结合VEGF和Ang2的双特异性结合分子的制作方法
【专利摘要】本发明涉及结合VEGF和Ang2的双特异性结合分子，其优选为免疫球蛋白单一可变域样VHH和域抗体的形式，公开了包含它们的药物组合物，及其在治疗与VEGF和/或Ang2介导的血管生成作用相关的疾病中的用途。而且，还描述了编码双特异性结合分子的核酸、宿主细胞及其制备方法。
【专利说明】结合VEGF和Ang2的双特异性结合分子
发明领域
[0001]本发明涉及人的治疗，特别是癌症治疗的领域以及适用于该治疗中的药物及组合物。
[0002]发明背景
[0003]当肿瘤达到约Imm3的临界大小时，它们变得依赖于血管生成以维持氧气和营养的血液供应以便进一步生长。抗血管生成治疗已成为若干类型肿瘤的重要治疗选择。这些治疗集中于通过中和VEGF(Avastin,安维汀)或其受体(索坦(Sutent)和索拉非尼(Sorafinib))阻断 VEGF 通路(Ferrara 等人，Nat Rev Drug Discov.2004 年 5 月；3(5):391-400)。近来在小鼠中的研究已显示，促血管生成素2 (Ang2，Tie2受体的一种配体)通过使其他的血管生成因子(例如VEGF)发挥功能来控制血管重构。Ang2主要由内皮细胞表达，由缺氧和其他血管生成因子强烈诱导，并已证明其调节肿瘤血管的可塑性，使血管应答VEGF 和 FGF2 (Augustin 等人，Nat Rev Mol Cell Biol.2009 年 3 月；10(3):165-77.)。与该作用相一致，Ang2的缺失或抑制导致血管生成减少(Gale等人，Dev Cell.2002年9月；3(3):302-4.) (Falc0n 等人，Am J Pathol.2009 年 11 月；175(5):2159-70.)。已经报道结肠直肠癌(CRC)、非小细胞肺癌(NSCLC)和黑素瘤患者具有升高的Ang2血清浓度(Goede等人，Br J Cancer.2010 年 10 月 26 日；103 (9):1407-14) (Park 等人，Chest.2007 年 7 月；132(1):200-6.) (He lfrich 等人，Clin Cancer Res.2009 年 2 月 15 日；15(4):1384-92.)。在CRC癌症中，Ang2血清水平与抗VEGF治疗的治疗应答相关。
[0004]Ang-Tie系统由2个受体(Tiel和Tie2)和3个配体(Angl> Ang2和Ang4)组成(Augustin 等人，Nat Rev Mol Cell Biol.2009 年 3 月；10(3):165-77.)。Tie2、Angl 和Ang2是这个家族中研究最好的成员，Tiel是一个孤儿受体而Ang4对血管重构的作用仍然需要加以界定。Ang2和Angl对于Tie2的结合和活化介导相反的功能。Ang2介导的Tie2活化导致内皮细胞活化、周细胞解离、血管渗漏和诱导血管萌芽。与Ang2相反，Angl信号转导通过募集周细胞维持血管完整，从而保持血管内皮细胞静止。
[0005]血管生成素2 (Ang2)是Tie2受体酪氨酸激酶的一种分泌的、66kDa的配体(Augustin 等人，Nat Rev Mol Cell Biol.2009 年 3 月；10(3):165-77.)。Ang2 由 N-末端卷曲螺旋域和C-末端的纤维蛋白原样域组成，后者是与Tie2相互作用需要的。Ang2主要由内皮细胞表达并由缺氧和其他血管生成因子(包括VEGF)强烈诱导。Tie2在内皮细胞、造血干细胞和肿瘤细胞上发现。已经证明Ang2-Tie2调节肿瘤血管的可塑性，使血管应答VEGF 和 FGF2。
[0006]在体外已经表明Ang2在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中充当温和的有丝分裂原、趋化因子和管形成诱导物。Ang2诱导成纤维细胞中异位表达的Tie2的酪氨酸磷酸化，并促进下游信号事件，例如HUVEC中ERK-MAPK、AKT和FAK的磷酸化。已经描述了 Ang2在Angl诱导的内皮细胞应答中的拮抗作用。
[0007]已经表明Ang2缺乏导致了小鼠中严重的淋巴模式(lymphatic patterning)缺陷。虽然Ang2损耗不是胚胎血管发育所必需的，但是Ang2缺陷小鼠在视网膜和肾脏中具有持久性血管缺陷。结合在血管生成部位(例如卵巢)的Ang2表达的动态模式，这些结果表明Ang2通过使其他的血管生成因子(例如VEGF)发挥功能而控制血管重构。
[0008]Ang2_Tie2系统在血管生成开关和肿瘤血管生成后期阶段中发挥至关重要的作用。在肿瘤相关的内皮中Ang2的表达强烈上调。当肿瘤植入Ang2缺陷小鼠，特别是在肿瘤生长的早期阶段植入时，已经观察到肿瘤生长降低。使用Ang2单克隆抗体治疗性阻断Ang2已经在各种肿瘤异种移植模型中显示出广泛的疗效。已经描述了 Ang2单克隆抗体与VEGFR2抑制剂(单克隆抗体及小分子量抑制剂)的累加效应。
[0009]如US2008/0014196和W02008/101985中所述，血管生成牵涉于包括实体瘤和转移瘤，以及眼部疾病的许多病症的发病机制中。一种最重要的促血管生成因子是血管内皮生长因子(VEGF)，也称为VEGF-A或血管通透因子(VPF)。VEGF属于包括以下基因的基因家族:胎盘生长因子(PlGF)、VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E 和 VEGF-F。单个人 VEGF 基因的 mRNA 选择性剪接产生至少 6 种同工型(VEGF121、VEGF145, VEGF165、VEGF183、VEGF189和VEGF206)，其中VEGF165是丰度最高的同工型。
[0010]已经确定两种VEGF酪氨酸激酶受体(VEGFR)与VEGF相互作用，即VEGFR-1 (也称为FLT-1)和VEGFR-2 (也称为KDR或者FLK-1)。VEGFR-1具有最高的VEGF亲和力，而VEGFR-2 则具有稍低的 VEGF 亲和力。Ferrara (Endocrine Rev.2004,25:581-611)提供了VEGF的详细说明，在Hoeben等人，Pharmacol.Rev.2004,56:549-580中可以发现VEGF与其受体的相互作用以及其在正常和病理过程中的功能。
[0011]已经报道VEGF是正常及异常血管生成的一个关键的调节子(Ferrara和Davis-Smyth,Endocrine Rev.1997,18:4-25 ；Ferrara J.MoL Med.1999,77:527-543)。与促进血管形成过程的其他生长因子相比，VEGF的独特之处在于对血管系统内的内皮细胞的高特异性。
[0012]大多数人类肿瘤过表达VEGF mRNA。在肿瘤生长的情况下，血管生成对于自增生转变为瘤形成及对于为肿瘤生长及转移提供营养似乎是至关重要的(Folkman等人，1989，Nature339-58)，这使肿瘤细胞相比于正常细胞获得生长优势。因此，抗血管生成治疗已成为若干类型肿瘤的重要治疗选择。这些治疗集中于阻断VEGF通路(Ferrara等人，Nat RevDrug Discov.2004 年 5 月；3(5):391-400)。
[0013]VEGF也涉及眼部疾病。眼液中VEGF浓度与糖尿病及其他缺血相关的视网膜病变患者中存在活跃的血管增生高度相关。此外，最近的研究已经证明在患者的脉络膜新生血管膜中VEGF的定位受年龄相关性黄斑变性(AMD)的影响。在各种炎性病症中也观察到VEGF的上调。VEGF牵涉于类风湿性关节炎(一种血管生成在其中发挥重要作用的炎性疾病)的发病机制中。
[0014]VEGF及其在血管生成和不同过程中作用的阐明为治疗性干预提供了一个潜在的新靶点。阻断或阻碍VEGF受体酪氨酸激酶活化的小分子抑制了 VEGF的功能，从而干扰VEGF受体信号转导通路(Schlaeppi 和 Wood, 1999, Cancer Metastasis Rev.,18:473-481)。含有细菌或植物毒素的细胞毒性缀合物可以抑制VEGF对肿瘤血管生成的刺激作用。例如VEGF-DT385毒素缀合物(白喉毒素域融合或化学缀合到VEGF165)可有效地抑制肿瘤的体内生长。抑制肿瘤生长也可以通过由逆转录病毒递送Flk-1突变体或可溶性VEGF受体而实现。[0015]已经开发出来VEGF中和抗体，如A4.6.1和MV833，以阻断VEGF与其受体的结合并已显示出临床前的抗肿瘤活性(Kim等人，Naturel993, 362:841-844 ；Folkman Nat.Med.1995，1:27-31 ；Presta 等人，Cancer Res.1997,57:4593-4599 ；Kanai 等人，Int.J.Cancerl998, 77:933-936 ；Ferrara 和 Alitalo Nat.Med.1999,5:1359-1364 ；320,340。治疗性抗 VEGF 方法试验的综述，参见 Campochiaro 和 Hackett (0ncogene2003, 22:6537-6548)。
[0016]大多数临床经验是应用A4.6.1,也称为贝伐珠单抗(bevacizumab) ( Avastin? ;Genentech, San Francisco, CA)获得的。
[0017]W02008/101985描述了结合VEGF的来自骆驼科动物的免疫球蛋白单一可变域(如本文所定义的VHH或“Naiiobodies?，，)，以及它们在治疗以过度和/或病理性血管生成或新生血管形成为特征的病状及疾病中的用途。
[0018]本发明的一个目标在于提供用于人治疗的新的抗血管生成的结合分子。
[0019]本发明的另一个目标在于提供预防、治疗、减轻和/或诊断这些疾病、病症或症状的方法，其涉及使用和/或给予这些结合分子及含有这些结合分子的组合物。特别地，本发明的一个目标在于提供这样的药理学活性结合分子、组合物和/或方法，其相比于本领域中当前使用的和/或已知的药物、组合物和/或方法可提供优势。这些优势包括改良的治疗性质和/或药理学性质和/或其他有利的性质(例如用于制造目的)，尤其与如上所述的常规抗体或其片段相比。
【发明内容】
[0020]根据第一方面， 本发明提供了双特异性结合分子，优选双特异性免疫球蛋白，优选免疫球蛋白单一可变域样VHH和域抗体，其在单个分子中包含至少一种VEGF结合组分和至少一种Ang2结合组分。优选地，所述双特异性结合分子还包含血清白蛋白结合组分。
[0021]更具体地，本发明的双特异性结合分子基本上包含(i)特异性结合至少一个Ang2表位的Ang2结合组分，及(ii)至少特异性结合VEGF表位的VEGF结合组分，其中所述组分彼此连接的方式使得它们同时结合Ang2和VEGF，或者它们每次结合Ang2或VEGF两者之
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[0022]根据本发明优选的方面，所述两种组分包含一个或多个免疫球蛋白单一可变域，所述可变域可彼此独立地为VHH或域抗体，和/或任何其它种类的免疫球蛋白单一可变域，例如如本文所定义的VL域，前提是这些免疫球蛋白单一可变域中的每一个分别结合抗原，即 Ang2 或 VEGF。
[0023]根据一项优选实施方案，免疫球蛋白单一可变域是相同类型的，特别地，所有免疫球蛋白单一可变域是VHH或域抗体。
[0024]根据一个特别优选的实施方案，所有免疫球蛋白单一可变域是VHH，优选人源化的(或如本文所定义的“序列最优化”的)VHH。因此，本发明涉及双特异性结合分子，其包含一个(任选地人源化的或序列最优化的)抗Ang2VHH和(任选地人源化的或序列最优化的)抗 VEGFVHH。
[0025]然而，本领域技术人员将清楚本文的教导可以类似地应用于包含其他抗Ang2或抗VEGF的免疫球蛋白单一可变域(例如域抗体)的双特异性结合分子。[0026]在另一方面中，本发明涉及编码本发明的双特异性结合分子的核酸以及含有所述核酸的宿主细胞。
[0027]本发明还涉及含有或包含至少一种本发明的双特异性结合分子的产品或组合物以及任选地含有或包含一种或多种其它组分的这样的组合物。
[0028]本发明还涉及制备或产生本文所述的双特异性结合分子、核酸、宿主细胞、产品及组合物的方法。
[0029]本发明还涉及本文所述的双特异性结合分子、核酸、宿主细胞、产品及组合物的应用及用途，以及预防和/或治疗可以通过抑制Ang2调节的疾病及病症的方法。
[0030]已经发现，与对Angl或Ang4的结合效能相比，根据本发明的双特异性结合分子的Ang2结合组分以高至少5，000倍，优选高10，000倍的效能结合并拮抗Ang2。这将在很大程度上避免Angl介导的信号转导活化的阻断，所述Angl介导的信号转导活化的阻断会抵消预期的抗血管生成作用。
[0031]已进一步发现，与对VEGF-B、VEGF-C, VEGF-D或PlGF的亲和力相比，根据本发明的双特异性结合分子的VEGF结合组分以高至少1，000倍，优选高至少5，000倍，更优选高至少10，000倍的亲和力结合VEGF-Α。由于高度优先地结合VEGF-A，调节淋巴血管生成的VEGFR3信号转导不受干扰。
[0032]在一项优选实施方案中，本发明的双特异性结合分子以连接的VHH域提供。这样的分子显著地小于常规抗体，因此与常规抗体相比，具有更深地穿透肿瘤的能力。通过本文公开的特异性序列在去除糖基化位点后，进一步突出了该益处。
[0033]另外，由于双特异性的特性(VEGF和Ang2结合组分存在于一个分子中)，两种功能性(functionality)的肿瘤穿透`必然相等，这将确保在穿透肿瘤的整个深度内提供VEGF和Ang2联合拮抗的有益效果。相比于针对这些靶点的单独拮抗剂的联合，这是一个优势，因为单独拮抗剂的穿透深度总在一定程度上有所不同。
[0034]本发明优选的双特异性结合分子的另一优势是由于血清白蛋白结合组分(例如本文所述的血清白蛋白结合分子)而增加血清半衰期等。
[0035]本发明的这些及其他方面、实施方案、优势及应用将由下文进一步描述而变得清
λ.Μ
/E.ο
[0036]定义
[0037]除非另有指示或定义，否则所有所用术语均具有本领域中的通常含义，该含义将为本领域技术人员所了解。参考例如标准手册，如Sambrook等人,“Molecular Cloning:ALaboratory Manual”(第2版)，第 1-3卷,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)；Lewin, “Genes IV”，Oxford University Press, New York, (1990)；及 Roitt 等人，“Immunology”(第 2 版)，Gower Medical Publishing,London,New York(1989),以及本文中引用的一般现有技术；此外，除非另有说明，否则未具体详述的所有方法、步骤、技术及操作均可以且已经以本身已知的方式进行，该方式将为本领域技术人员所了解。还参考例如标准手册、上述一般现有技术及其中引用的其他参考文献。
[0038]术语“双特异性结合分子”是指包含至少一个Ang2结合分子(或“Ang2结合组分”)和至少一个VEGF结合分子(或“VEGF结合组分”)的分子。双特异性结合分子可含有多于一个Ang2结合分子和/或多于一个VEGF结合分子，即双特异性结合分子在结合Ang2或VEGF的分子部分，即在其“Ang2结合组分”(或抗Ang2组分)或“VEGF结合组分”(或抗VEGF组分)中，分别含有一个双互补位(定义见下文)Ang2结合分子和/或一个双互补位VEGF结合分子。然而在本文中术语“双特异性”并不解释为从双特异性结合分子中排除对VEGF和Ang2以外的分子具有结合特异性的其他结合组分。这样的其他结合组分的非限制性实例是结合血清白蛋白的结合组分。
[0039]除非另有说明，否则术语“免疫球蛋白”及“免疫球蛋白序列”在本文中无论是指重链抗体还是指常规4链抗体，均用作一般术语以包括全长抗体、其单个的链以及其所有部分、域或片段(包括但不限于抗原结合域或片段，分别例如VHH域或VH/VL域)。此外，本文所用的术语“序列”(例如在术语“免疫球蛋白序列”、“抗体序列”、“(单一)可变域序列”、“VHH序列”或“蛋白质序列”等中的)一般应理解为既包括相关氨基酸序列，又包括编码所述序列的核酸序列或核苷酸序列，除非上下文需要更限定的解释。
[0040]如本文所用的术语(多肽或蛋白的)“域”是指折叠蛋白结构，其能够独立于蛋白的其余部分维持其三级结构。一般而言，域负责蛋白的单个的功能性质，且在许多情况下可添加、移除或转移至其他蛋白而不损失蛋白的其余部分和/或域的功能。
[0041]如本文所用的术语“免疫球蛋白域”是指抗体链(例如常规4链抗体的链或重链抗体的链)的球形区域，或是指基本上由这类球形区域组成的多肽。免疫球蛋白域的特征在于其维持抗体分子的免疫球蛋白折叠特征，其由排列在两个β折叠中任选由保守二硫键稳定的约7条反平行β链的2层夹层(sandwich)组成。免疫球蛋白域包含可变域，即一个或多个免疫球蛋白可变域。
[0042]如本文所用的术语“免疫球蛋白可变域”是指基本上由本领域及下文中分别称为“框架区I”或“FR1”、“框架区2”或“FR2”、“框架区3”或“FR3”、及“框架区4”或“FR4”的四个“框架区”组成的免疫球蛋白域；所述框架区被本领域及下文中分别称为“互补决定区I”或“⑶R1”、“互补决定区2”或“⑶R2”、及“互补决定区3”或“⑶R3”的三个“互补决定区”或“CDR”间隔开来。因此，免疫球蛋白可变域的一般结构或序列可如下表示为:FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。免疫球蛋白可变域因具有抗原结合位点而赋予抗体对抗原的特异性。在本发明的内容中，优选免疫球蛋白单一可变域样VHH和域抗体。
[0043]如本文所用的术语“免疫球蛋白单一可变域”是指能够在不与其他可变的免疫球蛋白域配对的情况下特异性结合抗原表位的免疫球蛋白可变域。本发明含义中的免疫球蛋白单一可变域的一个实例为“域抗体”，例如免疫球蛋白单一可变域VH及VL (VH域及VL域)。免疫球蛋白单一可变域的另一实例为如下文定义的来自骆驼科的“VHH域”(或简称为“丽，，)。
[0044]鉴于以上定义，常规4链抗体(例如本领域中已知的IgG、IgM、IgA、IgD或IgE分子)或源自所述常规4链抗体的Fab片段、F(ab' ) 2片段、Fv片段(例如二硫键连接的Fv或scFv片段)或双特异抗体(均为本领域中已知)的抗原结合域，通常不视为免疫球蛋白单一可变域，这是因为在该情况下，通常并`非通过一个(单一)免疫球蛋白域与抗原的各别表位发生结合，而是通过共同结合各别抗原表位的一对(缔合)免疫球蛋白域(例如轻链及重链可变域),即通过免疫球蛋白域的VH-VL对进行结合。
[0045]“VHH域”，也称为VHH、VHH域、VHH抗体片段和VHH抗体，最初被描述为“重链抗体”(即“缺乏轻链的抗体”)的抗原结合免疫球蛋白(可变)域(Hamers-CastermanC， Atarhouch T， Muyldermans S， Robinson G， Hamers C， Songa EB, Bendahman N，Hamers R.,Naturally occurring antibodies devoid of light chains，，；Nature363，446-448 (1993))。已选择术语“VHH域”将这些可变域与存在于常规4链抗体中的重链可变域(其在本文中称为“VH域”或“VH域”)以及存在于常规4链抗体中的轻链可变域(其在本文中称为“'域”或“VL域”)进行区分。VHH域可在无其他抗原结合域的情况下特异性结合表位(此与常规4链抗体中的VH或VL域相反，在该情况下表位由VL域与VH域一起识别)。VHH域为由单一免疫球蛋白域形成的小型稳定及高效的抗原识别单元。
[0046]在本发明的上下文中，术语VHH域、VHH、VhH域、VHH抗体片段、VHH抗体以及“Nanobody?”及“Nanobody?域，，(“Nanobody”为比利时根特的 Ablynx N.V.公司的商标)可互换使用，且表示免疫球蛋白单一可变域(具有FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4结构，并且特异性结合表位而无需存在另一免疫球蛋白可变域)，且其由例如W02009/109635图1中定义的所谓“印记残基(hallmark residue) ”与VH域区分。
[0047]如例如Riechmann 及 Muyldermans, J.1mmunol.Methods231, 25-38 (1999)的图 2中所示，适用于骆驼科的VHH域，根据Kabat等人给出的VH域的一般编号法(“Sequenceof proteins of immunological interest”,US Public Health Services,NIH Bethesda,MD，公开案第91号)来编号免疫球蛋白单一可变域(如VHH)的氨基酸残基。根据该编号法，
[0048]-FRl包含在位置1-30处的氨基酸残基，
[0049]-⑶Rl包含在位置31-35处的氨基酸残基，
[0050]-FR2包含在位置36-49处的氨基酸，
[0051 ]-⑶R2包含在位置50-65处的氨基酸残基，
[0052]-FR3包含在位置66-94处的氨基酸残基，
[0053]-⑶R3包含在位置95-102处的氨基酸残基，且
[0054]-FR4包含在位置103-113处的氨基酸残基。
[0055]然而应注意，如本领域中对于Vh域及VHH域所公知的，各CDR中的氨基酸残基的总数可能不同，且可能不对应于由Kabat编号法所指示的氨基酸残基的总数(即根据Kabat编号法的一个或多个位置可能在实际序列中未被占据，或实际序列可能含有多于Kabat编号法所允许数目的氨基酸残基)。这意味着一般而言，根据Kabat的编号可能对应或可能不对应于实际序列中氨基酸残基的实际编号。
[0056]对Vh域的氨基酸残基进行编号且还可以类似方式应用于VHH域的替代方法在本领域中是已知的。然而，除非另有说明，否则在本说明书、权利要求书及附图中，将遵循如上所述根据Kabat且应用于VHH域的编号法。
[0057]VHH域中的氨基酸残基的总数将通常在110-120范围内，常常介于112与115之间。然而应注意更小及更长序列也可适于本文所述的目的。
[0058]免疫球蛋白单一可变域，例如根据本发明优选实施方案的VHH及域抗体具有大量使其高度有利于在治疗中用作功能性抗原结合分子的独特结构特征及功能性质。特别地，且不对其进行限制，VHH域(其本质上被“设计”为在不与轻链可变域配对情况下功能性地结合抗原)可充当单一、相对较小、功能性的抗原结合结构单元。
[0059]由于其独特性质，如本文定义的免疫球蛋白单一可变域，例如VHH或VH (或VL)，无论是单独存在还是作为更大多肽(例如双互补位分子)的一部分，均提供许多显著优点:
[0060].仅需要单一域以高亲和力及高选择性地结合抗原，因而无需存在两个各别的域，也无需确保这两个域以正确的空间构象及构型存在(即通过使用特别设计的接头，如scFv的接头)；
[0061].免疫球蛋白单一可变域可从单一核酸分子表达且不需要任何翻译后修饰(如糖基化)；
[0062].免疫球蛋白单一可变域可轻易经工程改造为多价及多特异性形式(如本文进一步论述)；
[0063].免疫球蛋白单一可变域对其靶点具有高特异性及亲和力，具有低遗传毒性，可通过输注或注射以外的替代途径给予；
[0064].免疫球蛋白单一可变域对热、pH、蛋白酶及其他变性剂或变性条件高度稳定，因此可在不使用冷冻设备情况下制备、储存或运输；
[0065].免疫球蛋白单一可变域无论是以小规模还是以生产规模制备均容易且相对廉价。例如，免疫球蛋白单一可变域可使用微生物发酵(例如下文进一步描述的)产生，且不需要像常规抗体那样使用哺乳动物表达系统；
[0066].相比于常规4链抗体及其抗原结合片段，免疫球蛋白单一可变域是相对较小的(约15kDa，或为常规IgG的1/10)，因此显示(更)高的组织(包括但不限于实体瘤及其他致密组织)穿透性，且可以以高于这些常规4链抗体及其抗原结合片段的剂量给予；
[0067]*VHH具有特定的所谓“空腔结合性质”(cavity-binding properties)(尤其是由于相比于4链抗体的VH域，其⑶R3环更为延伸)，因此其也能够进入常规4链抗体及其抗原结合片段不能进入的靶点及表位`；
[0068]-VHH具有高度可溶性和极其稳定且具有不趋于聚集的特别优势(如同由Ward等人，Nature341:544-546(1989)所述的小鼠源抗原结合域)。
[0069]本发明的免疫球蛋白单一可变域，其获得的具体生物来源或具体制备方法不受限制。例如，获得VHH可包括以下步骤:
[0070](I)分离天然存在的重链抗体的VHH域；或筛选包含重链抗体或VHH的文库且从中分离VHH ；
[0071](2)表达编码具有天然存在序列的VHH的核酸分子；
[0072](3)任选在亲和力成熟之后使具有天然存在序列的VHH “人源化”(如本文所述的)，或表达编码这类人源化VHH的核酸；
[0073](4)使动物物种(特别是哺乳动物物种，例如人)天然存在抗体的免疫球蛋白单一可变重域“骆驼化”(如下所述)，或表达编码这类骆驼化域的核酸分子；
[0074](5)使VH “骆驼化”，或表达编码这类骆驼化VH的核酸分子；
[0075](6)使用以合成方式或半合成方式制备蛋白、多肽或其他氨基酸序列的技术；
[0076](7)使用核酸合成技术制备编码VHH域的核酸分子，随后表达由此获得的核酸；
[0077](8)使重链抗体或VHH经受亲和力成熟、诱变(例如随机诱变或定点诱变)和/或任何其他技术以增加VHH的亲和力和/或特异性；和/或
[0078](9)组合或选择上述步骤。
[0079]适于进行上述步骤的方法及技术在本领域中是已知的且将为本领域技术人员所了解。举例而言，获得结合特异性抗原或表位的VHH域的方法已经在W02006/040153和W02006/122786 中描述。
[0080]根据具体实施方案，本发明的或存在于本发明的多肽中的免疫球蛋白单一可变域为氨基酸序列基本上对应于天然存在VHH域的氨基酸序列的VHH域，但其已经“人源化”或“序列最优化”(任选在亲和力成熟之后)，即通过以人的常规4链抗体可变重域中相应位置处存在的一个或多个氨基酸残基置换该天然存在VHH序列的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基。这可使用本领域中已知的方法进行，所述方法可由本领域技术人员以常规方式使用。
[0081]人源化的VHH域可含有一个或多个完全人框架区序列，且在一个进一步更具体的实施方案中，可含有源自人生殖系Vh3序列DP-29、DP-47、DP-51或其部分，或与其高度同源，任选与JH序列(例如JH5)合并的人框架区序列。因此，人源化方案可包含单独或组合使用生殖系VH基因(例如DP47、DP29及DP51)的相应框架1、2和3 (FRl、FR2和FR3)残基来置换任何VHH残基。本发明的免疫球蛋白单一可变域的适合的框架区(FR)可选自那些例如W02006/004678中公开的FR，且具体地包括所谓“KERE”及“GLEW”类型。实例为在约位置44-47处具有氨基酸序列G-L-E-W的免疫球蛋白单一可变域及其分别的人源化对应物。人源化VHH域可包含一个或多个完全的人框架区序列。
[0082]例如，属于103P，R, S组和/或GLEW组(如下文所定义)的VHH的人源化人源化置换是将108Q置换成108L。使免疫球蛋白单一可变域人源化的方法在本领域中是已知的。
[0083]在治疗应用方面具有改良的性质(例如增强的亲和力或降低的免疫原性)的结合免疫球蛋白单一可变域，可通过如下本领域中已知的技术而从各别的结合分子获得:亲和力成熟(例如从合成、随机或天然存在的免疫球蛋白序列起始)、CDR移植、人源化、合并源自不同免疫球蛋白序列的片段、使用重叠引物的PCR组装、及本领域技术人员公知的用于工程改造免疫球蛋白序列的类似技术；或任何上述技术的任何适合组合，也称为如本文所述的术语“序列最优化”。例`如参考标准手册以及其他描述及实施例。
[0084]适当时，可通过使另一结合分子亲和力成熟来获得亲和力增加的结合分子，就亲和力成熟分子而言所述另一结合分子表示“亲本”结合分子。
[0085]获得结合特定抗原或表位的VHH的方法，先前已描述于例如W02006/040153及W02006/122786中。如其中所详述的，源自骆驼科的VHH域可通过以人常规4链抗体VH域中相应位置处存在的一个或多个氨基酸残基置换原始VHH序列的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基经“人源化”(本文中也称为“序列最优化”，除人源化外，“序列最优化”可涵盖通过提供VHH改良性质的一个或多个突变对序列进行的其他修饰，例如移除潜在的翻译后修饰位点)。人源化VHH域可含有一个或多个完全人框架区序列，且在一进一步更具体实施方案中，可含有源自DP-29、DP-47、DP-51或其部分，任选与JH序列(例如JH5)合并的人框架区序列。
[0086]域抗体，也称为“Dab” 及 “dAb”(术语“域抗体(Domain Antibodies) ” 及 “dAb”被GlaxoSmithKline公司集团用作商标)，已描述于例如以下文献中:Ward, E.S.,等人:“Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domainssecreted from Escherichia coli，，;Nature341:544-546 (1989) ；Holt, L.J.等人:“Domainantibodies:proteins for therapy”；TRENDS in Biotechnology21(11):484-490(2003)；及 TO2003/002609。
[0087]域抗体基本上对应于非骆驼科哺乳动物的抗体(特别是人4链抗体)的VH或VL域。为了以单一抗原结合域的形式(即在不与VL域或VH域分别配对的情况下)结合表位，需要例如通过使用人单一 VH或VL域序列的文库对这些抗原结合性质进行具体选择。
[0088]域抗体如VHH的分子量为约13kDa至约16kDa，且若源自完全人序列，则不需要进行人源化以供例如人治疗使用。在VHH域的情况下，域抗体在原核表达系统中也很好地得以表达，从而显著降低总制造成本。
[0089]此外，本领域技术人员还将了解，有可能将一个或多个上述⑶R “移植”于其他“支架”(包括但不限于人支架或非免疫球蛋白支架)上。用于这种CDR移植的适合支架及技术在本领域中是已知的。
[0090]可互换使用的术语“表位”及“抗原决定簇”是指大分子(例如多肽)的一部分，其由抗原结合分子(例如常规抗体或本发明的多肽)识别，且更具体地由所述分子的抗原结合位点识别。表位定义免疫球蛋白的最小结合位点，因此表示免疫球蛋白的特异性的靶点。
[0091]可“结合”或“特异性结合”某一表位、抗原或蛋白(或其至少一部分、片段或表位)、对其“具有亲和力”和/或“具有特异性”的多肽(例如免疫球蛋白、抗体、本发明的免疫球蛋白单一可变域、或一般而言抗原结合分子或其片段)是指“对抗”或“针对”该表位、抗原或蛋白，或为对于该表位、抗原或蛋白的“结合”分子。在上下文中，VEGF结合组分也可称为“VEGF中和组分”。
[0092]一般而言，术 语“特异性”是指特定抗原结合分子或抗原结合蛋白(例如本发明的免疫球蛋白单一可变域)分子可结合的不同类型抗原或表位的数目。抗原结合分子的特异性可基于其亲和力和/或亲抗原 性(avidity)来测定。由抗原与抗原结合蛋白的解离平衡常数(KD)所表示的亲和力，是表位与抗原结合蛋白上抗原结合位点之间结合强度的量度:KD值越小，表位与抗原结合分子之间的结合强度越强(或者，亲和力也可表示为亲和力常数(KA)，其为1/KD)。如本领域技术人员将了解(例如基于本文其他公开的内容)，取决于具体感兴趣的抗原，可以以本身已知方式测定亲和力。亲抗原性为抗原结合分子(例如免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单一可变域或含有免疫球蛋白单一可变域的多肽)与相关抗原之间结合强度的量度。亲抗原性与以下两者均有关:表位与其抗原结合分子上的抗原结合位点之间的亲和力，以及存在于抗原结合分子上的相关结合位点的数目。
[0093]抗原结合分子识别表位的部分称为互补位。
[0094]除非另有说明，否则术语“VEGF结合分子”或“Ang2结合分子”包括如本文定义的抗VEGF或抗Ang2抗体、抗VEGF抗体或抗Ang2抗体片段、“抗VEGF抗体样分子”或“抗Ang2抗体样分子”、及与上述任一者的缀合物。抗体包括但不限于单克隆抗体及嵌合单克隆抗体。术语“抗体”涵盖通过于宿主细胞中重组表达产生的完全免疫球蛋白(如单克隆抗体)、以及抗体片段或“抗体样分子”，包括单链抗体及线型抗体，例如描述于W02002/056910中的所谓的“SMIP” ( “小模块免疫药物”)；抗体样分子包括如本文定义的免疫球蛋白单一可变域。抗体样分子的其他实例为免疫球蛋白超家族抗体(IgSF)或CDR移植分子。
[0095]“Ang2结合分子”或“VEGF结合分子”分别是指以下两者:单价靶结合分子(即与各自靶点的一个表位结合的分子)，以及二价或多价结合分子(即结合一个以上表位的结合分子，例如如下文定义的“双互补位”分子)。含有一个以上Ang2(或VEGF)结合免疫球蛋白单一可变域的Ang2(或VEGF)结合分子亦称为“形式化(formatted) ”结合分子,其在靶结合组分内除免疫球蛋白单一可变域外也可包含接头和/或具有效应器功能的部分，例如半衰期延长部分(如白蛋白结合免疫球蛋白单一可变域)、和/或融合配偶体(如血清白蛋白)和/或连接聚合物(如PEG)。
[0096]如本文所用的术语“双互补位Ang2 (或VEGF)结合分子”或“双互补位免疫球蛋白单一可变域”是指包含如本文定义的第一免疫球蛋白单一可变域及第二免疫球蛋白单一可变域的结合分子，其中所述两个分子结合各自抗原的两个非重叠表位。双互补位结合分子由对于表位具有不同特异性的免疫球蛋白单一可变域构成。抗原结合分子(例如抗体或本发明的免疫球蛋白单一可变域)识别表位的部分称为互补位。
[0097]即使是次优选的形式化结合分子，也包含识别相同或重叠表位或其各自抗原的两个相同的免疫球蛋白单一可变域或两个不同的免疫球蛋白单一可变域。在此情况下，就VEGF而言，所述两个免疫球蛋白单一可变域可与形成VEGF 二聚体的两个单体中每一单体的相同或重叠表位结合。
[0098]通常，本发明的结合分子将以如例如于Biacore或Kinexa分析中测量的10E-5至10E-14摩尔/升(M)或10E-14摩尔/升以下、且优选10E-7至10E-14摩尔/升(M)或10E-14摩尔/升以下、更优选10E-8至10E-14摩尔/升、且进一步更优选10E-11至10E-13的解离常数(Kd)结合，和/或以至少10E7ME-1、优选至少10E8ME-1、更优选至少10E9ME-1，例如至少10E11ME-1的缔合常数(Ka)结合。任何大于10E-4M的Kd值一般都视为指示非特异性结合。优选地，本发明的多肽将以小于500nM、优选小于200nM、更优选小于ΙΟηΜ，例如小于500pM的Kd分别结合所要结合的抗原(即VEGF或VEGF)。抗原结合蛋白对抗原或表位的特异性结合可以以本身已知的任何适合方式来测定，包括例如本文所述的分析、斯卡查德分析(Scatchard analysis)和/或竞争性结合分析(例如放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA)及夹心式竞争性分析(sandwich competition assay))及本领域中本身已知的其不同变化形式。
[0099]氨基酸残基将根据如本领域中公知且达成一致的标准三字母或单字母氨基酸码加以指示。在比较两个氨基酸序列时`，术语“氨基酸差异”是指相比于第二序列，在该参考序列某一位置处指定数目氨基酸残基的插入、缺失或置换。在置换的情况下，所述置换将优选为保守氨基酸置换，所述保守氨基酸置换是指氨基酸残基被化学结构类似的另一氨基酸残基置换，且其对多肽的功能、活性或其他生物学性质影响较小或基本上无影响。这些保守氨基酸置换在本领域中是公知的，例如根据W01998/49185，其中保守氨基酸置换优选是以下群组(i)-(v)内的一个氨基酸被同一群组内的另一氨基酸残基所置换:(i)较小脂族非极性或弱极性残基:Ala、Ser、Thr、Pix)及Gly ； (ii)极性带负电残基及其(不带电)酰胺:Asp、AsruGlu及Gln ； (iii)极性带正电残基:His、Arg及Lys ； (iv)较大脂族非极性残基:Met、Leu、lie、Val及Cys ;及(V)芳族残基:Phe、Tyr及Trp0特别优选的保守氨基酸置换如下:Ala被Gly或Ser置换；Arg被Lys置换；Asn被Gln或His置换；Asp被Glu置换；Cys被Ser置换；Gln被Asn置换；Glu被Asp置换；Gly被Ala或Pro置换；His被Asn或Gln置换；Ile被Leu或Val置换；Leu被Ile或Val置换；Lys被Arg、Gln或Glu置换；Met被Leu、Tyr 或 Ile 置换；Phe 被 Met、Leu 或 Tyr 置换；Ser 被 Thr 置换；Thr 被 Ser 置换；Trp被Tyr置换；Tyr被Trp或Phe置换；Val被Ile或Leu置换。[0100]例如相比于其天然生物来源和/或获得该多肽或核酸分子的反应介质或培养基，当多肽或核酸分子已与至少一种在该来源或介质(培养基)中通常与之相关的其他组分分离时，其被视为“(呈)基本上分离(的形式)”(所述其他组分例如另一蛋白/多肽、另一核酸、另一生物组分或大分子或至少一种污染物、杂质或微量组分)。特别地，多肽或核酸分子在其已纯化至少2倍、特别是至少10倍、更特别是至少100倍且多达1000倍或1000倍以上时被视为“基本上被分离”。经适合的技术(例如适合的色谱技术，如聚丙烯酰胺凝胶电泳)确定，“呈基本上被分离的形式”的多肽或核酸分子优选基本上为同质的。
[0101]两个VEGF结合分子序列之间或两个Ang2结合分子序列之间的“序列一致度”指示序列之间相同氨基酸的百分比。其可如W02008/020079第49及50页段落f)中所述加以计算或测定。“序列相似度”指示相同氨基酸或表示保守氨基酸置换的氨基酸的百分比。
[0102]对Vh域的氨基酸残基进行编号并且也可以类似方式应用于VHH域的替代方法在本领域中是已知的。然而，除非另有说明，否则在本说明书、权利要求书及附图中，将遵循如上所述根据Kabat且应用于VHH域的编号法。
[0103]“亲和力成熟”的VEGF结合分子或Ang2结合分子，特别是VHH或域抗体，在一个或多个CDR中具有一个或多个变化，所述变化导致对VEGF或Ang2的亲和力相比于其各自的亲本VEGF结合分子或Ang2结合分子有所增加。本发明亲和力成熟的VEGF结合分子或Ang2结合分子可通过例如由以下所述的本领域中已知的方法来制备:Marks等人，1992, BiotechnologylO:779-783 或 Barbas 等人，1994, Proc.Nat.Acad.Sci, USA91:3809-3813.；Shier 等人，1995，Genel69:147-155 ；Yelton 等人，1995，Immunol.155:1994-2004 Jackson 等人，1995，J.1mmunol.154(7):3310-9 ；及 Hawkins 等人，1992，J.Mo1.Biol.226(3):889896 ;KS Johnson 及 RE Hawkins, “Affinity maturation ofantibodies using phage display，，，Oxford University Pressl996。
[0104]对于本发明，除非另有说明，则“SEQ ID NO:x的氨基酸序列”包括与各自SEQ IDNO:x中所显示的序列100%—致的`氨基酸序列；
[0105]a)与各自SEQ ID NO:x中所示序列具有至少80%氨基酸一致度的氨基酸序列；
[0106]b)与各自SEQ ID NO:x中所示序列具有3个、2个或I个氨基酸差异的氨基酸序列。
[0107]术语“癌症”及“癌性”是指或描述哺乳动物中通常以不受调控的细胞生长/增殖为特征的生理症状。可用本发明的双特异性结合分子治疗的癌症的实例包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤及白血病。US2008/0014196中建议用VEGF拮抗剂治疗的这些癌症的更特定实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝癌(hepatoma)、乳癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾脏癌、肝癌(liver cancer)、如列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、胃癌、黑素瘤、及各种类型的头颈癌。血管生成的调控异常可导致许多可由本发明组合物及方法治疗的病症。这些病症包括非赘生性症状及赘生性症状两者。赘生性病症包括但不限于上述病症。
[0108]非赘生性病症包括但不限于如US2008/0014196中所述用VEGF拮抗剂治疗的不欲或异常的肥大、关节炎、类风湿性关节炎(RA)、牛皮癣、牛皮癣斑块、类肉瘤病(sarcoidosis)、动脉粥样硬化、动脉粥样硬化斑块、糖尿病性及其他增殖性视网膜病(包括早产儿视网膜病、晶状体后纤维组织增生(retrolental fibroplasia)、新生血管性青光眼、年龄相关的黄斑变性、糖尿病性黄斑水肿、角膜新血管生成(cornealneovascularization)、角膜移植新血管生成、角膜移植排斥、视网膜/脉络膜新血管生成、隅角新血管生成(虹膜红变(rubeosis))、眼新血管病(ocular neovascular disease))、血管再狭窄(vascular restenosis)、动静脉畸形(arteriovenous malformations, AVM)、脊膜瘤(meningioma)、血管瘤、血管纤维瘤(angiofibroma)、甲状腺增生(包括格雷夫氏病(Grave' s disease))、角膜及其他组织移植、慢性炎症、肺炎症、急性肺损伤/ARDS、败血症、原发性肺动脉高压(primary pulmonary hypertension)、恶性肺积液(malignantpulmonary effusion)、脑水肿(例如与急性中风/闭锁性头部损伤(closed headinjury)/外伤相关)、滑液炎症、类风湿性关节炎中的血管醫形成(pannus formation inRA)、骨化性肌炎(myositis ossificans)、肥大性骨形成(hypertropic bone formation) >骨关节炎(OA)、难治愈的腹水症、多囊性卵巢疾病(polycystic ovarian disease)、子宫内膜异位症(endometriosis)、第 3 间隔体液疾病(3rd spacing of fluid disease)(胰腺炎、间隔综合征(compartment syndrome)、灼伤、肠病)、子宫纤维瘤、早产、例如IBD(克罗恩氏病(Crohn' s disease)及溃疡性结肠炎)的慢性炎症、肾同种异体移植排斥、炎性肠病、肾病综合征、不欲或异常的组织大量生长(非癌)、血友病性关节(hemophilic joint)、肥厚性瘢痕(hypertrophic scar)、头发生长抑制、奥斯勒-韦伯综合征(Osier-Webersyndrome)、化脓性肉芽肿晶状体后纤维组织增生(pyogenic granuloma retrolentalfibroplasias)、硬皮病(scleroderma)、沙眼、血管黏附(vascular adhesion)、滑膜炎(synovitis)、皮炎、子痫前症(preeclampsia)、腹水症、心包积液(pericardial effusion)(例如与心包炎(pericarditis)相关的心包积液)、及胸膜积液(pleural effusion)。
[0109]发明详述
[0110]在第一方面中，本发明涉及包含至少一个Ang2结合组分和至少一个VEGF结合组分的双特异性结合分子。
[0111]在一项优选实施方案中，本发明涉及包含至少一个VEGF结合组分和至少一个Ang2结合组分的双特异性结合分子，其还包含至少一个其他结合组分，优选血清白蛋白结合组分(血清白蛋白结合分子)。
[0112]在一项优选实施方案中，本发明的结合分子的血清白蛋白结合组分是分离的免疫球蛋白单一可变域或包含一个或多个所述免疫球蛋白单一可变域的多肽，其中所述免疫球蛋白单一可变域由四个框架区和三个分别为⑶R1XDR2及⑶R3的互补决定区组成，且其中所述CDR3具有选自如SEQ ID NO:257、260、263、266、269、272或275所示氨基酸序列的氨
基酸序列。
[0113]更优选地，所述血清白蛋白结合组分的一个或多个免疫球蛋白单一可变域包含:
[0114]a.CDR3，其具有选自 SEQ ID NO:257、260、263、266、269、272 或 275 所示的第一组
氨基酸序列的氨基酸序列；
[0115]b.⑶Rl，其具有选自 SEQ ID NO:255、258、261、264、267、270 或 273 所示的第二组
氨基酸序列的氨基酸序列；
[0116]c.CDR2，其具有选自 SEQ ID NO:256、259、262、265、268、271 或 274 所示的第二组氨基酸序列的氨基酸序列。
[0117]在一项更优选实施方案中，所述血清白蛋白结合组分的一个或多个免疫球蛋白单一可变域为VHH，优选具有选自如SEQ ID NO:98或254所示的氨基酸序列。
[0118]根据一项优选实施方案，所述Ang2结合组分和所述VEGF结合组分分别包含至少一个Ang2结合免疫球蛋白单一可变域和至少一个VEGF结合免疫球蛋白单一可变域。
[0119]在一个优选方面中，所述Ang2结合组分和所述VEGF结合组分各分别包含至少一个VEGF结合免疫球蛋白单一可变域和至少一个Ang2结合免疫球蛋白单一可变域，其中每一个所述免疫球蛋白单一可变域具有四个框架区和三个分别为⑶RU⑶R2及⑶R3的互补决定区。
[0120]因此，包含于本发明的双特异性结合分子中的抗Ang2和/或抗VEGF组分可包含两个或多个分别为抗Ang2或抗VEGF的免疫球蛋白单一可变域，其中所述免疫球蛋白单一可变域针对Ang2 (或VEGF)靶点内的不同表位。因此，双特异性结合分子中的两个免疫球蛋白单一可变域具有不同的抗原特异性，且因此具有不同CDR序列。
[0121]因为两个免疫球蛋白单一可变域包含两个不同互补位，也分别将这样的二价结合分子命名为“双互补位单域抗体构建体”(若免疫球蛋白单一可变域由或基本上由单域抗体组成)，或“双互补位VHH构建体”(若免疫球蛋白单一可变域由或基本上由VHH组成)。
[0122]在本发明的双特异性结合分子中，一个或两个结合分子可以为二价；例如VEGF结合组分可为双互补位而Ang2结合组分可为免疫球蛋白单一可变域，或者VEGF结合组分可为免疫球蛋白单一可变域而Ang2结合组分可为双互补位。
[0123]在本发明的双特异性结合分子中，优选包含二价VEGF结合免疫球蛋白单一可变域的VEGF结合组分，例如双互补位VHH。
[0124]这种VEGF结合免疫球蛋白单可变域可以是两个或多个VEGF-结合VHH，其为
[0125]a.能够以≤60%的抑制率阻断重组人VEGF与重组人VEGFR-2之间相互作用的相同的VHH，或
[0126]b.结合VEGF非重叠表位的不同的VHH，其中至少一个VHH能够以≤60%的抑制率阻断重组人VEGF与重组人VEGFR-2之间相互作用，并且其中至少一个VHH能够以≤60 %的抑制率阻断所述相互作用。
[0127]VEGF结合组分至少包含具有四个框架区和三个分别为⑶R1XDR2及⑶R3的互补决定区的可变域，其中所述⑶R3具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列Ser Arg Ala TyrXaa Ser Xaa Arg Leu Arg Leu Xaa Xaa Thr Tyr Xaa Tyr,其中
[0128]位置5 的 Xaa 为 Gly 或 Ala ；
[0129]位置I 的 Xaa 为 Ser 或 Gly ；
[0130]位置12 的 Xaa 为 Gly，Ala 或 Pro ;
[0131]位置13 的 Xaa 为 Asp 或 Gly ;
[0132]位置16的Xaa为Asp或Glu ;且
[0133]其中所述VEGF结合组分能够以≤60%的抑制率阻断重组人VEGF165与重组人VEGFR-2之间相互作用。
[0134]根据一项优选实施方案，位置5的Xaa为Gly，位置7的Xaa为Ser，位置12的Xaa为Ala,和位置13的Xaa为Asp。[0135]特别地，所述⑶R3具有选自下述的序列:
[0136]SEQ ID NO:2 SRAYGSSRLRLGDTYDY,
[0137]SEQ ID NO:3 SRAYGSSRLRLADTYDY ；
[0138]SEQ ID NO:4 SRAYGSSRLRLADTYEY ；
[0139]SEQ ID NO:5 SRAYGSGRLRLADTYDY ；
[0140]SEQ ID NO:6 SRAYASSRLRLADTYDY ；
[0141]SEQ ID NO:7 SRAYGSSRLRLPDTYDY ；
[0142]SEQ ID NO:8 SRAYGSSRLRLPGTYDY。
[0143]根据某些实施方案，VEGF结合组分包含一个或多个免疫球蛋白单一可变域，每个免疫球蛋白单一可变域包含:
[0144]a.CDR3，其具有选自SEQ ID NO:2_8所示的第一组序列的氨基酸序列；
[0145]b.⑶Rl及⑶R2，其具有如表3所示的包含于选自SEQ ID NO:9_46所示的第二组氨基酸序列的氨基酸序列，其中所述第二组序列包含根据a)所选择的各别CDR3。
[0146]根据一项优选实施方案，免疫球蛋白单一可变域为VHH。
[0147]根据特定的实施方案，所述VHH具有选自如SEQ ID NO:9_46所示序列的氨基酸序列。
[0148]根据另一特定的实施方案，所述VHH具有选自SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18和SEQID NO:25的氨基酸序列。
[0149]本发明也涉及通过使上面定义的VHH亲和力成熟和/或序列最优化而获得的VEGF结合组分，例如涉及通过使具有如SEQ ID NO: 18所示氨基酸序列的VHH序列最优化而获得的VHH。实例为具有选自如SEQ ID NO:47-57所示序列的氨基酸序列的VHH。
[0150]根据某些实施方案，本发明的VEGF结合域可以是形式化的，如本文所定义，如可以是双互补位或包含两个相同的免疫球蛋白单一可变域。这样的VEGF结合组分可以包含两个或多个VHH，其为
[0151 ] a.能够以≤60%的抑制率阻断重组人VEGF与重组人VEGFR-2之间相互作用的相同的VHH，或
[0152]b.结合VEGF非重叠表位的不同的VHH，其中至少一个VHH能够以≤60%的抑制率阻断重组人VEGF与重组人VEGFR-2之间相互作用，并且其中至少一个VHH能够以≤60 %的抑制率阻断所述相互作用。
[0153]以≤60%或<60抑制百分比率阻断所述相互作用，该百分比分别是指通过如实施例中使用的光激化学发光免疫分析(Amplifie`d Luminescent Proximity Homogeneous
Assay (AlphaScreen?))、竞争性ELISA、或基于等离子体共振(SPR)的分析(Biacore?>IiJ
定的抑制率。
[0154]在下文中，根据a)的VHH的能力也称为“受体阻断”，而根据b)的VHH的能力也称为“非受体阻断”。
[0155]优选地，所述受体阻断VHH具有> 80%的抑制率，更优选抑制率> 90%，最优选地VHH为完全受体阻断剂，即具有100%的抑制率。
[0156]VEGF结合组分可包含两个或多个选自具有如SEQ ID NO:9_46所示的氨基酸序列的相同的VHH a)或通过使这样的VHH亲和力成熟和/或序列最优化而获得的VHH。VHH可以选自具有如SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:47-57所示氨基酸序列的VHH。
[0157]根据优选实施方案，形式化的VEGF结合组分包含两个VHH，每个具有如SEQ IDNO: 57所示的氨基酸序列。
[0158]在包含两个不同VHH的形式化的VEGF结合组分中
[0159]a)所述具有≥60抑制百分比率的一个或多个VHH选自
[0160]1.具有选自如SEQ ID NO:9_46所示氨基酸序列的氨基酸序列的VHH，或
[0161]i1.通过使这样的VHH亲和力成熟和/或序列最优化而获得的VHH，并且其中
[0162]b)所述具有< 60抑制百分比率的一个或多个VHH选自
[0163]1.SEQ ID NO:58-124，或
[0164]i1.通过使这样的VHH亲和力成熟和/或序列最优化而获得的VHH。
[0165]根据优选实施方案，两个VHH包含于具有如SEQ ID NO: 128-168所示氨基酸序列中，其由表15所示的连接序列分隔开来。
[0166]在优选的VEGF结合组分中，VHH a) 1.具有如SEQ ID NO: 18所示的氨基酸序列，且VHH b)1.具有如SEQ ID NO:64所示的氨基酸序列。
[0167]在其他优选的VEGF结合组分中，根据a) i1.的VHH选自具有如SEQ ID NO:47_57所示的氨基酸序列的VHH，且根据b)i1.的VHH选自具有如SEQ ID NO: 125-127所示的氨基酸序列的VHH。
[0168]包含两个VHH的双互补位VEGF结合组分是特别优选的，所述两个VHH中一个具有如SEQ ID NO:57所不的氣基酸序列和 Iv具有如SEQ ID NO: 127所不的氣基酸序列。
[0169]Ang2结合组分至少包含具有四个框架区和三个分别为⑶R1XDR2及⑶R3的互补决定区的可变域，其中所述CDR3具有选自如SEQ ID NO:226、229、232、235、238、241、244、247、250或253所示氨基酸序列的氨基酸序列。
[0170]在第二方面中，该Ang2结合组分是分离的免疫球蛋白单一可变域或包含一个或多个所述免疫球蛋白单一可变域的多肽，其中所述免疫球蛋白单一可变域由四个框架区和三个分别为⑶R1、⑶R2及⑶R3的互补决定区组成，且其中所述⑶R3具有选自如SEQ IDNO:226、229、232、235、238、241、244、247、250或253所示氨基酸序列的氨基酸序列。
[0171]在另一方面中，该Ang2结合组分的免疫球蛋白单一可变域包含:
[0172]a.CDR3，其具有选自 SEQ ID NO:226、229、232、235、238、241、244、247、250 或253 (也见表49)所示的第一组氨基酸序列的氨基酸序列；
[0173]b.CDR1，其具有如表36-A、38-A、41-A或45-A所示的作为部分序列包含于选自SEQID NO:224、227、230、233、236、239、242、245、248 或 251 (也见表 49)所示的第二组氨基酸序列的序列中的氨基酸序列；
[0174]c.CDR2，其具有如表36-A、38-A、41-A或45-A所示的作为部分序列包含于选自SEQID NO:225、228、231、234、237、240、243、246、249 或 252 (也见表 49)所示的第二组氨基酸序列的序列中的氨基酸序列。
[0175]优选地，Ang2结合组分的免疫球蛋白单一可变域为VHH，优选具有选自如SEQ IDNO:214、215、216、217、218、219、220、221、222或223所示氨基酸序列的氨基酸序列。
[0176]在另一优选实施方案中，Ang2结合组分的免疫球蛋白单一可变域是通过使本文所述的免疫球蛋白单一可变域的亲和力成熟或人源化而获得。[0177]类似地，本发明也涉及Ang2结合VHH，其通过使本文所述的Ang2结合组分的VHH的亲和力成熟或人源化而获得。
[0178]因此本发明也涉及具有选自SEQ ID NO:214、215、216、217、218、219、220、221、222
或223所示氨基酸序列的氨基酸序列的Ang2结合VHH。
[0179]举例而言，适于亲和力成熟的亲本Ang2结合组分为上述具有SEQ ID NO:214、215、216、217、218或219所示氨基酸序列的VHH。
[0180]因此，本发明也涉及Ang2结合分子，其通过上述定义的VHH的亲和力成熟和/或序列最优化而获得，例如涉及通过使具有SEQ ID NO:217、218、219、220、221、222或223所示氨基酸序列的VHH的序列最优化而获得的VHH。用于产生后者VHH的“源”氨基酸序列示于SEQ ID N0:214、215或216。这些氨基酸序列也是可应用于本发明的结合分子的适合的Ang2结合组分。
[0181 ] 如本文所述，本发明的结合分子优选包含至少一个血清白蛋白结合组分。因此，特别优选的结合分子具有至少一个VEGF结合组分，至少一个Ang2结合组分和至少一个血清白蛋白结合组分。该三个结合组分的顺序可以是任何可能的顺序，例如表36-B、38-B、40、41-B、42、43、45-B、46-A 或 47-A、或图 20、23、27 或 30 所示的顺序，例如，VEGF、Ang2 或血清白蛋白结合组分可以是N-末端或C-末端。值得注意的是，前述的表及图的图例中提及的 “1D01”(SEQ ID NO:214)、“11B07，，、“00027”(SEQ ID No:216)、“00908”、“7G08”(SEQID No:215)、“00919”、“00921”(SEQ ID NO:220)、“00928”(SEQ ID No:221)、“00932”、“00933”、“00934”、“00935”、“00936”、“00937”、“00938”(SEQ ID No:222)，或“00956”(SEQID No:223)代表Ang2结合组分，而“00038”代表VEGF结合组分且“ALB11”代表血清白蛋白结合组分。它们中任何一个都不解释为特定的序列，而是当用于本发明的结合分子可能的构造(set-up)时通常代表Ang2、VEGF和血清白蛋白结合组分。
[0182]然而，优选血清白蛋白结合组分在VEGF结合组分和Ang2结合组分之间(或反之)，而且特别优选至少一个VEGF结合组分是N-末端，后接至少一个血清白蛋白结合组分，再接至少一个Ang2结合组分在C-末端。已显示这种安排是特别有效的。
[0183]因此，在一个优选的方面，本发明涉及结合分子，其包含至少一个VEGF结合组分，至少一个Ang2结合组分和至少一个具有选自SEQ ID NO:180-213所示的氨基酸序列的氨基酸序列的血清白蛋白结合组分。
[0184]在本文中使用时，“至少一个”结合组分(VEGF、Ang2或血清白蛋白)的情形包括:本发明的结合分子可包含一个、两个、三个、四个或五个VEGF结合组分、Ang2结合组分和/或血清白蛋白结合组分(即实体/单元)，其优选由如本文所述的免疫球蛋白单一可变域所表不。
[0185]在治疗应用方面具有改良的性质(例如增强的亲和力或降低的免疫原性)的VEGF和/或Ang2结合组分，可通过`本领域中已知的技术而从本发明单个的VEGF或Ang2结合组分获得，所述技术例如亲和力成熟(例如从合成、随机或天然存在的免疫球蛋白序列起始)、CDR移植、人源化、合并源自不同免疫球蛋白序列的片段、使用重叠引物的PCR组装、及本领域技术人员公知的用于工程改造免疫球蛋白序列的类似技术；或任何上述技术的任何适合组合，也称为如本文所述的“序列最优化”。例如参考标准手册以及其他描述及实施例。
[0186]适当时,可通过使另一 VEGF或Ang2结合组分亲和力成熟来获得亲和力增加的本发明的VEGF或Ang2结合组分，就亲和力成熟分子而言所述另一结合组分表示“亲本” VEGF结合组分。
[0187]在以EVQ起始的本发明的VEGF或Ang2VHH中，N-末端E可以由D置换(通常是序列最优化的结果)或可以缺失(如在大肠杆菌中VHH的表达)。对于形式化的VEGF结合组分，这通常仅适用于位于N-末端的VHH。
[0188]对于属于103P，R，S组和/或GLEW组(如下文所定义)的VEGF VHH域，一种优选但非限制性的人源化置换是将108Q置换成108L。使免疫球蛋白单一可变域人源化的方法在本领域中是已知的。
[0189]根据另一实施方案，免疫球蛋白单一可变域为如本文所定义的域抗体。
[0190]在另一实施方案中，本发明的代表性种类的VEGF和/或Ang2结合免疫球蛋白单一可变域VEGF具有对应于已经“骆驼化”的天然存在VH域的氨基酸序列的氨基酸序列，即通过以一个或多个存在于重链抗体VHH域中相应位置处的氨基酸残基置换常规4链抗体的天然存在的可变重链氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基。这可以本领域技术人员所了解的本身已知的方式进行，且另外参考W01994/04678。这种骆驼化可优先发生在存在于VH-VL界面的氨基酸位置处及所谓的骆驼科印记残基处(也参见例如W01994/04678)。这些“人源化”及“骆驼化”技术及与此相符的优选框架区序列的详述也可参见W02006/040153的第46页及第98页及W02006/122786的第107页。
[0191]本发明的VEGF结合组分(例如免疫球蛋白单一可变域)对VEGF具有特异性，因为其包含与VEGF分子内的一个或多个表位分别特异性结合的一个或多个免疫球蛋白单一可变域。对于本发明的Ang2结合组分同样如此。
[0192]VEGF结合组分对其抗原`VEGF的特异性结合可以以本身已知的任何适合的方式，包括例如本文所述的分析、斯卡查德分析和/或竞争性结合分析(例如放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA及ELISA)及夹心式竞争分析)及本领域中本身已知的其不同变化形式来测定。当与其抗原结合时，对于Ang2结合组分同样如此。
[0193]关于抗原VEGF，本发明的VEGF结合组分(例如免疫球蛋白单一可变域)在物种方面不受限制。因此，若欲用于人的治疗目的，则本发明的免疫球蛋白单一可变域优选结合至人VEGF。然而，结合至另一哺乳动物物种的VEGF的免疫球蛋白单一可变域也在本发明的范围内。与一个物种的VEGF结合的本发明的免疫球蛋白单一可变域，可与一个或多个与人VEGF相比具有不同序列的其他物种的VEGF发生交叉反应。例如，结合人VEGF的本发明的免疫球蛋白单一可变域可表现出与一个或多个其他灵长类物种的VEGF和/或与用于疾病动物模型(且特别是用于与VEGF介导的血管生成作用相关的疾病及病症的动物模型)中的一个或多个动物物种(例如猴、小鼠、大鼠、兔、猪、犬)(例如本文提及的物种及动物模型)的VEGF的交叉反应性。表现所述交叉反应性的本发明的免疫球蛋白单一可变域，在研究和/或药物开发中是有利的，因为其允许在公认的疾病模型(例如猴(特别是短尾猴或恒河猴)、或小鼠及大鼠)中对本发明的免疫球蛋白单一可变域进行测试。
[0194]优选地，对于与除人以外的物种(欲在治疗性VEGF拮抗剂的开发期间将该物种用作动物模型)的一种或多种VEGF分子的交叉反应性，VEGF结合组分识别目标VEGF区域中与人VEGF具有高一致度的表位。
[0195]本发明的免疫球蛋白单一可变域识别完全或部分位于VEGF区域的表位，该VEGF区域与结合其受体、特别是结合VEGFR2(已经表明其活化是肿瘤新生血管形成的原因)相关。根据优选方面，本发明免疫球蛋白单一可变域至少部分地、优选基本上和最优选完全地阻断VEGF受体活化，特别是VEGFR2活化。
[0196]如上文所述，可以通过如实施例中描述的光激化学发光免疫分析(AmplifiedLuminescent Proximity Homogeneous Assay (A】phaScreen?))、竞争性 ELISA、或基于等离子体共振(SPR)的分析(Biacore?)来测定VEGF结合组分阻断VEGF及其受体(特别是VEGFR2)之间相互作用的能力。
[0197]优选地，本发明的免疫球蛋白单一可变域以小于500nM、优选小于200nM、更优选小于ΙΟηΜ，例如小于500pM (如实施例5.7中所述的通过表面等离子共振分析所测定)的亲和力结合VEGF。对于本发明的结合血管生成素的免疫球蛋白单一可变域同样如此。
[0198]优选地，如竞争性ELISA分析(如实施例5.1.中所述)中所测得，本发明的免疫球蛋白单一可变域具有的IC5tl值在10_6至KTki摩尔/升或KTki摩尔/升以下的范围内，更优选在10_8至10,摩尔/升或10,摩尔/升以下的范围内、且进一步更优选在10_9至10,摩尔/升或10,摩尔/升以下的范围内。
[0199]根据本发明的一非限制性但优选的实施方案，本发明的VEGF结合免疫球蛋白单一可变域以10_5至10_12摩尔/升(M)或10_12摩尔/升以下、且优选10_7至10_12摩尔/升(M)或10_12摩尔/升以下、且更优选10_8至10_12摩尔/升(M)或10_12摩尔/升以下的解离常数(Kd)，和/或以至少IO7M'优选至少IO8M'更优选至少IO9M'例如至少IO1I1的缔合常数(Ka);且特别是以小于500nM、优选小于200nM、更优选小于10nM，例如小于500pM的Kd分别结合VEGF。可测定本发明的免疫球蛋白单一可变域针对VEGF的Kd及Ka值。对于本发明的Ang2结合免疫球蛋 白单一可变域同样如此。
[0200]包含两个或两个以上免疫球蛋白单一可变域的双互补位VEGF结合组分基本上由以下组成或包含以下:(i)特异性结合VEGF的第一表位的第一免疫球蛋白单一可变域及(ii)特异性结合VEGF的第二表位的第二免疫球蛋白单一可变域，其中VEGF的该第一表位及VEGF的该第二表位不为同一表位。换言之，本发明的该多肽包含以下或基本上由以下组成:两个或两个以上针对存在于VEGF中的至少两个非重叠表位的免疫球蛋白单一可变域，其中所述免疫球蛋白单一可变域以能够同时结合VEGF的方式彼此连接。在此意义中，本发明的多肽也可视为“二价”或“多价”免疫球蛋白构建体(construct)，且尤其视为“多价免疫球蛋白单一可变域构建体”，因为该多肽含有至少两个VEGF结合位点。(这样的构建体也称为“形式化的”VEGF结合分子，例如“形式化的”VHH)。对于双互补位Ang2结合组分同样如此,除必要的变通之外。
[0201]本发明的该VEGF或Ang2结合组分分别包括(至少)两个抗VEGF免疫球蛋白单一可变域，其中(该)两个免疫球蛋白单一可变域优选分别针对VEGF分子或血管生成素分子内的非重叠表位。因此，这两个免疫球蛋白单一可变域将具有不同抗原特异性且因此具有不同CDR序列。为此，由于所述两个免疫球蛋白单一可变域包括两个不同互补位，本发明的这些多肽在本文中也分别称为“双互补位多肽”、或“双互补位域抗体构建体”(若免疫球蛋白单一可变域由或基本上由域抗体组成)或“双互补位VHH构建体”(若免疫球蛋白单一可变域由或基本上由VHH组成)。
[0202]如果本发明的多肽是如本文定义的双互补位分子，所述免疫球蛋白单一可变域的组分中的至少一个结合表位从而使得重组人VEGF与重组人VEGFR2之间的相互作用以^ 80%的抑制率被阻断。如本发明的实验中所示，某些形式化的分子包含两个均以> 80%的抑制率阻断VEGFR2受体的VHH。本发明的某些VHH以100抑制百分比率阻断VEGFR2，即它们是完全阻断剂。
[0203]在这两种情况下，其他序列和部分可以存在于本发明的VEGF结合组分中，例如在N-末端、C-末端或位于两个免疫球蛋白单一可变域之间，例如连接序列和提供效应子功能的序列，如本文更详细述及的。
[0204]根据另一个但较不优选的实施方案，本发明的VEGF结合组分可包括多于两个抗VEGF免疫球蛋白单一可变域，即三个、四个或甚至四个以上抗VEGF VHH0在此情况下，至少两个所述抗VEGF免疫球蛋白单一可变域针对VEGF分子内的非重叠表位，其中任何另一免疫球蛋白单一可变域可结合存在于VEGF分子中的这两个非重叠表位的任一个和/或其他表位。
[0205]根据本发明，两个或两个以上免疫球蛋白单一可变域可彼此独立地为VHH或域抗体，和/或如本文定义的任何其它种类的免疫球蛋白单一可变域，例如VL域，条件是这些免疫球蛋白单一可变域将分别结合抗原(即VEGF或血管生成素)。
[0206]本发明主要对于VEGF结合组分提供结合组分的详细描述。然而，本文对于VEGF结合组分所概述的全部特征和选项同样应用于Ang2结合组分，除必要的变通之外。
[0207]根据优选实施方案，存在于双特异性结合分子中的结合分子(Ang2结合组分中的Ang2结合分子或VEGF结合组分中的VEGF结合分子或两个相邻的Ang2结合组分和VEGF结合组分)可彼此直接连接(即不使用接头)或通过接头连接。接头优选为连接肽且将经选择以允许两个不同的结合分子与靶点的每个非重叠表位结合，无论位于一个相同靶点分子中，或位于两个不同分子中。
[0208]对于双互补位结合分子，Ang2结合组分或VEGF结合组分内接头的选择将尤其取决于表位，且具体地取决于免疫球蛋白单一可变域所结合靶点上的表位之间的距离，且本领域技术人员基于本文公开的内容，任选在某些有限程度的常规实验之后将了解此选择。
[0209]两个结合分子(两个VHH或两个域抗体，或一个VHH和一个域抗体)或两个结合组分可分别通过另一 VHH或域抗体而彼此连接(在这些结合分子中，两个或两个以上免疫球蛋白单一可变域可直接或通过适合接头连接至所述另一免疫球蛋白单一可变域)。所述另一 VHH或域抗体可例如为提供增加的半衰期的VHH或域抗体。例如，后者的VHH或域抗体可为能够结合(人)血清蛋白(例如(人)血清白蛋白)或(人)转铁蛋白(transferrin)的VHH或域抗体。
[0210]或者，结合各自靶点的两个或两个以上免疫球蛋白单一可变域可(直接或通过适合接头)串联连接，且所述另一 VHH或域抗体(其可提供增加的半衰期)可直接或通过接头连接至上述两个或两个以上免疫球蛋白序列之一。
[0211]本文中也描述了与本发明的具体多肽相关、并且例如但不限于包含一定氨基酸序列的合适的接头，所述氨基酸序列长度优选为9个或9个以上氨基酸、更优选为至少17个氨基酸，例如约20-40个氨基酸。然而，上限并不关键，该上限是由于与例如这些多肽的生物医药生产的便利性的相关的原因而选择的。
`[0212]连接序列可为天然存在序列或非天然存在序列。若用于治疗目的，则在给予受试者的本发明的双特异性结合分子中所述接头优选为非免疫原性的。
[0213]一组适用的连接序列为如W01996/34103及W01994/04678中所述源自重链抗体铰链区的接头。
[0214]其他实例为聚丙氨酸连接序列，例如Ala-Ala-Ala。
[0215]连接序列的其他优选实例为不同长度的Gly/Ser接头,例如(glyx sery)z接头,包括(gly4ser)3> (gly4ser)4> (gly4ser)> (gly3ser)、gly3和(gly3ser2)3。
[0216]包含于本发明的双特异性结合分子中的接头的一些非限制性实例显示于表15 (SEQ ID N0128-168)中，例如以下接头:
[0217]GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(35GS ；SEQ ID NO:169)；
[0218]GGGGSGGGS(9GS ；SEQ ID NO:170)；
[0219]GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(40GS ；SEQ ID NO:171).[0220]若本发明形式化的双特异性结合分子通过聚合物例如聚乙二醇PEG (聚乙二醇)部分的连接进行修饰，则连接序列优选包括允许连接区域中的此修饰(例如聚乙二醇化)的氨基酸残基，例如半胱氨酸或赖氨酸。
[0221]适用于聚乙二醇化的接头的实例为:
[0222]GGGGCGGGS ( “GS9，C5”，SEQ ID NO:172)；
[0223]GGGGCGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS( “GS25, C5”，SEQ ID NO:173)
[0224]GGGSGGGGSGGGGCGGGGSGGGGSGGG ( “GS27，C14”，SEQ ID NO:174)，
[0225]GGGGSGGGGSGGGGCG`GGGSGGGGSGGGGSGGGGS( “GS35，C15”，SEQ ID NO:175)，和
[0226]GGGGCGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS( “GS35，C5”，SEQ ID NO:176)。
[0227]此外，接头也可为例如于W02004/081026中所示的聚(乙二醇)部分。
[0228]在另一实施方案中，免疫球蛋白单一可变域通过另一部分(任选通过一个或两个接头)，例如另一多肽来彼此连接，该另一多肽在一项优选但非限制性实施方案中可为如上所述的另一免疫球蛋白单一可变域。该部分可为基本上非活性的或可具有例如改良多肽的所需性质的生物效应或可赋予多肽一种或多种其他所需性质。例如但不限于，该部分可改良蛋白或多肽的半衰期，和/或可降低其免疫原性或改良任何其他所需性质。
[0229]根据一项优选实施方案，尤其在欲使用或用作治疗剂时，本发明的双特异性结合分子包括延长本发明的多肽在患者血清或其他体液中的半衰期的部分。术语“半衰期”定义为(经修饰)多肽的血清浓度例如由于天然机制所致的多肽降解和/或清除和/或螯合而在体内降低50%所花费的时间。
[0230]更具体地，该半衰期延长部分可共价连接至或融合至免疫球蛋白单一可变域且可为(但不限于)Fe部分、白蛋白部分、白蛋白片段部分、白蛋白结合部分(例如抗白蛋白免疫球蛋白单一可变域)、转铁蛋白结合部分(例如抗转铁蛋白免疫球蛋白单一可变域)、聚氧化烯(polyoxyalkylene)分子(例如聚乙二醇分子)、白蛋白结合肽或轻乙基淀粉(HES)衍生物。
[0231]在另一实施方案中，本发明的双特异性结合分子包含与存在于血液中的抗原结合的部分，例如血清白蛋白、血清免疫球蛋白、甲状腺素结合蛋白、纤维蛋白原(fibrinogen)或转铁蛋白，因而使所得本发明的多肽的体内半衰期增加。根据一项特别优选的实施方案，该部分为白蛋白结合免疫球蛋白且尤其优选为白蛋白结合免疫球蛋白单一可变域，例如白蛋白结合VHH域。
[0232]若欲在人中使用，则该白蛋白结合免疫球蛋白单一可变域优选结合人血清白蛋白且优选为人源化白蛋白结合VHH域。
[0233]结合人血清白蛋白的免疫球蛋白单一可变域在本领域中是已知的，且进一步详述于例如W02006/122786中。具体地，适用的白蛋白结合VHH为ALBl及其人源化对应物ALB8 (W02009/095489)。然而，也可使用在以上专利公开中提及的其他白蛋白结合VHH域。
[0234]具体适用的白蛋白结合VHH域为由SEQ ID NO:98或254所示的氨基酸序列组成的或含有该氨基酸序列的ALB8。
[0235]根据本发明的另一实施方案，优选呈VHH形式的两个免疫球蛋白单一可变域可融合至血清白蛋白分子，如例如W02001/79271及W02003/59934中所述。如例如W02001/79271中所述，融合蛋白可通过以下常规重组技术获得:将编码血清白蛋白或其片段的DNA分子接合至编码双特异性结合分子的DNA，将所得构建体插入适于在所选宿主细胞(例如酵母细胞(如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris))或细菌细胞)中表达的质粒中，接着用融合的核苷酸序列转染该宿主细胞，并使之在合适条件下生长。适用的HSA的序列如SEQ IDNO:99中所示。
[0236]根据另一实施方案，本发明的多肽的半衰期延长修饰(此修饰亦降低多肽的免疫原性)包含连接药理学上可接受的合适的聚合物，例如直链或支链聚(乙二醇)(PEG)或其衍生物(例如甲氧基聚(乙二醇)或mPEG)。一般而言，可使用任何适合形式的聚乙二醇化，例如本领域中用于抗体及抗体片段(包括但不限于域抗体及scFv片段)的聚乙二醇化；参考例如:Chapman, Nat.Biotechnol., 54, 531-545 (2002) ;Veronese 及 Harris, Adv.Drug Deliv.Rev.54,453-456(2003) ;Harris 及 Chess, Nat.Rev.Drug.Discov.2 (2003);及W02004/060965o
[0237]用于使多肽聚乙二醇化的`各种试剂也是市售的，例如可从NektarTherapeutics,USA 或 NOF Corporation, Japan 购得,所述试剂例如Suilbright? EA 系列、SH 系列、MA 系列、CA 系列及 ME 系列，例如Sun.br1.gb_ ME-l00MA、Sunbright? ME-200MA 及Sunbright?ME-400MA。
[0238]优选使用(特别是通过半胱氨酸残基的)定点聚乙二醇化(参见例如Yang等人，Protein Engineeringl6，761-770 (2003))。例如，出于此目的，PEG可连接至天然存在于本发明的多肽中的半胱氨酸残基，本发明的多肽可经修饰以便适当引入一个或多个用于连接PEG的半胱氨酸残基，或包含一个或多个用于连接PEG的半胱氨酸残基的氨基酸序列可融合至本发明的多肽的N-末端和/或C-末端，以上均使用对本领域技术人员而言本身已知的蛋白工程的技术。
[0239]优选地,对于本发明的多肽,使用PEG的分子量大于5kDa(例如大于IOkDa)且小于200kDa (例如小于IOOkDa)，例如在20kDa_80kDa范围内。
[0240]关于聚乙二醇化应注意，一般而言，本发明也优选涵盖已在一个或多个氨基酸位置处经聚乙二醇化的任何双特异性结合分子，该聚乙二醇化:(I)增加体内半衰期；(2)降低免疫原性；(3)提供对于聚乙二醇化本身已知的一种或多种其他有益性质；(4)基本上不影响多肽对其靶点的亲和力(例如通过本领域中所述的适合分析所测定，不使该亲和力降低50%以上、且更优选不使之降低10%以上)；和/或(5)不影响本发明的双特异性结合分子的任何其他所需性质。适合的PEG群组及用于特异性或非特异性与之连接的方法将为本领域技术人员所了解。用于使多肽聚乙二醇化的各种试剂也是市售，例如可从NektarTherapeutics, USA 或 NOF Corporation, Japan 购得，所述试剂例如Sunbl'igh1.典 EA 系列、SH 系列、MA 系列、CA 系列及 ME 系列，例如Sunbrighi? ME-lQQMA、Sunbright? ME-200MA 及Sunbrighli^ ME-400MA。
[0241]根据本发明的一项尤其优选的实施方案，本发明的聚乙二醇化多肽包括一个具有分子量为40kDa或60kDa的线型PEG的PEG部分，其中该PEG部分在连接区域中连接至所述多肽，且特别是在如SEQ ID NO:93中所示的GS9连接肽的5位处、在如SEQ ID NO:95中所示的GS27连接肽的14位处、或在如SEQ ID NO:96中所示的GS35连接肽的15位处、或在如SEQ ID NO:97中所示的35GS连接肽的5位处的Cys残基处连接至所述多肽。
[0242]如以下化学式中所示，本发明的双特异性结合分子可经如上提及的PEG试剂之一(例如 “SunbrigtoD me-40oma” )来聚乙二醇化:
[0243]
【权利要求】
1.一种双特异性结合分子，其包含至少一个VEGF结合组分,至少一个Ang2结合组分及至少一个血清白蛋白结合组分，其中所述Ang2结合组分以至少比对Angl或Ang4的结合效能高5，OOO倍的效能结合Ang2。
2.根据权利要求1所述的双特异性结合分子，其中所述VEGF结合组分至少包含具有四个框架区和三个分别为⑶R1、⑶R2及⑶R3的互补决定区的可变域，其中所述⑶R3具有如 SEQ ID NO:1 所不的氨基酸序列 Ser Arg Ala Tyr Xaa Ser Xaa Arg Leu Arg Leu XaaXaa Thr Tyr Xaa Tyr,其中 位置5的Xaa为Gly或Ala ； 位置7的Xaa为Ser或Gly ；
位置 12 的 Xaa 为 Gly、Ala 或 Pro ； 位置13的Xaa为Asp或Gly ； 位置16的Xaa为Asp或Glu ;且 其中所述VEGF结合组分能够以≤60%的抑制率阻断人重组VEGF165与人重组VEGFR-2的相互作用。
3.根据权利要求2所述的双特异性结合分子，其中所述CDR3具有选自下述的序列: SEQ ID NO:2 SRAYGSSRLRLGDTYDY,
SEQ ID NO:3 SRAYGSSRLRLADTYDY ；
SEQ ID NO:4 SRAYGSSRLRLADTYEY ；
SEQ ID NO:5 SRAYGSGRLRLADTYDY ；
SEQ ID NO:6 SRAYASSRLRLADTYDY ；
SEQ ID NO:7 SRAYGSSRLRLPDTYDY ； SEQ ID NO:8 SRAYGSSRLRLPGTYDYo
4.根据权利要求3所述的双特异性结合分子，其中所述VEGF结合组分包含一个或多个免疫球蛋白单一可变域，每个所述免疫球蛋白单一可变域包含: a.⑶R3，其具有选自SEQID NO:2_8所示的第一组序列的氨基酸序列； b.⑶Rl及⑶R2，其具有如表3所示的那样包含于选自SEQID NO:9至46所示的第二组序列的序列中的氨基酸序列，其中所述第二组序列包含根据a)所述的选择序列中的相应 CDR3。
5.根据权利要求4所述的双特异性结合分子，其中所述一个或多个免疫球蛋白单一可变域为VHH。
6.根据权利要求5所述的双特异性结合分子，其中所述一个或多个VHH具有选自SEQID NO:9-46所示氨基酸序列的氨基酸序列。`
7.根据权利要求6所述的双特异性结合分子，其包含一个或多个具有选自SEQID NO:15、SEQ ID NO:18 和 SEQ ID NO:25 的氨基酸序列的 VHH0
8.一种双特异性结合分子，其VEGF结合组分通过使权利要求7中定义的VHH亲和力成熟和/或序列最优化而获得。
9.根据权利要求8所述的双特异性结合分子，该双特异性结合分子的所述VEGF结合组分通过使具有如SEQ ID NO: 18所示氨基酸序列的VHH的序列最优化而获得。
10.根据权利要求9所述的双特异性结合分子，该双特异性结合分子的所述VEGF结合组分具有选自如SEQ ID NO:47-57所示序列的氨基酸序列。
11.根据权利要求5所述的双特异性结合分子，该双特异性结合分子的所述VEGF结合组分包含两个或更多个VHH，所述VHH为 a.能够以≥60%的抑制率阻断重组人VEGF与重组人VEGFR-2之间相互作用的相同的VHH，或 b.结合VEGF非重叠表位的不同的VHH，其中至少一个VHH能够以≥60%的抑制率阻断重组人VEGF与重组人VEGFR-2之间相互作用，并且其中至少一个VHH能够以≥60 %的抑制率阻断所述相互作用。
12.根据权利要求11所述的双特异性结合分子，其中所述相同的VHHa)选自具有SEQID NO:9-46所示氨基酸序列的VHH或通过使这样的VHH亲和力成熟和/或序列最优化而获得的VHH。
13.根据权利要求12所述的双特异性结合分子，其中所述VHH选自具有SEQID NO:18或SEQ ID NO:47-57所示氨基酸序列的VHH。
14.根据权利要求13所述的双特异性结合分子，其包含两个VHH，每个所述VHH具有如SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列。
15.根据权利要求14所述的双特异性结合分子，其中 a.所述具有>60%抑制率的一个或多个VHH选自 1.具有选自SEQ ID NO:9-46所示氨基酸序列的氨基酸序列的VHH，或 ?.通过使这样的VHH亲和力成熟和/或序列最优化而获得的VHH，并且其中 b.所述具有<60%抑制率的一个或多个VHH选自
1.SEQ ID NO:58-124 或 ?.通过使这样的VHH亲和力成熟和/或序列最优化而获得的VHH。
16.根据权利要求15所述的双特异性结合分子，其中两个VHH包含于具有SEQID NO:128-168所示氨基酸序列的多肽中，其由表13所示的接头序列分隔开来。
17.根据权利要求16所述的双特异性结合分子，其中所述VHHa) 1.具有SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列且所述VHH b)1.具有如SEQ ID NO:64所示的氨基酸序列。
18.根据权利要求17所述的双特异性结合分子，其中根据a)所述的VHHii)选自具有SEQ ID NO:47-57所示的氨基酸序列的VHH，且其中根据b)所述的VHH i1.)选自具有SEQID NO =125-127所示的氨基酸序列的VHH。
19.根据权利要求18所述的双特异性结合分子，其包含两个VHH，其中一个具有SEQIDNO:57所示的氨基酸序列，且其中一个具有SEQ ID NO:127所示的氨基酸序列。
20.根据权利要求1-19任一项所述的双特异性结合分子，其包含Ang2结合组分，所述Ang2结合组分至少包含具有四个框架区和三个分别为⑶R1XDR2及⑶R3的互补决定区的可变域，其中所述 CDR3 具有选自 SEQ ID NO:226、229、232、235、238、241、244、247、250 或253所示氨基酸序列的氨基酸序列。
21.根据权利要求20所述的双特异性结合分子，该双特异性结合分子的所述Ang2结合组分是分离的免疫球蛋白单一可变域或包含一个或多个所述免疫球蛋白单一可变域的多肽，其中所述免疫球蛋白单一可变域由四个框架区和三个分别为CDR1、CDR2及CDR3的互补决定区组成，并且其中所述CDR3具有选自SEQ ID NO:226、229、232、235、238、241、244、.247、250或253所示氨基酸序列的氨基酸序列。
22.根据权利要求21所述的双特异性结合分子，其中所述一个或多个免疫球蛋白单一可变域包含: a.⑶R3，其具有选自如下SEQID NO所示的第一组氨基酸序列的氨基酸序列:SEQ IDNO:226、229、232、235、238、241、244、247、250 或 253(表 49)； b.CDR1，其具有如表36-A、38-A、41-A或45-A所示的那样作为部分序列包含于选自SEQID NO:224、227、230、233、236、239、242、245、248 或 251 (表 49)所示的第二组氨基酸序列的序列中的氨基酸序列； c.CDR2，其具有如表36-A、38-A、41-A或45-A所示的那样作为部分序列包含于选自SEQID NO:225、228、231、234、237、240、243、246、249、或 252 (表 49)所示的第二组氨基酸序列的序列中的氨基酸序列。
23.根据权利要求20-22任一项所述的双特异性结合分子，其中所述一个或多个免疫球蛋白单一可变域为VHH。
24.根据权利要求23所述的双特异性结合分子，其中所述一个或多个VHH具有选自SEQID NO:214、215、216、217、218、219、220、221、222 或 223 所示氨基酸序列的氨基酸序列。
25.一种免疫球蛋白单一可变域，其通过使如权利要求22中定义的免疫球蛋白单一可变域亲和力成熟而获得。
26.—种VHH，其通过使如权利要求24中定义的VHH亲和力成熟而获得。
27.一种 Ang2 结合 VHH，其具有选自 SEQ ID NO:214、215、216、217、218、219、220、221、.222或223所示氨基酸序列的氨基酸序列。
28.一种免疫球蛋白单一可变域，其通过使权利要求27中定义的VHH人源化而获得。
29.一种免疫球蛋白单一可变域，其通过使如权利要求22中定义的免疫球蛋白单一可变域人源化而获得。
30.根据权利要求1-29中任一项所述的结合分子，该结合分子的所述血清白蛋白结合组分是分离的免疫球蛋白单一可变域或包含一个或多个所述免疫球蛋白单一可变域的多肽，其中所述免疫球蛋白单一可变域由四个框架区和三个分别为CDR1、CDR2及CDR3的互补决定区组成，且其中所述CDR3具有选自SEQ ID NO:257、260、263、266、269、272或275所示氨基酸序列的氨基酸序列。
31.根据权利要求30所述的结合分子，其中所述一个或多个免疫球蛋白单一可变域包含: a.CDR3，其具有选自 SEQ ID NO:257、260、263、266、269、272 或 275 所示的第一组氨基酸序列的氨基酸序列； b.CDRl，其具有选自 SEQ ID NO:255、258、261、264、267、270 或 273 所示的第二组氨基酸序列的氨基酸序列； c.CDR2，其具有选自 SEQ ID NO:256、259、262、265、268、271 或 274 所示的第二组氨基酸序列的氨基酸序列。
32.根据权利要求30或31所述的双特异性结合分子，其中所述一个或多个免疫球蛋白单一可变域为VHH。
33.根据权利要求32所述的双特异性结合分子，其中所述一个或多个VHH具有选自SEQID NO:98或254所示的氨基酸序列。
34.根据权利要求1-33中任一项所述的双特异性结合分子，其具有选自如SEQID NO:180-213所示氨基酸序列的氨基酸序列。
35.一种核酸分子，其编码权利要求1-34中任一项的双特异性结合分子或含有其的载体。
36.一种宿主细胞,其含有权利要求35的核酸分子。
37.药物组合物，其含有至少一种权利要求1-34中任一项的双特异性结合分子作为活性成分。
38.根据权利要求37所述的药物组合物，其用于治疗与VEGF介导的和/或Ang2介导的血管生成作用相关的疾病。
39.根据权利要求38所述的药物组合物，其用于治疗癌症及癌性疾病。
40.根据权利要求38所述的药物组合物，其用于治疗眼病。
【文档编号】C07K16/26GK103562222SQ201280026064
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2012年3月30日 优先权日:2011年4月1日
【发明者】A.格希文德, R.G.奥特, J.博克尼奥, M-A.拜西, E.德普拉 申请人:勃林格殷格翰国际有限公司