与包含固定带正电基团的载体接触；以及收集“未结合级分”。
`[0118]包含带正电基团的载体可由任何材料构成,所述任何材料能够结合包含如上定义的携带正电荷的化学基团的分子。
[0119]包含固定带正电基团的载体一般被称为阴离子交换剂。“阴离子交换剂”因其吸引或结合阴离子或带负电粒子的能力而命名。阴离子交换剂在本领域中是熟知的(由Kenney和Fowell编辑的Practical Protein Chromatography (《实践蛋白质色谱法》)，第11卷，Humana Press (美国胡马纳出版社)，1992年)。在阴离子交换剂中，载体系统是带正电的，并且如果缓冲液PH高于蛋白质的独特等电点，则结合分子。
[0120]包含固定带正电基团的载体可以是弱或强阴离子交换剂。弱阴离子交换剂一般是指由弱酸构成的交换剂，所述弱酸随着PH降低逐渐丧失其电荷，而强阴离子交换剂一般是指由强酸构成的交换剂，所述强酸能够在广泛PH范围上维持其电荷。
[0121]在接触载体时，溶液/级分可在8°C至37°C的温度范围内。
[0122]含免疫球蛋白溶液/级分可与载体接触数次，和/或可使用组合成单个功能单元的两个或更多个过滤器。
[0123]载体可在使溶液或级分与载体接触前进行平衡，例如通过用含免疫球蛋白溶液/级分的缓冲液洗涤载体。
[0124]更具体地，在使溶液与包含固定带正电基团的载体接触后，收集未结合级分(在使免疫球蛋白溶液与载体接触后获得流通物材料)。在柱色谱法的情况下，未结合级分可在由用于平衡的相同缓冲液和/或用于将含免疫球蛋白溶液/级分装载到柱上的缓冲液洗涤装载柱后获得。
[0125]在载体和带正电基团之间的替代固定可能性在上文对于在载体和带负电基团之间的固定可能性详细阐述。
[0126]在使用柱作为包含带正电基团的载体的情况下，含免疫球蛋白溶液可与柱以I一2ml /分钟/ cm2的线速度接触。术语“过滤线速度”是指流动穿过柱的溶液的速度。
[0127]本发明还提供用于从含免疫球蛋白溶液中去除血栓形成试剂的方法，其包括以下步骤:提供在7 — 8.2范围内的pH下的含免疫球蛋白溶液，提供包含固定带正电基团的载体，且提供包含固定带负电基团的载体；使该溶液与包含固定带正电基团的载体接触；收集未结合级分；将级分的PH调整至在高于3.8至等于或低于5.3范围内的pH ;使未结合级分与包含固定带负电基团的载体接触；以及收集未结合级分I。
[0128]在本发明的一个实施例中，从含免疫球蛋白溶液中去除可检测量的血栓生成剂(例如PKA、激肽释放酶和/或FXIa)。
[0129]术语“可检测的”是指例如使用如下文材料和方法部分中所述的分析方法检测的水平。
[0130]在本发明的一个实施例中，与初始PKA含量(在根据本发明使溶液或级分与包含固定带正电基团的载体接触前)相比较，来自含免疫球蛋白溶液或级分的超过80%例如83 %、85 %、90 %、95 %和99 %的PKA去除视为有效的。根据本发明的发现还显示使用由三维交联疏水性丙烯酸类聚合物制成的SDR柱导致残余量的FXIa的去除。SDR柱是其中样品以相对高的移动相盐浓度与疏水性固定相相互作用的色谱法技术。
[0131]因此，含免疫球蛋白溶液也可与包含三维交联疏水性丙烯酸类聚合物的色谱材料接触，并且随后收集未结合级分(例如“未结合级分III”)。作为另外一种选择，与包含三维交联疏水性丙烯酸类聚合物的色谱材料的接触可在与包含固定带负电基团的载体接触后或在与包含固定带正电基团的载体接触后执行，即，使“未结合级分”、“未结合级分” I或“未结合级分II”与包含三维交联疏水性丙烯酸类聚合物的色谱材料接触，并且随后收集未结合级分III。此类三维交联疏水性丙烯酸类聚合物的例子是由Biosepra供应的HyperD树脂。HyperD色谱法涉及疏水相互作用吸附和分子排阻的混合模式[Guerrier L等人“Specific sorbent to remove solvent-detergent mixtures from virus-1nactivatedbiological fluids” (从病毒灭活的生物流体中去除溶剂-洗漆剂混合物的特异性吸附剂)。J Chromatogr B Biomed Appl.(《色谱法杂志B辑:生物医学与应用》)1995年2月3 H ；664(1):119—125]。
[0132]观察到(使用如Wessler 等人 Biologic assay of a thrombosis-1nducingactivity in human serum。(人血清中的血栓诱导活性的生物学测定法)J Appl Physiol.(《应用生理学杂志》)1959年；14:943—946中所述的Wessler动物模型)，根据本发明实施激肽释放酶、PKA和/或FXIa去除的免疫球蛋白组合物显示出减少的血栓诱导活性。
[0133]在一个实施例中，本发明提供用于使含免疫球蛋白溶液不含血栓形成试剂的方法，其包括:使该溶液经历至少两个负离子色谱法步骤:在7 — 8.2范围内的pH下的阴离子交换剂色谱法；随后为在高于3.8至等于或低于5.3范围内的pH下的阳离子交换剂色谱法。该方法还可包括使用包含三维交联疏水性丙烯酸类聚合物的色谱材料，对该溶液实施负疏水性色谱法的步骤。[0134]本发明还提供用于制备免疫球蛋白组合物的方法，其包括以下步骤:使含免疫球蛋白溶液经历至少两个负离子色谱法步骤:在7 — 8.2范围内的pH下的阴离子交换剂色谱法；随后为在高于3.8至等于或低于5.3范围内的pH下的阳离子交换剂色谱法。[0135]阳离子交换剂色谱法可在高于3.8至等于或低于5.0范围内的pH下、在等于或高于4.0至等于或低于5.0范围内的pH下、在高于3.8至等于或低于4.7范围内的pH下、在高于3.8至等于或低于4.3范围内的pH下、或在等于或高于4.0至等于或低于4.3范围内的PH下执行。
[0136]本发明的方法还可包括使用包含三维交联疏水性丙烯酸类聚合物的色谱材料的负疏水性色谱法。
[0137]在某些实施例中，来自根据本发明的阳离子交换剂的流通物材料命名为未结合级分I ;来自根据本发明的阴离子交换剂的流通物材料命名为未结合级分；来自根据本发明的第二阳离子交换剂步骤的流通物材料命名为未结合级分II ;并且来自根据本发明的包含三维交联疏水性丙烯酸类聚合物的色谱材料的流通物材料命名为未结合级分III。这些级分各自可在根据本发明的一个或多个色谱法步骤和条件下以不同次序装载，以去除血栓形成试剂且收集含免疫球蛋白的流通物级分。
[0138]在本发明的一个实施例中，如美国专利号6，468，733中所述，将含免疫球蛋白溶液装载到三维交联疏水性丙烯酸类聚合物内。收集所得的未结合级分III，将未结合级分III的PH平衡至7 — 8.2，并且对级分III实施在相似pH条件下的阴离子交换剂。收集未结合级分，在根据本发明装载到阳离子交换剂前，根据本发明平衡未结合级分的PH，且收集未结合级分I。该最后步骤可重复。
[0139]术语“负相色谱法”是指这样选择的条件，其使得仅纯化蛋白质(即免疫球蛋白)的相对小比例(例如小于25% )或无一与色谱载体结合，并且它因此经过色谱分离中的载体。占优势部分的蛋白质因此存在于流通物材料中。
[0140]术语“正相色谱法”是指这样选择的条件，其使得大多数纯化蛋白质(即免疫球蛋白)与色谱载体结合，并且因此需要在非等度条件下的洗脱步骤以回收蛋白质。
[0141]结果显示还在阳离子和阴离子交换剂色谱法的放大过程中获得血栓形成试剂的有效去除。
[0142]本发明还提供包含低水平血栓形成试剂的免疫球蛋白组合物。免疫球蛋白可以液体或固体形式例如作为冻干粉末提供。
[0143]在本发明的一个实施例中，含免疫球蛋白溶液首先与包含固定带正电基团(阴离子交换剂)的载体接触；收集所得的未结合级分，并且与包含固定带负电基团(阳离子交换剂)的载体接触，以及收集所得的未结合级分I，其包含具有低血栓形成试剂的免疫球蛋白组合物。在本发明的一个实施例中，含免疫球蛋白溶液还与包含三维交联疏水性丙烯酸类聚合物的色谱材料(疏水色谱法-HIC)接触。
[0144]具有低水平血栓形成试剂的免疫球蛋白组合物是指例如具有小于6IU / ml PKA的组合物；当例如通过执行如下所述的凝血酶生成测定法，测定免疫球蛋白组合物中的凝血酶形成时，显示出小于约IOOnM的凝血酶生成；小于0.8ng / ml FXIa ;和/或小于200ng / ml激肽释放酶(例如小于126ng / ml)的组合物。PKA、激肽释放酶和FXIa水平可通过执行如下文材料和方法部分中所述的测定法进行测定。[0145]在另一方面，本发明涉及可根据本发明的方法获得的免疫球蛋白组合物。免疫球蛋白组合物可在容器中提供。小瓶或预填充注射器可含有不同体积的组合物，例如组合物可具有 0.5ml、2ml、10ml、30ml、50ml、100ml、200ml、500ml、I 升、2 升和 3 升的体积。
[0146]术语“容器”是指设计用于容纳免疫球蛋白组合物的任何容器。
[0147]免疫球蛋白组合物可包含在2-20% w / V或5—10%范围内的蛋白质浓度。在本发明的一个实施例中，组合物具有在4.5 — 5.5% w / V范围内的蛋白质浓度。在本发明的另一个实施例中，组合物具有约5% w / V的蛋白质浓度。在本发明的另一个实施例中，组合物具有约10% w / V的蛋白质浓度。在一个实施例中，蛋白质浓度是约50mg / ml ο总蛋白质含量中的免疫球蛋白％可以是超过90%。在本发明的一个实施例中，总蛋白质含量中的免疫球蛋白百分比是95 %。
[0148]在本发明的另一个实施例中，免疫球蛋白组合物包含低百分比的蛋白质聚集体，例如小于3%蛋白质聚集体。
[0149]术语“聚集体”是指含有固体的材料块，例如蛋白质聚集体。聚集体可通过HPLC进行测量。
[0150]在本发明的一个实施例中，组合物以50ml的体积提供且具有2.5g的蛋白质含量。在本发明的另一个实施例中，组合物以100ml的体积提供且具有5.0g的蛋白质含量。在本发明的另一个实施例中，组合物以200ml的体积提供且具有10.0g的蛋白质含量。
[0151]包含组合物的小瓶可贮存于低于25°C的温度下，例如在0°C或2°C至8°C的温度下，并且避光直至使用时。
[0152]免疫球蛋白组合物还可包含赋形剂。如本文所用，术语“赋形剂”是指添加到药物组合物中的惰性物质。赋形剂可添加到组合物内，例如以便确保活性成分在贮存后保持其化学稳定性和生物活性，以有助于制造过程和/或由于美观原因例如颜色。赋形剂的例子包括但不限于多种糖例如麦芽糖或D-山梨醇；甘氨酸；聚合物型赋形剂例如PEG或血清蛋白质例如白蛋白。
[0153]免疫球蛋白组合物可包含至少95%作为活性成分的人正常免疫球蛋白G、10%麦芽糖和注射用水。免疫球蛋白A(IgA)含量可等于或小于≤0.15mg / ml。
[0154]本发明的另外一个目的通过提供用于治疗受试者的方法实现，所述受试者患有免疫缺陷例如原发性或继发性免疫缺陷、炎性疾病、自身免疫疾病或急性感染，该方法包括向该受试者施用有效量的根据本发明的免疫球蛋白组合物。
[0155]术语“受试者”包括哺乳动物起源的动物,包括人。在一个实施例中，受试者为患者。
[0156]术语“有效量”是指预防或治疗(缓解一种症状或所有症状)疾病、病症或状况所需的剂量。有效量可基于病程响应组合物的施用发生的任何变化进行测量。有效剂量可根据受试者的年龄和体重、疾病及其严重性(如早期或晚期)以及本领域技术人员可认识到的其它因素而变化。
[0157]免疫球蛋白组合物可用于替代疗法，例如在原发性免疫缺陷中(具有原发性缺陷型抗体合成例如无丙种球蛋白血症或低丙种球蛋白血症的患者)；伴严重继发性低丙种球蛋白血症和复发性感染的慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，其中预防性抗生素已失败；伴低丙种球蛋白血症和复发性细菌感染的平台期骨髓瘤，其未能响应肺炎球菌免疫；在同种异体造血干细胞移植(HSCT)后的低丙种球蛋白血症I患者；具有先天性AIDS和复发性感染的儿童；和异源骨髓移植；和在免疫调节中，例如慢性炎性脱髓鞘多神经病(CIDP);特发性血小板减少性紫癜(ITP);格巴二氏综 合征；和川崎病。
[0158]剂量和给药方案取决于预期用途。在替代疗法中，剂量可能需要对每个患者进行个体化，取决于药代动力学和临床应答。
[0159]具有低水平血栓形成试剂的根据本发明制备的免疫球蛋白组合物可通过导致全身吸收的途径施用。施用途径的非限制性例子包括但不限于静脉内、皮下、腹膜内和肌内。有利地，患者可接受高剂量的根据本发明制备的免疫球蛋白溶液，其具有低水平的血栓形成试剂。施用可以初始更高的剂量例如0.4-0.8g / kg执行，随后为间或的相同或更低的剂量。更高的剂量可预期使患者的免疫球蛋白浓度快速增加到有效靶浓度。
[0160]术语“静脉内的”是指组合物施用到受试者的静脉内。施用可以是间歇的或通过连续滴注。术语“间歇的”与术语“静脉内推注”或“静脉内推压”同义。
[0161]术语“皮下的”是指通过在受试者的皮肤下注射的组合物引入。注射可通过例如经由将皮肤捏起或拉起且离开下面组织产生凹坑来执行。任选地，输注可通过在受试者的皮肤下植入的药物递送泵的皮下植入来执行。泵可对于预定时间段以预定速率递送预定量的免疫球蛋白。
[0162]“肌内的”意指免疫球蛋白组合物直接引入肌肉内。注射可给予任何肌肉内，包括但不限于三角肌、股外侧肌、臀部腹腔间区和背臀肌区肌肉。施用可在多个位置处执行。“腹膜内注射”是指免疫球蛋白注射到腹膜内。
[0163]本发明的免疫球蛋白组合物可由健康供体捐献的血液或血液级分制备。免疫球蛋白可由得自1000个供体和更多个的合并血液或血液级分制备。免疫球蛋白可由具有高抗体滴度的筛选供体制备。此类技术的例子公开于W0-2007 / 017859中，所述专利的内容以引用的方式并入本文。术语“血液级分”是指包含免疫球蛋白的全血级分例如血浆或血清。免疫球蛋白组合物可通过重悬浮来自血浆分馏的糊剂II来获得，所述血浆分馏例如根据科恩(Cohn)分懼和 / 或 Kistler-Nitschmann (KN)分懼法。
[0164]衍生自血液组分的免疫球蛋白组合物通常由感染性粒子进行纯化。病毒灭活可通过过滤、纳米过滤、溶剂/洗涤剂处理、热处理例如但不限于巴氏灭菌、Y或UVC(〈280nm)照射、或通过本领域已知的任何其它方法来执行。
[0165]在本发明的一个实施例中，免疫球蛋白组合物通过使用TnBP / Triton-X-1OO的溶剂-洗涤剂法和通过以pH-4的纳米过滤进行纯化。
[0166]术语“感染性粒子”是指可在生物有机体的细胞中感染或繁殖的微观粒子，例如但不限于微生物或朊病毒。感染性粒子可以是病毒粒子。
[0167]感染性粒子的灭活程序可通过在纯化程序前和/或过程中将失活分子加入组合物来执行。可通过重力、柱色谱法或通过本领域已知的任何其它方法，将所加入的分子及其产物去除。可通过纳米过滤或通过选择性吸收方法，例如亲和、离子交换或疏水色谱法，去除感染性粒子。可进行多步病毒灭活程序。例如，可对含免疫球蛋白溶液实施溶剂/洗涤剂处理、热处理、选择性色谱法和纳米过滤。
[0168]术语“病毒灭活”是指其中病毒维持在溶液中但致使不存活(例如通过溶解其脂质外壳)的情况，和/或关于其中病毒从溶液中物理去除(例如通过尺寸排阻技术)的情况。
[0169]“溶剂/洗涤剂(S / D)处理”通常是指通过破坏其脂质包膜而使包膜包被的病毒灭活的过程。处理可通过添加洗漆剂(诸如Triton X_45、Triton X-100或Tween80)和溶剂[诸如磷酸三正丁酯(TnBP)、二或三烷基磷酸酯]而进行。用于灭活脂质衣壳病毒的溶剂-洗涤剂组合可以为本领域已知的任何溶剂-洗涤剂组合，诸如TnBP和Triton X-100 ；Tween80和胆酸钠及其它。溶剂洗涤剂的浓度可以是本领域通常使用的那些，例如>0.1%TnBP和>0.1 % Triton X-100。通常，在其下溶剂-洗涤剂灭活病毒的条件由下述组成:10—IOOmg / ml的溶剂/洗涤剂，在范围为5— 8的pH水平和范围为2_37°C的温度下，共30分钟至24小时。然而，其它溶剂/洗涤剂组合和合适的条件将对本领域的任何技术人员显而易见。S / D处理中使用的溶剂-洗涤剂本体可例如通过使用下述去除:色谱柱例如疏水相互作用色谱柱(HIC)，例如C-18 二氧化硅填充材料和SDR(溶剂-洗涤剂去除)HyperD ；蛋白质吸附基质例如尚子交换基质；未和基质；和/或尺寸排阻基质。S / D去除还可包括油提取步骤。
[0170]“纳米过滤”通常是指例如通过使用诸如Planova?20N、35N和75N ；Viresolve /70T\Viresolve / 180?的专门纳米级过滤器，将有脂质包膜的病毒和无包膜病毒从溶液中排除的过程。过滤器可具有小于70nm，优选地介于15nm和50nm之间的孔尺寸。然而，具有足以从溶液中减少或消除病毒的孔尺寸的任何膜均可用于纳米过滤中。通过纳米过滤去除的病毒可以为有包膜病毒[例如HIV、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、西尼罗病毒、细胞巨化病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、单纯疱疫病毒]和无包膜病毒(例如甲型肝炎病毒、细小病毒B19 (paravirus B19)、脊髓灰质炎病毒)。
[0171]免疫球蛋白纯化技术的例子公开于美国专利号6，468，733、EP专利号1，161，958和国际PCT公开W099 / 18130中，所述专利的内容以引用的方式并入。例如，用于从来源溶液例如科恩级分II中纯化免疫球蛋白的方法可包括:(a)将阳离子交换树脂用具有PH4.0-4.5的酸性溶液进行预处理；(b)使来源溶液与阳离子交换树脂接触；和(c)洗脱与阳离子交换树脂结合的免疫球蛋 白。在与阳离子交换树脂接触前，来源溶液可用有机溶剂和洗涤剂处理。
[0172]用于纯化免疫球蛋白的另一方法可包括:(a)将溶液用溶剂-洗涤剂组合在足以使脂质包被病毒灭活的浓度和条件下进行处理；(b)通过使(a)中获得的溶液经过由二氧化硅珠组成的色谱填料，从溶液中去除溶剂-洗涤剂组合，所述二氧化硅珠的孔体积充满三维交联疏水性丙烯酸类聚合物；和(c)使步骤(b)的溶液经过具有约15nm至约70nm的孔尺寸的过滤器，如美国专利号6，468，733中所述。
[0173]免疫球蛋白组合物可通过超滤过程浓缩。超滤可随后进行渗滤，以交换缓冲液。分别通过超滤和渗滤的浓缩和渗析可在一个步骤中或作为两个分开步骤执行。渗滤可针对适合于人施用的任何溶液执行。此类溶液的非限制性例子包括但不限于0.3% NaCl和约1.6至约2.6%甘氨酸例如约2.25%。
[0174]SM
[0175]材料和方法。
[0176]免疫球蛋白溶液。
[0177]a)糊剂II重悬浮。[0178]将通过科恩分懼法(Cohn,E.J.The history of plasma fractionation。(血衆分懼史)In Advances in Military Medicine (《军事医学进展》)，Andrus等人编辑利特尔&布朗出版社(Little，Brown&Co，1948))由血浆制备的糊剂II (45Kg)转移至破碎机槽，向其中加入冷(4°C )注射用水(WFI)(糊剂II重量的3倍)，以实现180Kg的最终重量。首先将重悬浮的糊剂在4-6°C下搅动约5小时的时期，并且随后在4-6°C下不含搅动滗出约37小时，以允许主要蛋白质聚集体沉淀。在沉淀后，使上清液与沉淀物分离且用于以下步骤。
[0179]b) CUNO 讨滤
[0180]使先前步骤中获得的上清液过滤通过一对平行的CUN00.2μπι带正电的深度过滤器(Cuno Zeta Plus,美国康涅狄格州的库诺有限公司(Cuno incorporation Inc.CTUSA))过滤，以便去除聚集体。过滤器压力在过滤步骤过程中不超过1.0巴。在过滤过程中的流体流速是60L /小时，并且温度是7.2V。[0181]c)阴离子交换色谱法-二乙氨基乙基纤维素(DEAE)柱。
[0182]在下一个步骤中，对得自步骤b)的溶液实施阴离子交换剂(参见实例7 —11)。
[0183]除非另外指明，否则DEAE柱用7柱值(CV ;即77ml)的纯水(或WFI)以2.8ml /分钟的流体流速进行平衡。平衡后，将得自步骤b)的免疫球蛋白溶液装载到柱内。柱压力不超过1.0巴。
[0184]在进一步加工的情况下，除非另外指明，否则步骤c)使用下述条件(放大条件)执行:DEAE柱(Toyopearl DEAE-650M ；T0S0HAAS)用作阴离子交换剂[7.5L树脂。柱的直径是35cm ;和15cm的床高]。将柱用360L WFI以IlOL /小时的流体流速洗涤。装载作为CUNO过滤的继续以60L /小时的流体流速在8 — 10°C (材料温度)下执行。免疫球蛋白溶液的装载体积是18柱体积，并且所实施溶液的pH是7-7.6。色谱法在室温下(22±2°C )执行。
[0185]d) DH 调糖
[0186]通过在连续搅拌下添加0.5M HCl将溶液的pH调整至4.59。将温度维持在8±2°C下。为了去除聚集体，使溶液通过0.45 μ m-0.65 μ m过滤器(Sartobran)过滤到干净器皿内。
[0187]e)浓缩至90s / L和渗滤
[0188]所得的d)的溶液通过使用含有具有30，OOOD的排除极限的膜(FiltronMaxisette ；30KD)的超滤盒进行超滤。通过用500Kg WFI洗漆来制备盒。在超滤过程中，将蛋白质溶液(200Kg)浓缩至90g / L(141Kg的最终重量)。该步骤随后为以恒定体积针对705Kg WFI的渗滤，以便去除残余乙醇且使渗透度降低到<30m0sm / Kg。随后将蛋白质浓度用WFI调整至73g/L，以达到173Kg的最终体积。在该步骤自始至终将温度维持在 8±2°C。
[0189]阳离子交换色谱法[通过使用Mustang S膜、MustangR S胶囊、SP柱或CM柱(关于具体条件分别参见实例2-4、实例5、实例I和实例I)]在步骤c)后使用SP柱执行，或在步骤e)后使用Mustangli S膜或Mustang+ S胶囊执行。
[0190]在步骤c)后执行阳离子交换色谱法时，对约50_60mg / ml蛋白质实施色谱法。在步骤e)后执行阳离子交换色谱法时，对约70mg / ml蛋白质实施色谱法。[0191]为了减少聚集体，在对免疫球蛋白溶液实施阳离子交换剂前，将溶液通过过滤器[得自赛多利斯(Sartorius sartopure)的1.2 μ m深度过滤器(在SP柱前)或得自科宁
的0.2 μ m CA过滤器(在Mustang? S膜或Mustangκ胶囊前)]过滤。
[0192]对于SP柱，该柱在装载具有20ml20mM乙酸盐缓冲液的免疫球蛋白溶液前进行平衡，所述乙酸盐缓冲液具有与待装载的免疫球蛋白溶液相容的PH水平。
[0193]对于Mustang? S膜，该滤膜在装载具有20ml20mM乙酸盐缓冲液的免疫球蛋白溶液前进行平衡，所述乙酸盐缓冲液具有与待装载的免疫球蛋白溶液相容的PH水平。
[0194]对于Mustang^ S胶囊，该胶囊根据制造商的说明书在平衡前进行预条件化。除
非另外指明，否则在下一个步骤前，将胶囊用具有pH水平4.2的600ml20mM乙酸盐缓冲液
进行平衡。
_5] 溶剂/洗涤剂(S / P)处理。
[0196]将免疫球蛋白溶液平衡至pH5.3且如下实施S / D处理(以灭活有脂质包膜的病毒):1% Triton X-100和0.3%三(正丁基)磷酸酯(TnBP) (v / v)混合在一起，且随后缓慢添加到溶液内，同时快速搅动(20Hz)溶液。随后使溶液在6.9°C下、在恒定轻柔搅动下温育约4.5小时。在温育期结束时，经过I一 1.5小时的时期和在搅动(以20Hz的速度)下，将温度升高至23°C。在下一个步骤中，使SD处理过的溶液通过3 μ深度过滤器(赛多利斯)随后为0.45-0.65 μ m膜过滤器(赛多利斯)序贯过滤(以便在后续S / D去除步骤前去除肉眼可见的颗粒碎片)。
[0197]通讨SDR梓的S / D去除。
[0198]S / D去除通过HyperD溶剂-洗漆剂去除色谱树脂的专用柱(通过Biosepra的SDR-HyperD)执行。在装载SD处理过的免疫球蛋白溶液前，将柱用450Kg WFI (在0.8巴的最大压力下)和以80L /小时的流速进行制备。柱长是54cm，具有28cm的直径，并且树脂的体积是30-32L。流速是78L /小时，并且在装载样品达到基线后将37Kg WFI用于洗涤柱。收集的总流通体积是176.7Kg。
[0199]前激肽释放酶激活化剂水平的测暈。
[0200]前激肽释放酶激活化剂(PKA)，内源性凝血级联中的第一酶原，使前激肽释放酶活化为激肽释放酶。在该测定法中，前激肽释放酶(其加入测试样品中)通过测试样品中发现的PKA活化为激肽释放酶。形成的激肽释放酶随后以恒定速率将生色底物(H-D-But-CHA-Arg-pNA)切割为有色的对硝基苯胺(pNA)(参见下文反应)。该反应可在405nm处进行分光光度计测量。
[0201 ]所得的颜色与测试样品中存在的PKA量成比例。
[0202]
【权利要求】
1.一种用于从含免疫球蛋白溶液中去除血栓形成试剂的方法，所述方法包括以下步骤:提供在高于3.8至等于或低于5.3范围内的pH下的所述含免疫球蛋白溶液；提供包含固定带负电基团的载体；使所述溶液与所述载体接触；以及收集未结合级分I。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述溶液具有在高于3.8至等于或低于5.0范围内的pH。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述溶液具有在等于或高于4.0至等于或低于5.0范围内的pH。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述溶液具有在高于3.8至等于或低于4.7范围内的pH。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述溶液具有约4.0,4.1,4.2,4.3,4.4,4.5,4.6或4.7的pH。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述溶液具有在高于3.8至等于或低于4.3范围内的pH。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述溶液具有在等于或高于4.0至等于或低于4.3范围内的pH。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述溶液具有在等于或高于4.1至等于或低于4.3范围内的pH。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中还使所述未结合级分I与所述包含固定带负电基团的载体在相同pH下接触；以及收集未结合级分II。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述载体为色谱材料或色谱膜的形式。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述载体材料或膜是亲水的并且选自琼脂糖、琼脂糖凝胶、丙烯酸珠、纤维素、可控孔度玻璃、硅胶和葡聚糖类；疏水的并且选自树脂；或选自基于聚丙烯酰胺或聚苯乙烯的材料或膜的有机合成聚合物。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述带负电基团经由存在于所述载体和所述带负电基团之间的连接基固定至所述载体。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述连接基选自蛋白质、氨基酸和肽。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述载体是化学修饰的。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述载体是弱阳离子交换剂或强阳离子交换剂。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述固定带负电基团选自磺酸及其它含硫的酸、甲酸及其它羧酸、磷酸及其它含磷的酸、硝酸及其它含氮的酸的衍生物、以及它们的组合。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述固定带负电基团是含硫的酸。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述含硫的酸是磺丙基。
19.根据权利要求16所述的方法，其中所述固定带负电基团是羧酸。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述羧酸是羧甲基。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，还包括以下步骤:将所述未结合级分I或所述未结合级分II调整至在7-8.2范围内的pH ;使所述未结合级分I或所述未结合级分II与包含固定带正电基团的载体在7-8.2范围内的pH下接触；以及收集未结合级分。
22.根据权利要求1所述的方法，还包括以下步骤:在与所述包含固定带负电基团的载体接触前，调整所述溶液并且使所述溶液与包含固定带正电基团的载体在7-8.2范围内的PH下接触；以及收集未结合级分。
23.根据权利要求21或22所述的方法，其中所述固定带正电基团选自铵、烷基铵、二烷基铵、三烷基铵、季铵、烷基、H+、Na+、K+、Ca2+、Mg2+、氨基官能团、以及它们的组合。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述固定带正电基团是季铵。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述季铵是二乙氨基乙基(DEAE)。
26.根据权利要求22-25中任一项所述的方法，其中所述方法包括使所述溶液与所述包含固定带正电基团的载体在7-8.2范围内的pH下接触；收集所述未结合级分；将所述未结合级分的PH调整至在高于3.8至等于或低于5.3范围内的pH ;使所述未结合级分与所述包含固定带负电基团的载体在高于3.8至等于或低于5.3范围内的pH下接触；以及收集所述未结合级分I。
27.根据权利要求26所述的方法，其中调整所述未结合级分和使所述未结合级分与所述包含固定带负电基团的载体接触在高于3.8至等于或低于5.0范围内的pH下执行。
28.根据权利要求26所述的方法，其中调整所述未结合级分和使所述未结合级分与所述包含固定带负电基团的载体接触在等于或高于4.0至等于或低于5.0范围内的pH下执行。
29.根据权利要求26所述的方法，其中调整所述未结合级分和使所述未结合级分与所述包含固定带负电基团的载体接触在高于3.8至等于或低于4.7范围内的pH下执行。
30.根据权利要求26所述的方法，其中调整所述未结合级分和使所述未结合级分与所述包含固定带负电基团的载体接触在约4.0,4.1,4.2,4.3,4.4,4.5,4.6或4.7的pH下执行。
31.根据权利要求26所述的方法，其中调整所述未结合级分和使所述未结合级分与所述包含固定带负电基团的载体接触在高于3.8至等于或低于4.3范围内的pH下执行。
32.根据权利要求26所述的方法，其中调整所述未结合级分和使所述未结合级分与所述包含固定带负电基团的载体接触在等于或高于4.0至等于或低于4.3范围内的pH下执行。
33.根据权利要求26所述的方法，其中调整所述未结合级分和使所述未结合级分与所述包含固定带负电基团的载体接触在等于或高于4.1至等于或低于4.3范围内的pH下执行。
34.根据权利要求21或22所述的方法，其中使所述溶液与所述包含带正电基团的载体接触在处于l_2ml/分钟/cm2范围内的线速度下执行，并且其中所述含免疫球蛋白溶液具有在2-22 °C范围内的温度。
35.根据权利要求1所述的方法，还包括以下步骤:在与所述包含固定带负电基团的载体接触前，使所述溶液与包含三维交联疏水性丙烯酸类聚合物的色谱材料接触；以及收集未结合级分III。
36.根据权利要求21或22所述的方法，还包括以下步骤:使所述未结合级分、未结合级分I或未结合级分II与包含三维交联疏水性丙烯酸类聚合物的色谱材料接触；以及收集未结合级分III。
37.根据权利要求21或22所述的方法，其中所述包含固定带正电基团的载体是弱阴离子交换剂或强阴离子交换剂。
38.一种用于制备免疫球蛋白组合物的方法，包括以下步骤:使含免疫球蛋白溶液经历至少两个负相色谱法步骤:在7-8.2范围内的pH下的阴离子交换剂色谱法；和在高于3.8至等于或低于5.3范围内的pH下的阳离子交换剂色谱法。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述阳离子交换剂色谱法执行两次。
40.根据权利要求38或39所述的方法，其中所述阳离子交换剂色谱法在高于3.8至等于或低于5.0范围内的pH下执行。
41.根据权利要求38或39所述的方法，其中所述阳离子交换剂色谱法在等于或高于4.0至等于或低于5.0范围内的pH下执行。
42.根据权利要求38或39所述的方法，其中所述阳离子交换剂色谱法在高于3.8至等于或低于4.7范围内的pH下执行。
43.根据权利要求38或39所述的方法，其中所述阳离子交换剂色谱法在约4.0,4.1、4.2,4.3,4.4,4.5,4.6 或 4.7 的 pH 下执行。
44.根据权利要求38或39所述的方法，其中所述阳离子交换剂色谱法在高于3.8至等于或低于4.3范围内的pH下执行。`
45.根据权利要求38或39所述的方法，其中所述阳离子交换剂色谱法在等于或高于4.0至等于或低于4.3范围内的pH下执行。
46.根据权利要求38或39所述的方法，其中所述阳离子交换剂色谱法在等于或高于4.1至等于或低于4.3范围内的pH下执行。
47.根据权利要求38-46中任一项所述的方法，还包括使用包含三维交联疏水性丙烯酸类聚合物的色谱材料的负相色谱法。
48.根据权利要求38-47中任一项所述的方法，其中所述阳离子交换剂为膜的形式。
49.根据权利要求38-48中任一项所述的方法，其中所述阳离子交换剂包含磺酸基官能团。
50.—种衍生自血液或血液级分的免疫球蛋白组合物，包含4%-10%的蛋白质且可根据权利要求38-49中任一项所述的方法获得。
51.一种容器，其容纳根据权利要求50所述的免疫球蛋白组合物。
52.一种用于治疗患有免疫缺陷、炎性疾病、自身免疫疾病或急性感染的受试者的方法，包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求50所述的免疫球蛋白组合物。
53.根据权利要求50所述的免疫球蛋白组合物，其用于在免疫缺陷、炎性疾病、自身免疫疾病或急性感染中使用。
【文档编号】C07K16/06GK103534264SQ201280023471
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2012年5月14日 优先权日:2011年5月16日
【发明者】R.明茨, O.贝亚伊, I.努尔, L.巴尔, R.梅德勒 申请人:奥姆里克斯生物药品有限公司