含白细胞介素37的药物、其制备方法及应用的制作方法

含白细胞介素37的药物、其制备方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种白细胞介素在制药中的应用，具体公开了白细胞介素37（IL-37）作为药物的活性成分及其制备。同时本发明公开了IL-37、其衍生物、变异体和/或截短多肽为活性成分，或者上述物质的编码核苷酸序列为活性成分。并公开了原核、真核、哺乳类细胞表达及纯化IL-37及其活性成分的方法。也公开了IL-37及其活性成分编码核苷酸序列克隆至各种表达载体进行基因治疗。还公开了上述活性成分在治疗自身免疫或慢性非感染性炎症疾病中的应用。本发明可应用于类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、特应性皮炎、银屑病、克罗恩病、多发性硬化、哮喘、糖尿病、移植排斥、动脉粥样硬化或炎症性肠疾病等疾病的治疗。
【专利说明】含白细胞介素37的药物、其制备方法及应用

【技术领域】
[0001] 本发明涉及制药领域，尤其涉及白细胞介素37在制药中的应用，具体涉及白细胞 介素37及其生物学活性片段在制备用于治疗自身免疫或慢性非感染性炎症疾病的药物中 的应用。

【背景技术】
[0002] 自身免疫性疾病是由于机体针对正常存在于体内的物质和组织产生不适当免疫 反应引发的，慢性非感染性炎症疾病的根本原因是致炎因子持续存在并且损伤组织，致炎 因子引发各种免疫反应和自身免疫反应。细胞因子介导各种各样免疫反应，并在多种人类 自身免疫性疾病和慢性非感染性炎症疾病的发病机制中起着关键的作用，主要包括类风湿 关节炎、系统性红斑狼疮、特应性皮炎、克罗恩病、银屑病、多发性硬化、哮喘、糖尿病、移植 排斥、动脉粥样硬化、炎症性肠疾病、强直性脊柱炎、甲亢、乔本氏甲状腺炎和再生障碍性贫 血。
[0003] 细胞因子在上述人类自身免疫性疾病和慢性疾病发生和发展中起到重要作用，特 别是，它们的多效性功能和协同作用的倾向，使它们成为重要的疾病治疗靶点。目前为止， 经FDA批准的单细胞因子靶点药物，TNFa单克隆抗体能有效抑制II胶原蛋白所诱导的免 疫反应及类风湿性关节炎的发生和发展。TNFa单克隆抗体对类风湿性关节炎的炎症治疗 作用是通过抑制TNFa诱导的IL-1、IL-6、IL-8、IL-17、IFN-γ、GM-CSF、MCP-1等与类风湿 性关节炎炎症相关细胞因子而实现。
[0004] 类风湿性关节炎（Rheumatoid Arthritis, RA)是一种以慢性、进行性、侵袭性关 节炎为主要表现的全身性自身免疫性疾病，其特征在于关节中滑膜的慢性炎症反应，滑膜 组织表达大量并具有功能活性的炎性细胞因子，研究表明这些因子与RA的炎性反应、滑膜 的增生、关节软骨的降解和关节旁骨的破坏密切相关。实验证明，炎症性因子IL-1、IL-6、 IL-17、IL-15、IL-18、IL-33和TNF α促进RA的发生和发展，然而抑炎因子IL-10、IL-27、 IL-35和TGF- β则已被证明延缓RA的发生，减轻RA的症状，阻延RA的病理发展。
[0005] 系统性红斑狼疮（Systemic Lupus Erythematosus, SLE)是一种自身免疫疾 病，发病机制复杂，导致临床表现多样，表现多器官损害。细胞因子在SLE发病机制中 有重要作用，在系统炎症、局部组织损害和免疫调节中起着关键作用（Jabcob N，Stohl W.，Arthritis Research&Therapy. 2011，13:228, 11)，细胞因子产物及表达水平的失衡伴 随SLE发展。研究报道显示，与健康者比较，SLE患者的IL-1、IL-2、IL-6、IL-17、IFN-α、 IFN- γ、TNF a、BLyS高表达，其表达与疾病活动程度相关，而IL-10和抑炎因子TGF- β表 达下降。
[0006] 特应性皮炎或过敏性湿疫（Atopic Dermatitis/Atopic Eczema，AD/AE) 是一种慢性炎症性皮肤疾病，复发频繁。AD/AE患者的IgE和嗜酸粒细胞显高水 平，细胞因子在AE的细胞间复杂应答有着重要作用（Leung DYM.，J Allergy Clin Immunol. 1999, 104:S99 - 108)。Th2细胞介导的应答在AD发生发展中起着重要作用。研 究表明，AD患者中Th2细胞因子IL-4、IL-5、IL-13、IL-31表达升高，Thl细胞因子IL-17、 IL-22在AD急性期患者表达水平高，而IL-18在AD患者血清中表达显著升高，且IL-18与 IL-12协同诱导Thl细胞、T细胞、B细胞和NK细胞分泌IFN- γ，随着IFN- γ表达升高IL-10 受抑制，在AD患者PBMC中表达下降。IL-12拮抗IL-10的作用，使Th2细胞转化为Thl细 胞。患者慢性病灶产生化学因子，如CCL5、CCL17、CCL17、CXCL9、CXCL10、CXCL11，招募和保 持Thl细胞功能。
[0007] 克罗恩病（Crohn's Disease,⑶），也被称为节段性回肠炎综合征和局限性肠炎， 是一种慢性、炎症性肠疾病，由Thl/Thl7过度反应引起，而Thl7更重要。克罗恩病发病机 制早期关注IL-12介导IFN- γ产生的应答，而近年研究显示IL-23介导的Thl7应答更重 要，通过与自身免疫炎症过程相关的一系列明确的介质导致疾病发生。新的传导途径称为 Thl7应答，由T细胞产IL-17,导致多个器官系统的组织功能障碍（Steinman L.，Nature Medicine. 2007, 13(2):139-145)。
[0008] 银屑病（Psoriasis)是一种遗传性慢性炎症皮肤疾病，是皮肤中免疫细胞和角 质细胞相互作用的结果，一般与克罗恩病一起发生。研究显示，IL-23和IL-12注入老鼠 体内都能引起银屑病炎症反应，但注射IL-23的老鼠组更严重（Guttman-Yassky E等，J Immunol. 2008, 181:7420 - 7427. )。IL-23和Thl7介导真皮免疫细胞和表皮角质细胞的相 互作用，IL-23、IL-17、IL-22在银屑病患者体内表达增高。激活原诱导DCs和巨噬细胞产 生IL-23和TNF-α，协同IL-6、TGF-β因子激活Thl7细胞产生IL-17和IL-22,同时巨噬 细胞产生 IL-19、IL-20 和 IL-24。
[0009] 多发性硬化（Multiple Sclerosis，MS)，也被称为"播散性脑脊髓炎"，是一种炎症 性疾病，由免疫介导的中枢神经系统（CNS)脱髓鞘性多发性和神经退行性疾病，病变主要发 生在中枢神经系统的白质。研究报道显示，在MS患者中IFN-γ、TNF-a、IL-12、0ΡΝ表达 显著升高，IL -18、IL_6在MS患者中表达升高，RR (relapsing-remitting) MS患者PBMC中 IL-10和TGF- β的水平下降，IL-10缺陷小鼠比IL-4缺陷小鼠更易患实验性自身免疫性脑 脊髓炎。
[0010] 哮喘（Asthma)是一种常见的呼吸道慢性炎症性疾病，表现为支气管高反 应性，气道阻塞，引起炎症，产生过度粘液，导致气道壁重塑。哮喘患者哮喘发作时 表现出显著高水平的细胞因子和趋化因子（Schuijs MJ等，Current Opinion in Pharmacology. 2013, 13:1 - 11.)，如 IL-4、IL-5、IL-13、IL-1、IL-18、GM-CSF、IFN-γ、IL-6、 TNF-α、IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-22、IL-23 和 CCR3。Thl 和 Th2 应答平衡改变，Thl7 细 胞也升高，而免疫抑制作用的IL-10在哮喘患者中表达水平降低。
[0011] 糖尿病（Diabetes)是一组代谢性疾病，表现血糖高，因为胰腺不能产生足够的胰 岛素，或者是因为对胰岛素抵抗。糖尿病分为I型和II型，I型是胰岛素分泌不足，胰岛素 依赖型糖尿病或"青少年糖尿病"，II型是胰岛素抵抗，非胰岛素依赖型糖尿病或"成人发 病型糖尿病"。I型和II型糖尿病和糖尿病并发症与免疫异常相关。在I型糖尿病中，T细 胞的异常被认为是自身免疫性疾病的主要病因；Π 型糖尿病中，认为炎症和单核细胞的活 化是加重胰岛素抵抗重要的因素。来自脂肪组织中的各种细胞因子，激活单核细胞和炎性 细胞因子的分泌增加，加重胰岛素抵抗。研究显示，在自身免疫糖尿病中，IFN-Y/TNF-a 的协同作用导致胰岛细胞凋亡。I型和II型糖尿病都伴随着炎症反应，表达炎性因子，如 11^-10、11^-6和了呖-〇。在11型糖尿病患者中11^-18、11^-10、了呖-〇、11^-6表达增高。多 种细胞因子和化学因子，如 TNF- α、IFN- γ、IL-6、IL-1 β、resistin、IL-8、IL-10、IL-12、 IL-18、lymphotoxins、TGF-P、MIP-1 a、MCP-1、MIP-1 α、MIP-1 β、MIP-2 失调引起炎症诱 导胰岛素抵抗发生。
[0012] 移植排斥（Transplant Rejection, TR)是由于移植组织被接受者免疫系统排斥， 从而破坏移植组织。Thl和Th2在移植组织的免疫应答中发挥重要的作用，Thl细胞因子 (IFN-γ和IL-2)导致移植排斥活化，而Th2细胞因子（IL-4和IL-10)使移植接受和耐 受。移植接受相关因子有IL-4、IL-6、IL-10、IL-15,而与移植排斥排斥相关的因子有IL-1、 IL-2、IFN-γ、TNF-a。
[0013] 动脉粥样硬化(Atherosclerosis)是一种先天性免疫和适应性免疫机制都参与的 动脉壁慢性、进行性、动态的炎症性疾病，首先因为血清中过度的低密度脂蛋白导致大范围 或中范围动脉的局部炎症，免疫应答在动脉粥样硬化所有阶段起关键作用。动脉粥样硬化 与MS及RA相似，是一种Thl疾病，调节动脉粥样硬化的免疫炎症反应通过不同的信号通路 被调节，其中 IL-10 和 TGF-β 起着关键作用（Tedgui A 等，Physiol Rev.2006, 86:515 -581.)。目前研究显示，促进动脉粥样硬化发生发展相关的细胞因子有IL-1、IL-12、IL-18、 MIF、IFN-γ、TNF-a，M-CSF，这些因子在脉粥样硬化斑块有高表达量，而抑制疾病的发生发 展的细胞因子，如IL-4、IL-10、IL-33、TGF-i3，在动脉粥样硬化患者中表达下降。
[0014] 炎症性肠疾病（Inflammatory Bowel Disease, IBD)涉及肠胃道的系统性炎症疾 病，包括克罗恩病（⑶)、溃疡性结肠炎（UC)和未定型结肠炎，指一组由胃肠道炎症为特征 的慢性疾病，涉及众多相关的细胞免疫和体液免疫反应的免疫机制紊乱。IBD的发病主要原 因不是很清楚，其严重程度与细胞因子有很大的相关性，促炎细胞因子(如TNF-α、IFN_ γ、 IL-1、IL-1 β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、IL-17、IL-23)和抗炎因子（如 IL-4、IL-10、IL-11、 IL-13)的失衡，在介导和调节炎症反应中发挥了关键作用。
[0015] 强直性脊柱炎（Ankylosing spondylitis,AS)是一种伴随不同的外周关节和非关 节参与的慢性炎症性的中轴骨疾病，主要影响脊柱的关节和骨盆的骶髂关节，并可能导致 最终的脊柱融合，且女性发病率高于男性三倍。AS以骶髂关节炎为特征，伴随附着点和脊 椎的炎症。AS的发病机制未彻底了解，但近年来大量研究显不AS基本上是一个遗传病，与 HLA-B27存在密切联系，并且免疫机制起着关键的作用。炎性因子IL-6和TNF-α促进AS 的炎症反应，研究显示AS患者血清中TNF-a、IL-6和TGF-β显著升高，IL-1 β、sIL-2R、 M-CSF和VEGF在AS患者体内也升高（Mattey DL等，Arthritis Res Ther.2012，14:R127·)。 AS患者的PBMC细胞中IL-17阳性和IL-22阳性⑶4+T细胞的百分率增加，导致PBMC受刺 激后分泌更多IL-17,参与关节炎的炎症反应。
[0016] 甲状腺功能允进症（hyperthyroidism,简称甲允）一般涉及甲状腺过度活跃，是 指甲状腺本身的病变引发的甲状腺毒症，由甲状腺产生和分泌过多的游离的甲状腺激素、 三碘甲状腺氨酸（T3)和/或甲状腺素（T4)引起。甲亢的病因主要是弥漫性毒性甲状腺肿 (Graves disease,⑶)、多结节性毒性甲状腺肿和甲状腺自主高功能腺瘤，其中⑶是最常见 的病因。GD是一种自身免疫性甲状腺疾病，细胞因子在自身免疫性甲状腺疾病中起到重要 作用。甲状腺滤泡细胞产生的细胞因子(如IL-6、TNF_ α )对T细胞和B的增殖分化非常关 键。研究显示，甲亢患者血清中IL-1、IL-6、IL_8和TNF-α的表达显著升高，且TNF-α能持 续放大炎症，产生更多其他细胞因子，如IL_2、IL_6和PAF(platelet activating factor) (B AVCI 等，J tubitak gov tr. 1999, 29:25-29.)。⑶患者中 IL-4、IL-10 和 IFN-γ 表达 量显著升高。GD甲亢患者血清中表达升高的细胞因子反应了 Thl和Th2细胞的活化及相互 间的作用。这与甲状腺的持续炎症反应和破坏过程一致。
[0017] 乔本氏甲状腺炎（Hashimoto's thyroiditis, HT)或者称为慢性淋巴细胞甲状腺 炎是一种器官特异性自身免疫疾病，其甲状腺受到多种细胞和抗体介导的免疫反应攻击。 有报道显示HT以Thl应答为主要应答，其患者体内Thl细胞因子(如IL-1 β，IL-2, IFN- γ ) 的mRNA表达上调，说明ΗΤ主要是Τ细胞介导的细胞毒性应答过程。研究显示，在ΗΤ患者 的外周血中表达IL-17和IL-22的T细胞数目增加，而甲状腺内IL-17和IL-22表达上调 (N Figueroa-Vega等，J Clin Endocrinol Metab. 2010, 95:953-962. )，IL-23R+细胞数目 增多，血清中 IL-2, IL-6, IL-12, IL-15, IL-23, IFN-γ 浓度升高。
[0018] 再生障碍性贫血（Aplastic anemia, AA)是由于造血干细胞的减少而引起外周血 中和发育不全的骨髓中每种血细胞（即红细胞，白细胞和血小板）都降低的一种疾病。虽然 AA是血液系统中一直罕见的疾病，但其发病机制非常复杂，大量研究可说明AA是一种自 身免疫疾病，其发病机制涉及异常的造血微环境、造血干细胞增殖分化缺乏和免疫紊乱，其 中T细胞亚群的紊乱和功能失调起着关键作用。研究显示，在AA中Thl细胞处于极化状 态，特异性转录因子T-bet及其效应细胞因子IFN-y、IL-2和TNF-α表达上调；Thl7细胞 增多，而且IL-17及其特异转录因子R0R γ t在mRNA和胞质蛋白水平都升高（Du HZ等，J Clinlmmunol. 2013, 33:436-445. )。IL-27 在 AA 患者中表达升高，且 IL-27 可加强 Thl 细胞 的分化和增殖。
[0019] 白细胞介素37 (IL-37)是IL-1家族中一个新成员（Kumar S等，J Biol Chem. 2000, 275:10308-10314)。目前，IL-37发现了五个异构体，它们是通过IL-37基因 的变异剪接而形成，分别命名为IL_37a到e，其中IL-37b是最长的异构体，其余异构体 则分别缺失1到3外显子不等，IL-37a拥有由IL-37基因外显子3所编码的独特N末端 (Busfield SJ 等，Genomics. 2000, 66:213)。在体内合成的 IL-37 是前体蛋白，经 caspase-1 和/或elastases切除N端前肽而成为成熟蛋白。不同的IL-37异构体表达在不同的组 织，如IL-3a在大脑，IL-37b在肾脏，IL-37c在心脏，IL-37d和e则在骨髓和睾丸中，除 了 IL_37a仅仅表达在大脑外，其余异构体均可见在外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC)〇
[0020] IL-37是作为前体蛋白被合成并保存在胞浆内，在炎症的刺激下，前体蛋白被切割 并释放到胞外作为配体或易位到细胞核作为转录因子。IL_37b、c、d和e之间的异构体存 在同样的蛋白酶竞争抑制和功能调节。鉴别不同的前体在不同的组织和不同类型的细胞表 达，将有助于澄清IL-37异构体相互调节的复杂网络，例如IL-37a是唯一在大脑中表达的 异构体，因而它不能受其他IL-37异构体的调节。
[0021] 目前，针对IL-37的抗炎作用已有一些研究，但并没有相关研究明确揭示其对RA、 SLE、AD、CD、银屑病、MS、哮喘、糖尿病、TR、动脉粥样硬化、IBD、AS、甲允、HT和AA疾病的治 疗作用。因此，本领域需要相关研究来揭示IL-37对上述疾病的治疗作用。


【发明内容】

[0022] 本发明人经过大量实验进行深入研究，发现IL-37对狀、51^、八0、^、银屑病、1^、 哮喘、糖尿病、TR、动脉粥样硬化、IBD、AS、甲亢、HT和AA疾病具有明显的治疗作用，可用作 治疗自身免疫或慢性非感染性炎症疾病的药物，据此完成本发明。
[0023] 本发明具体包括以下内容：
[0024] 在第一方面，本发明提供一种用于治疗自身免疫或慢性非感染性炎症疾病的药 物，所述药物以白细胞介素37、其衍生物、变异体和/或截短多肽为活性成分；任选地，还包 括药学上可接受的载体。
[0025] 优选地，所述白细胞介素 37具有如SEQ ID N0 :1所示的氨基酸序列。
[0026] 优选地，所述衍生物是如SEQ ID NO : 1所示的氨基酸序列取代、缺失和/或插入一 个或多个氨基酸并具有与SEQ ID N0 :1所示的氨基酸序列相同或相似活性的氨基酸序列。
[0027] 优选地，所述变异体是白细胞介素37或其衍生物连接糖和/或脂肪PEG修饰侧链 得到的功能与白细胞介素37相同或相似的修饰肽。
[0028] 优选地，所述截短多肽是包括如SEQ ID N0 :1中部分氨基酸序列的活性片段的截 短多肽。
[0029] 优选地，所述疾病包括类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、特应性皮炎、银屑病、克罗 恩病、多发性硬化、哮喘、糖尿病、移植排斥、动脉粥样硬化、炎症性肠疾病、强直性脊柱炎、 甲亢、乔本氏甲状腺炎或再生障碍性贫血。
[0030] 优选地，所述药物经口服或非肠胃方式服用。
[0031] 优选地，所述非肠胃方式服用包括局部、关节腔、动脉、肌肉内、皮下、骨髓内、囊 内、心室内、静脉、腹膜内、粘膜或鼻腔注射服用。
[0032] 优选地，所述药物的制剂形式为药丸、药片、注射剂、胶囊、液体、胶体、糖衣丸、糖 浆、浆体或悬浮液。
[0033] 在第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的药物的制备方法，所述方法包括 制备白细胞介素37、其衍生物、变异体和/或截短多肽作为药物的活性成分的步骤；任选 地，还包括将所述活性成分与药学上可接受的载体混合制成药物制剂形式的步骤。
[0034] 优选地，所述白细胞介素37通过原核细胞表达系统进行表达和分离纯化。
[0035] 优选地，所述表达和分离纯化的方法为：将编码白细胞介素 37的基因片段连入原 核表达载体得到重组表达载体；将所述重组表达载体转化大肠杆菌，并筛选得到阳性克隆 菌；大量培养所述阳性克隆菌，并用诱导物诱导白细胞介素37表达；超声破碎，并利用亲和 层析进行分离纯化得到白细胞介素37重组蛋白。
[0036] 优选地，所述原核表达载体为pET32a。
[0037] 优选地，所述大肠杆菌菌株为Ε· coli Transetta(DE3)。
[0038] 优选地，所述诱导物为异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷。
[0039] 在本领域中，使用原核细胞表达白细胞介素37 -直非常困难，要么表达不出蛋 白，要么表达出的蛋白没有生物学活性。本发明成功地使用原核细胞表达了白细胞介素37， 而且表达量大，并具有很强的生物学活性。可以使用该方法大量表达白细胞介素37用于制 备药物。
[0040] 在第三方面，本发明提供一种用于治疗自身免疫或慢性非感染性炎症疾病的药 物，所述药物包含编码白细胞介素37或其衍生物的核苷酸序列；任选地，还包括药学上可 接受的载体。
[0041] 优选地，所述白细胞介素 37具有如SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列。
[0042] 优选地，所述衍生物是如SEQ ID NO : 1所示的氨基酸序列取代、缺失和/或插入一 个或多个氨基酸并具有与SEQ ID N0 :1所示的氨基酸序列相同或相似活性的氨基酸序列。
[0043] 优选地，所述核苷酸序列如SEQ ID N0 :2所示。
[0044] 优选地，所述核苷酸序列插入重组载体中。
[0045] 优选地，所述重组载体来自质粒、粘粒、人工染色体、腺病毒、慢病毒或噬菌体和其 它哺乳类细胞表达载体。
[0046] 优选地，所述核苷酸序列或包含所述核苷酸序列的重组载体负载于脂质体及各种 革巴向载体。
[0047] 优选地，所述疾病包括类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、特应性皮炎、银屑病、克罗 恩病、多发性硬化、哮喘、糖尿病、移植排斥、动脉粥样硬化、炎症性肠疾病、强直性脊柱炎、 甲亢、乔本氏甲状腺炎或再生障碍性贫血。
[0048] 在第四方面，本发明提供一种白细胞介素37、其衍生物、变异体和/或截短多肽在 制备用于治疗自身免疫或慢性非感染性炎症疾病的药物中的用途。
[0049] 优选地，所述白细胞介素 37具有如SEQ ID N0 :1所示的氨基酸序列。
[0050] 优选地，所述衍生物是如SEQ ID NO : 1所示的氨基酸序列取代、缺失和/或插入一 个或多个氨基酸并具有与SEQ ID N0 :1所示的氨基酸序列相同或相似活性的氨基酸序列。
[0051] 优选地，所述变异体是白细胞介素 37或其衍生物连接糖和/或脂肪PEG修饰侧链 得到的功能与白细胞介素37相同或相似的修饰肽。
[0052] 优选地，所述截短多肽是包括如SEQ ID N0 :1中部分氨基酸序列的活性片段的截 短多肽。
[0053] 优选地，所述疾病包括类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、特应性皮炎、银屑病、克罗 恩病、多发性硬化、哮喘、糖尿病、移植排斥、动脉粥样硬化、炎症性肠疾病、强直性脊柱炎、 甲亢、乔本氏甲状腺炎或再生障碍性贫血。
[0054] 在第五方面，本发明提供一种编码白细胞介素 37或其衍生物的核苷酸序列在制 备用于治疗自身免疫或慢性非感染性炎症疾病的药物中的用途。
[0055] 优选地，所述白细胞介素 37具有如SEQ ID N0 :1所示的氨基酸序列。
[0056] 优选地，所述衍生物是如SEQ ID NO : 1所示的氨基酸序列取代、缺失和/或插入一 个或多个氨基酸并具有与SEQ ID N0 :1所示的氨基酸序列相同或相似活性的氨基酸序列。
[0057] 优选地，所述核苷酸序列如SEQ ID N0 :2所示。
[0058] 优选地，所述核苷酸序列负载于脂质体中。
[0059] 优选地，所述疾病包括类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、特应性皮炎、银屑病、克罗 恩病、多发性硬化、哮喘、糖尿病、移植排斥、动脉粥样硬化、炎症性肠疾病、强直性脊柱炎、 甲亢、乔本氏甲状腺炎或再生障碍性贫血。
[0060] 在第六方面，本发明提供一种具有编码白细胞介素 37或其衍生物的核苷酸序列 的重组载体在制备用于治疗自身免疫或慢性非感染性炎症疾病的药物中的用途。
[0061] 优选地，所述白细胞介素 37具有如SEQ ID N0 :1所示的氨基酸序列。
[0062] 优选地，所述衍生物是如SEQ ID NO : 1所示的氨基酸序列取代、缺失和/或插入一 个或多个氨基酸并具有与SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列相同或相似活性的氨基酸序列。 [0063] 优选地，所述核苷酸序列如SEQ ID N0 :2所示。
[0064] 优选地，所述重组载体来自质粒、粘粒、人工染色体、腺病毒、慢病毒或噬菌体。
[0065] 优选地，所述重组载体负载于脂质体中。
[0066] 优选地，所述疾病包括类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、特应性皮炎、银屑病、克罗 恩病、多发性硬化、哮喘、糖尿病、移植排斥、动脉粥样硬化、炎症性肠疾病、强直性脊柱炎、 甲亢、乔本氏甲状腺炎或再生障碍性贫血。
[0067] 在第七方面，本发明提供一种包含重组载体的宿主细胞在制备用于治疗自身免疫 或慢性非感染性炎症疾病的药物中的用途，其中所述重组载体具有编码白细胞介素37或 其衍生物的核苷酸序列。
[0068] 优选地，所述白细胞介素37具有如SEQ ID N0 :1所示的氨基酸序列。
[0069] 优选地，所述衍生物是如SEQ ID NO : 1所示的氨基酸序列取代、缺失和/或插入一 个或多个氨基酸并具有与SEQ ID N0 :1所示的氨基酸序列相同或相似活性的氨基酸序列。
[0070] 优选地，所述核苷酸序列如SEQ ID N0 :2所示。
[0071] 优选地，所述重组载体来自质粒、粘粒、人工染色体、腺病毒、慢病毒或噬菌体。
[0072] 优选地，所述重组载体负载于脂质体中。
[0073] 优选地，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。
[0074] 优选地，所述原核细胞包括大肠杆菌、芽孢杆菌和链霉菌。
[0075] 优选地，所述真核细胞包括酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞和哺乳动物细胞。
[0076] 优选地，所述疾病包括类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、特应性皮炎、银屑病、克罗 恩病、多发性硬化、哮喘、糖尿病、移植排斥、动脉粥样硬化、炎症性肠疾病、强直性脊柱炎、 甲亢、乔本氏甲状腺炎或再生障碍性贫血。
[0077] 本发明证实了 IL-37对狀、51^、八0、〇)、银屑病、1^、哮喘、糖尿病、了1?、动脉粥样硬 化、IBD、AS、甲亢、HT和AA疾病具有明显的治疗作用，基于IL-37对上述疾病的治疗作用制 备的药物，可用于治疗自身免疫或慢性非感染性炎症疾病，并取得较好的治疗效果。

【专利附图】

【附图说明】
[0078] 图1显示IL-37在E. coli Transetta(DE3)中的表达和鉴定结果。其中，图1A为 IL-37的PCR产物电泳检测结果图（其中泳道Mr为DNA Marker，泳道1-5为从PBMC cDNA 中克隆的IL-37阳性产物(去信号肽)，泳道6为阴性对照);图1B为IL-37的PCR产物测序 结果与NCBI公开的序列BLAST比对结果，验证克隆IL-37的PCR产物序列完全正确；图1C 为SDS-PAGE考马斯亮蓝染色检测E. coliTransetta(DE3)表达IL-37的结果图，其中泳道 Mr为标准分子量蛋白，泳道A为诱导前阳性菌株的破碎液，泳道B和C为诱导后阳性菌株的 破碎液，结果显示E. coli Transetta成功表达IL-37重组蛋白；图1D为SDS-PAGE考马斯 亮蓝染色检测纯化的IL-37蛋白结果图，其中泳道Mr为标准分子量蛋白，2ul、4ul和8ul对 应的泳道分别是各自数值表示的蛋白上样量的电泳结果，结果显示纯化效果良好；图1E为 重组蛋白IL-37的免疫印迹鉴定结果图，用抗IL-37抗体进行Westen blot检测IL-37重 组蛋白，其中泳道Mr为标准分子量蛋白，1. 6ug、0. 8ug和0. 4ug对应的泳道分别是各自数值 表示的蛋白上样量的电泳结果。
[0079] 图2显示IL-37腺病毒表达系统的构建及体内、体外鉴定IL-37表达。其 中，图2A为病毒穿梭载体pShuttle-IRES-hrGFP2的图谱；图2B为L-37克隆至 pShuttle-IRES-hrGFP2 中 PCR 鉴定结果图，其中 Mr 为 DNA Marker，1、2、3、4 和 5 泳道 分别为PCR产物，Shuttle-IRES-hrGFP2-IL-37重组质粒目的基因 IL-37的PCR产物为 860bp ;图2C为pShuttle-IRES-hrGFP2-IL-37重组质粒Pme I线性化后鉴定结果图，其中 泳道Mr为DNA Marker，泳道1为pShuttle-IRES-hrGFP2-IL-37重组质粒，泳道2和3为 pShuttle-IRES-hrGFP2-IL-37用Pme I酶切后的产物，和预期结果一致；图2D为腺病毒同 源重组质粒的PacI酶切产物鉴定结果图，其中泳道Mr为DNA Marker，泳道1为Pac I酶 切后产物，大约分别为30kb和4. 5kb，与预期大小一致；图2E为IL-37体内表达的鉴定结 果图，其中表达IL-37的腺病毒（Ad-IL-37)和表达空载体的腺病毒（Ad-EV)注射DBA小鼠 关节腔3天，利用小鼠活体成像系统（IVIS)检测小鼠关节Ad-IL-37和Ad-EV的GFP荧光 信号，转Ad-EV的小鼠呈GFP荧光，说明质粒呈GFP阳性，转Ad-IL-37的小鼠呈GFP荧光， 说明IL-37-GFP融合蛋白表达成功；图2F为IL-37体外表达的鉴定结果图，表达IL-37的 腺病毒（Ad-IL-37)和表达空载体的腺病毒（Ad-EV)感染A549细胞3天，荧光显微镜观察 Ad-IL-37和Ad-EV的GFP荧光信号。
[0080] 图3显示体外IL-37重组蛋白抑制DBA小鼠免疫细胞炎性细胞因子的表达的结 果。其中，图3A为qPCR检测重组IL-37蛋白显著抑制LPS激活的外周血PBMC表达TH1、 TH17细胞因子；图3B为qPCR检测重组IL-37蛋白显著抑制LPS激活的外周血⑶4+T表 达TH1细胞因子；图3C为qPCR检测，重组IL-37蛋白显著抑制腹腔巨噬细胞表达IL-1 β、 IL-6、IN0S 炎性因子；（*Ρ〈0· 05 ;**Ρ〈0· 01)。
[0081] 图4显示IL-37抑制II型胶原蛋白诱导RA的疾病进程结果图。II型胶原诱导DBA 小鼠 RA (CIA)，关节腔注射表达IL-37的腺病毒（Ad-IL-37)和空载体的腺病毒（Ad-EV); 其中，图4A为Ad-IL-37明显降低CIA小鼠的发病率，延迟了 RA的发病时间，显著抑制CIA 小鼠关节肿胀和平均临床得分；图4B为Ad-IL-37和Ad-EV组小鼠右后肢图片；图4C为 Ad-IL-37和Ad-EV组小鼠膝关节组化评分，Ad-IL-37显著抑制膝关节滑膜炎、血管翳的形 成以及软骨和骨破坏；图4D为Ad-IL-37和Ad-EV组小鼠膝关节HE染色，其中ST代表滑膜 组织，JC代表关节腔，C代表软骨，B代表骨；关节腔未注射表达IL-37腺病毒组小鼠膝关节 滑膜明显增生，滑膜和半月板可见大量炎性细胞浸润，软骨和骨破坏严重。关节腔未注射表 达IL-37腺病毒组小鼠膝关节滑膜组织和半月板完整，软骨和骨表面光滑，未见炎性细胞 侵蚀；图4E为Ad-IL-37和Ad-EV组小鼠脾脏照片，Ad-EV组小鼠小鼠脾脏肿大，Ad-IL-37 组小鼠脾脏未见异常；图4为F为Ad-IL-37组小鼠显著抑制CIA小鼠脾脏肿大；（*P〈0. 05 ; **P〈0. 01)。
[0082] 图5显示IL-37抑制CIA炎性细胞因子的表达结果图。其中，图5A显示与Ad-EV 组相比，ELISA检测Ad-IL-37显著抑制CIA血清和滑膜液上清IgG、IgG2a抗体的产生，抑制 IgG2a/IgGl的比例；图5B显示ELISA检测Ad-IL-37显著抑制血清和滑膜液上清胶原特异 性IgG抗体的产生；图5C显示ELISA检测Ad-IL-37显著抑制血清中TH1细胞因子IL-1 β、 IL-6、IFN-γ的表达；图?为qPCR检测Ad-IL-37显著抑制外周血PBMC表达TNF-α、 IL-1 β、IL-6、IFN- γ、INOS、IL-17 的表达；图 5E 显示 ELISA 检测 Ad-IL-37 显著抑制滑膜 液中TH1细胞因子IL-1 β、IL-6、IFN- γ的表达；图5F显示qPCR检测Ad-IL-37显著抑制 滑膜组织TNF- α、IL-1 β、IL-6、IN0S、P38的表达，且显著上调TH2细胞因子IL-4的表达； 图5G为qPCR检测滑膜液中巨噬细胞表达TNF- a、IL-1 β、IL-6、INOS的表达；（*P〈0. 05 ; **P〈0. 01)。
[0083] 图6显示RA和健康人样本临床试验数据和人口统计学特征、分析IL-37在RA和健 康人的表达、IL-37抑制炎性因子的表达与临床指标相关性的结果图。其中，图6A为研究样 本的临床试验数据和人口统计学特征：RA样本80例，其中男性17例，女性63例，平均年龄 45. 6岁，28个关节平均得分6. 3分，类风湿因子（RF)平均值127. 9IU/ml，C反应蛋白（CRP) 6. 9mg/ml，抗环瓜氨酸肽抗体（Anti-CCP)浓度63. 6U/ml，血沉（ESR) 27. 6mm/h ;正常人样 本65例，其中男性30例，女性35例；平均年龄40岁，血沉5. 8mm/h ;图6B为IL-37在类风 湿性关节炎患者血清中的表达，ELISA检测，与正常人(对照）相比，RA患者血清中IL-37表 达升高，具有显著差异性；图6C为IL-37在类风湿性关节炎患者PBMC的表达，qPCR检测， 与正常人相比，IL-37在RA患者PBMC中高表达且具有显著差异性；图6D显示IL-37在RA 患者血清表达升高与临床评分DSA28、C反应蛋白（CRP )、类风湿因子（RF)、血沉（ESR)、抗环 瓜氨酸肽抗体（Anti-CCP)显著正相关；IL-37在RA患者PBMC表达升高与临床评分DSA28、 C反应蛋白（CRP)、血沉（ESR)显著正相关；图6E显示IL-37抑制RA患者PBMC和血清中 TNF- a、IL-1 β、IL-6的表达且具有显著性差异；图6F显示IL-37抑制RA患者PBMC和血清 中TNF-α、IL-10、IL-6的表达与临床评分DSA28具有显著相关性；（*P〈0. 05 ;#P〈0. 01)。
[0084] 图7显示体外IL-37重组蛋白抑制RA患者免疫细胞炎性细胞因子表达的结果图。 其中，图7A为分离健康人、RA患者外周血单核细胞，流式细胞仪分选CD3+T细胞，分别加入 重组蛋白IL-37刺激6h，提取细胞RNA，qPCR检测，重组蛋白IL-37显著抑制RA患者CD3+T 细胞表达炎性细胞因子；图7B显示分离健康人、RA患者外周血单核细胞，流式细胞仪分选 CD4+T细胞，分别加入重组蛋白IL-37刺激6h，提取细胞RNA，qPCR检测，重组蛋白IL-37显 著抑制RA患者⑶4+T细胞表达炎性细胞因子；图7C显示分离健康人、RA患者外周血单核 细胞，流式细胞仪分选⑶8+T细胞，分别加入重组蛋白IL-37刺激6h，提取细胞RNA，qPCR检 测，重组蛋白IL-37对RA患者⑶8+T细胞表达炎性细胞因子没有显著影响；图7D显示分离 健康人、RA患者外周血单核细胞，流式细胞仪分选⑶19+B细胞，分别加入重组蛋白IL-37刺 激6h，提取细胞RNA，qPCR检测，重组蛋白IL-37对RA患者⑶19+B细胞表达炎性细胞因子 没有显著影响；（*P〈〇. 05 ;#P〈0. 01)。
[0085] 图8显示体外IL-37重组蛋白抑制SLE患者免疫细胞炎性细胞因子表达的结果 图。其中，图8A显示分离健康人、SLE患者外周血单核细胞，流式细胞仪分选CD3+T细胞，分 别加入重组蛋白IL-37刺激6h，提取细胞RNA，qPCR检测，重组蛋白IL-37显著抑制SLE患 者⑶3+T细胞表达炎性细胞因子；图8B显示分离健康人、SLE患者外周血单核细胞，流式细 胞仪分选⑶4+T细胞，分别加入重组蛋白IL-37刺激6h，提取细胞RNA，qPCR检测，重组蛋 白IL-37显著抑制SLE患者⑶4+T细胞表达炎性细胞因子；图8C显示分离健康人、SLE患者 外周血单核细胞，流式细胞仪分选⑶8+T细胞，分别加入重组蛋白IL-37刺激6h，提取细胞 RNA，qPCR检测，重组蛋白IL-37对SLE患者⑶8+T细胞表达炎性细胞因子没有显著影响；图 8D显示分离健康人、SLE患者外周血单核细胞，流式细胞仪分选⑶19+B细胞,分别加入重组 蛋白IL-37刺激6h，提取细胞RNA，qPCR检测，重组蛋白IL-37对SLE患者⑶19+B细胞表达 炎性细胞因子没有显著影响；（*P〈〇. 05 ;#P〈0. 01)。
[0086] 图9显示体外IL-37重组蛋白抑制AD患者免疫细胞炎性细胞因子表达的结果图。 其中，图9A显示分离健康人、AD患者外周血单核细胞，流式细胞仪分选CD4+T细胞，分别加 入重组蛋白IL-37刺激6h，提取细胞RNA，qPCR检测，重组蛋白IL-37显著抑制RA患者⑶4+T 细胞表达炎性细胞因子；图9B显示分离健康人、AD患者外周血单核细胞，流式细胞仪分选 CD8+T细胞，分别加入重组蛋白IL-37刺激6h，提取细胞RNA，qPCR检测，重组蛋白IL-37显 著抑制RA患者⑶8+T细胞表达炎性细胞因子；图9C显示分离健康人、AD患者外周血单核细 胞，流式细胞仪分选α β+Τ细胞，分别加入重组蛋白IL-37刺激6h，提取细胞RNA，qPCR检 测，重组蛋白IL-37对RA患者α β+Τ细胞表达炎性细胞因子没有显著影响；图9D显示分离 健康人、AD患者外周血单核细胞，流式细胞仪分选⑶llc+DC细胞，分别加入重组蛋白IL-37 刺激6h，提取细胞RNA，qPCR检测，重组蛋白IL-37对AD患者⑶llc+DC细胞表达炎性细胞 因子没有显著影响；（*P〈〇. 05 ;#P〈0. 01)。
[0087] 图10显示体IL-37外重组蛋白抑制⑶患者免疫细胞炎性细胞因子表达的结果 图。其中，图10A显示分离健康人、CD患者外周血单核细胞，流式细胞仪分选CD3+T细胞，分 别加入重组蛋白IL-37刺激6h，提取细胞RNA，qPCR检测，重组蛋白IL-37显著抑制⑶患 者CD3+T细胞表达炎性细胞因子；图10B显示分离健康人、CD患者外周血单核细胞，流式细 胞仪分选⑶4+T细胞，分别加入重组蛋白IL-37刺激6h，提取细胞RNA，qPCR检测，重组蛋 白IL-37显著抑制⑶患者⑶4+T细胞表达炎性细胞因子；图10C显示分离健康人、⑶患者 外周血单核细胞，流式细胞仪分选⑶8+T细胞，分别加入重组蛋白IL-37刺激6h，提取细胞 RNA，qPCR检测，重组蛋白IL-37对⑶患者⑶8+T细胞表达炎性细胞因子没有显著影响；图 10D显示分离健康人、⑶患者外周血单核细胞，流式细胞仪分选⑶19+B细胞,分别加入重组 蛋白IL-37刺激6h，提取细胞RNA，qPCR检测，重组蛋白IL-37对⑶患者⑶19+B细胞表达 炎性细胞因子没有显著影响；（*P〈〇. 05 ;#P〈0. 01)。
[0088] 图11显示体外IL-37重组蛋白抑制Psoriasis患者免疫细胞炎性细胞因子表达 的结果图。其中，图11A显示分离健康人、Psoriasis患者外周血单核细胞，流式细胞仪分选 CD4+T细胞，分别加入重组蛋白IL-37刺激6h，提取细胞RNA，qPCR检测，重组蛋白IL-37显 著抑制Psoriasis患者⑶4+T细胞表达炎性细胞因子；图11B显示分离健康人、Psoriasis 患者外周血单核细胞，流式细胞仪分选⑶8+T细胞，分别加入重组蛋白IL-37刺激6h，提取 细胞RNA，qPCR检测，重组蛋白IL-37显著抑制Psoriasis患者⑶8+T细胞表达炎性细胞因 子；图11C显示分离健康人、Psoriasis患者外周血单核细胞，流式细胞仪分选⑶3+T细胞， 分别加入重组蛋白IL-37刺激6h，提取细胞RNA，qPCR检测，重组蛋白IL-37对Psoriasis 患者⑶3+T细胞表达炎性细胞因子没有显著影响；图11D显示分离健康人、Psoriasis患者 外周血单核细胞，流式细胞仪分选⑶1 lc+DC细胞，分别加入重组蛋白IL-37刺激6h，提取细 胞RNA，qPCR检测，重组蛋白IL-37对Psoriasis患者⑶llc+DC细胞表达炎性细胞因子没 有显著影响；（*Ρ〈〇· 05 ;#Ρ〈(λ 01)。
[0089] 图12显示体外IL-37重组蛋白抑制MS患者免疫细胞炎性细胞因子表达的结果 图。其中，图12A显示分离健康人、MS患者外周血单核细胞，流式细胞仪分选CD4+T细胞，分 别加入重组蛋白IL-37刺激6h，提取细胞RNA，qPCR检测，重组蛋白IL-37显著抑制MS患 者⑶4+T细胞表达炎性细胞因子；图12B显示分离健康人、MS患者外周血单核细胞，流式细 胞仪分选⑶8+T细胞，分别加入重组蛋白IL-37刺激6h，提取细胞RNA，qPCR检测，重组蛋 白IL-37显著抑制MS患者⑶8+T细胞表达炎性细胞因子；图12C显示分离健康人、MS患者 外周血单核细胞，流式细胞仪分选⑶3+T细胞，分别加入重组蛋白IL-37刺激6h，提取细胞 RNA，qPCR检测，重组蛋白IL-37对MS患者⑶3+T细胞表达炎性细胞因子没有显著影响；图 12D显示分离健康人、MS患者外周血单核细胞，流式细胞仪分选⑶19+B细胞,分别加入重组 蛋白IL-37刺激6h，提取细胞RNA，qPCR检测，重组蛋白IL-37对MS患者CD19+B细胞表达 炎性细胞因子没有显著影响；（*P〈〇. 05 ;#P〈0. 01)。
[0090] 图13显示体外IL-37重组蛋白抑制asthma患者免疫细胞炎性细胞因子表达的结 果图。其中，图13A显示分离健康人、asthma患者外周血单核细胞，流式细胞仪分选⑶4+T 细胞，分别加入重组蛋白IL-37刺激6h，提取细胞RNA，qPCR检测，重组蛋白IL-37显著抑制 asthma患者⑶4+T细胞表达炎性细胞因子；图13B显示分离健康人、asthma患者外周血单 核细胞，流式细胞仪分选⑶8+T细胞，分别加入重组蛋白IL-37刺激6h，提取细胞RNA，qPCR 检测，重组蛋白IL-37显著抑制asthma患者⑶8+T细胞表达炎性细胞因子；图13C显示分 离健康人、asthma患者外周血单核细胞，流式细胞仪分选⑶3+T细胞，分别加入重组蛋白 IL-37刺激6h，提取细胞RNA，qPCR检测，重组蛋白IL-37对asthma患者⑶3+T细胞表达炎 性细胞因子没有显著影响；图13D显示分离健康人、asthma患者外周血单核细胞，流式细胞 仪分选CD19+B细胞，分别加入重组蛋白IL-37刺激6h，提取细胞RNA，qPCR检测，重组蛋白 IL-37对asthma患者CD19+B细胞表达炎性细胞因子没有显著影响；（*P〈0. 05 ;#P〈0. 01)。
[0091] 图14显示体外IL-37重组蛋白抑制diabetes患者免疫细胞炎性细胞因子表达 的结果图。其中，图14A显示分离健康人、diabetes患者外周血单核细胞，流式细胞仪分选 CD4+T细胞，分别加入重组蛋白IL-37刺激6h，提取细胞RNA，qPCR检测，重组蛋白IL-37显 著抑制diabetes患者⑶4+T细胞表达炎性细胞因子；图14B显示分离健康人、diabetes患 者外周血单核细胞，流式细胞仪分选⑶8+T细胞，分别加入重组蛋白IL-37刺激6h，提取细 胞RNA，qPCR检测，重组蛋白IL-37显著抑制diabetes患者⑶8+T细胞表达炎性细胞因子； 图14C显示分离健康人、diabetes患者外周血单核细胞，流式细胞仪分选CD3+T细胞，分别 加入重组蛋白IL-37刺激6h，提取细胞RNA，qPCR检测，重组蛋白IL-37对diabetes患者 ⑶3+T细胞表达炎性细胞因子没有显著影响；图14D显示分离健康人、diabetes患者外周血 单核细胞，流式细胞仪分选⑶19+B细胞，分别加入重组蛋白IL-37刺激6h，提取细胞RNA， qPCR检测，重组蛋白IL-37对diabetes患者CD19+B细胞表达炎性细胞因子没有显著影响； (*P〈0. 05 ;#P〈0. 01)。
[0092] 图15显示体外IL-37重组蛋白抑制TR患者免疫细胞炎性细胞因子表达的结果 图。其中，图15A显示分离健康人、TR患者外周血单核细胞，流式细胞仪分选CD3+T细胞，分 别加入重组蛋白IL-37刺激6h，提取细胞RNA，qPCR检测，重组蛋白IL-37显著抑制TR患 者⑶3+T细胞表达炎性细胞因子；图15B显示分离健康人、TR患者外周血单核细胞，流式细 胞仪分选⑶4+T细胞，分别加入重组蛋白IL-37刺激6h，提取细胞RNA，qPCR检测，重组蛋 白IL-37显著抑制TR患者⑶4+T细胞表达炎性细胞因子；图15C显示分离健康人、TR患者 外周血单核细胞，流式细胞仪分选⑶8+T细胞，分别加入重组蛋白IL-37刺激6h，提取细胞 RNA，qPCR检测，重组蛋白IL-37对TR患者⑶8+T细胞表达炎性细胞因子没有显著影响；图 1?显示分离健康人、TR患者外周血单核细胞，流式细胞仪分选⑶19+B细胞,分别加入重组 蛋白IL-37刺激6h，提取细胞RNA，qPCR检测，重组蛋白IL-37对TR患者CD19+B细胞表达 炎性细胞因子没有显著影响；（*P〈〇. 05 ;#P〈0. 01)。
[0093] 图16显示体外IL-37重组蛋白抑制Atherosclerosis患者免疫细胞炎性细胞因 子表达的结果图。其中，图16A显示分离健康人、atherosclerosis患者外周血单核细胞，流 式细胞仪分选⑶4+T细胞，分别加入重组蛋白IL-37刺激6h，提取细胞RNA，qPCR检测，重组 蛋白IL-37显著抑制atherosclerosis患者CD4+T细胞表达炎性细胞因子；图16B显示分离 健康人、atherosclerosis患者外周血单核细胞，流式细胞仪分选⑶8+T细胞，分别加入重组 蛋白IL-37刺激6h，提取细胞RNA，qPCR检测，重组蛋白IL-37显著抑制atherosclerosis 患者⑶8+T细胞表达炎性细胞因子；图16C显示分离健康人、atherosclerosis患者外周血 单核细胞，流式细胞仪分选⑶1 lc+DC细胞，分别加入重组蛋白IL-37刺激6h，提取细胞RNA， qPCR检测，重组蛋白IL-37对atherosclerosis患者CDllc+DC细胞表达炎性细胞因子没 有显著影响；图16D显示分离健康人、atherosclerosi患者s外周血单核细胞，流式细胞 仪分选⑶34+T细胞，分别加入重组蛋白IL-37刺激6h，提取细胞RNA，qPCR检测，重组蛋白 IL-37对atherosclerosis患者CD34+T细胞表达炎性细胞因子没有显著影响；（*P〈0. 05 ; **P〈0. 01)。
[0094] 图17显示体外IL-37重组蛋白抑制IBD患者免疫细胞炎性细胞因子表达的结果 图。其中，图17A显示分离健康人、IBD患者外周血单核细胞，流式细胞仪分选⑶3+T细胞， 分别加入重组蛋白IL-37刺激6h，提取细胞RNA，qPCR检测，重组蛋白IL-37显著抑制IBD 患者⑶3+T细胞表达炎性细胞因子；图17B显示分离健康人、IBD患者外周血单核细胞，流 式细胞仪分选⑶4+T细胞，分别加入重组蛋白IL-37刺激6h，提取细胞RNA，qPCR检测，重组 蛋白IL-37显著抑制IBD患者⑶4+T细胞表达炎性细胞因子；图17C显示分离健康人、IBD 患者外周血单核细胞，流式细胞仪分选⑶8+T细胞，分别加入重组蛋白IL-37刺激6h，提取 细胞RNA，qPCR检测，重组蛋白IL-37对IBD患者⑶8+T细胞表达炎性细胞因子没有显著影 响；图17D显示分离健康人、IBD患者外周血单核细胞，流式细胞仪分选⑶19+B细胞，分别 加入重组蛋白IL-37刺激6h，提取细胞RNA，qPCR检测，重组蛋白IL-37对IBD患者CD19+B 细胞表达炎性细胞因子没有显著影响；（*P〈〇. 05 ;**P〈0. 01)。
[0095] 图18显示体外IL-37重组蛋白抑制AS患者免疫细胞炎性细胞因子表达的结果 图。其中，图18A显示分离健康人、AS患者外周血单核细胞，流式细胞仪分选CD4+T细胞，分 别加入重组蛋白IL-37刺激6h，提取细胞RNA，qPCR检测，重组蛋白IL-37显著抑制AS患 者CD4+T细胞表达炎性细胞因子；图18B显示分离健康人、AS患者外周血单核细胞，流式细 胞仪分选⑶8+T细胞，分别加入重组蛋白IL-37刺激6h，提取细胞RNA，qPCR检测，重组蛋 白IL-37显著抑制AS患者⑶8+T细胞表达炎性细胞因子；图18C显示分离健康人、AS患者 外周血单核细胞，流式细胞仪分选⑶3+T细胞，分别加入重组蛋白IL-37刺激6h，提取细胞 RNA，qPCR检测，重组蛋白IL-37对AS患者⑶3+T细胞表达炎性细胞因子没有显著影响；图 18D显示分离健康人、AS患者外周血单核细胞，流式细胞仪分选⑶19+B细胞,分别加入重组 蛋白IL-37刺激6h，提取细胞RNA，qPCR检测，重组蛋白IL-37对IBD患者CD19+B细胞表达 炎性细胞因子没有显著影响；（*P〈〇. 05 ;#P〈0. 01)。
[0096] 图19显示体外IL-37重组蛋白抑制甲亢患者免疫细胞炎性细胞因子表达的结果 图。其中，图19A显示分离健康人、甲亢患者外周血单核细胞，流式细胞仪分选CD4+T细胞， 分别加入重组蛋白IL-37刺激6h，提取细胞RNA，qPCR检测，重组蛋白IL-37显著抑制甲亢 患者CD4+T细胞表达炎性细胞因子；图19B显示分离健康人、甲亢患者外周血单核细胞，流 式细胞仪分选⑶8+T细胞，分别加入重组蛋白IL-37刺激6h，提取细胞RNA，qPCR检测，重组 蛋白IL-37显著抑制甲亢患者⑶8+T细胞表达炎性细胞因子；图19C显示分离健康人、甲亢 患者外周血单核细胞，流式细胞仪分选⑶3+T细胞，分别加入重组蛋白IL-37刺激6h，提取 细胞RNA，qPCR检测，重组蛋白IL-37对甲亢患者⑶3+T细胞表达炎性细胞因子没有显著影 响；图19D显示分离健康人、甲允患者外周血单核细胞，流式细胞仪分选CD19+B细胞，分别 加入重组蛋白IL-37刺激6h，提取细胞RNA，qPCR检测，重组蛋白IL-37对甲亢患者⑶19+B 细胞表达炎性细胞因子没有显著影响；（*P〈〇. 05 ;**P〈0. 01)。
[0097] 图20显示体外IL-37重组蛋白抑制HT患者免疫细胞炎性细胞因子表达的结果 图。其中，图20A显示分离健康人、HT患者外周血单核细胞，流式细胞仪分选CD4+T细胞，分 别加入重组蛋白IL-37刺激6h，提取细胞RNA，qPCR检测，重组蛋白IL-37显著抑制HT患 者CD4+T细胞表达炎性细胞因子；图20B显示分离健康人、HT患者外周血单核细胞，流式细 胞仪分选⑶8+T细胞，分别加入重组蛋白IL-37刺激6h，提取细胞RNA，qPCR检测，重组蛋 白IL-37显著抑制HT患者⑶8+T细胞表达炎性细胞因子；图20C显示分离健康人、HT患者 外周血单核细胞，流式细胞仪分选⑶3+T细胞，分别加入重组蛋白IL-37刺激6h，提取细胞 RNA，qPCR检测，重组蛋白IL-37对HT患者⑶3+T细胞表达炎性细胞因子没有显著影响；图 20D显示分离健康人、HT患者外周血单核细胞，流式细胞仪分选⑶19+B细胞，分别加入重组 蛋白IL-37刺激6h，提取细胞RNA，qPCR检测，重组蛋白IL-37对HT患者CD19+B细胞表达 炎性细胞因子没有显著影响；（*P〈〇. 05 ;#P〈0. 01)。
[0098] 图21显示体外IL-37重组蛋白抑制AA患者免疫细胞炎性细胞因子表达的结果 图。其中，图21A显示分离健康人、AA患者外周血单核细胞，流式细胞仪分选CD3+T细胞，分 别加入重组蛋白IL-37刺激6h，提取细胞RNA，qPCR检测，重组蛋白IL-37显著抑制AA患 者CD3+T细胞表达炎性细胞因子；图21B显示分离健康人、AA患者外周血单核细胞，流式细 胞仪分选⑶8+T细胞，分别加入重组蛋白IL-37刺激6h，提取细胞RNA，qPCR检测，重组蛋 白IL-37显著抑制AA患者⑶8+T细胞表达炎性细胞因子；图21C显示分离健康人、AA患者 外周血单核细胞，流式细胞仪分选⑶4+T细胞，分别加入重组蛋白IL-37刺激6h，提取细胞 RNA，qPCR检测，重组蛋白IL-37对AA患者⑶4+T细胞表达炎性细胞因子没有显著影响；图 21D显示分离健康人、AA患者外周血单核细胞，流式细胞仪分选⑶19+B细胞,分别加入重组 蛋白IL-37刺激6h，提取细胞RNA，qPCR检测，重组蛋白IL-37对AA患者⑶19+B细胞表达 炎性细胞因子没有显著影响；（*P〈〇. 05 ;#P〈0. 01)。

【具体实施方式】
[0099] 下面通过【具体实施方式】并结合实施例和附图，对本发明的
【发明内容】
做详细描述和 解释说明。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学名词与本领域技术人员通常理解的 意义相同。尽管与本文描述相类似或等同的方法和材料可以用于权利要求的实施或测试， 以下描述了合适的方法和材料。文中提到的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均 通过引用全文并入本文。有冲突的情况中，由本说明书包括定义在内来决定。此外，这些材 料、方法和实例仅用于说明并非意在限制。
[0100] 1、本发明的白细胞介素37、其衍生物、变异体和/或截短多肽
[0101] 本发明的白细胞介素37 (IL-37)作广义的理解，是指与SEQ ID NO :1所示的氨 基酸序列具有相同或相似活性的氨基酸序列、多肽或者蛋白质。并不局限于特定的氨基酸 序列。但是最优选地，是指SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列（该序列是genbank登录号为 NP_055254的蛋白质的46-218位氨基酸，也就是去除前端信号肽后的部分)，当然本发明的 IL-37也可以是指登录号为NP_055254的蛋白质，因为本领域的技术人员知道其前端信号 肽并不影响后面的肽段（46-218位氨基酸）发挥功能。
[0102] 本发明的IL-37衍生物作广义的理解，是指如SEQ ID N0 :1所示的氨基酸序列取 代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸并具有与SEQ ID N0 :1所示的氨基酸序列相同或相 似活性的氨基酸序列。
[0103] 所述取代、缺失和/或插入一个或几个氨基酸而获得具有相同功能的衍生物的技 术是本领域技术人员公知的，例如可以是进行非极性氨基酸间或是极性氨基酸间的取代。
[0104] 具体地，取代可以为保守性取代，即在不实质性改变与原有序列的结构有关的特 征的基础上，将特定的氨基酸残基用具有类似的物理化学特征的残基取代。例如，只要取代 氨基酸不破坏原有序列中存在的螺旋结构，或不破坏赋予原有序列特征的其他种类的二级 结构，可为任何取代。
[0105] 保守性取代一般可用生物学体系合成(细胞表达)或化学肽合成导入。通过化学肽 合成来进行时，取代基中可含有非天然的氨基酸残基，也可含有肽模仿物。
[0106] 更具体地，保守性取代典型但非限定性的例子可以是下列各组氨基酸的组内氨基 酸间的互相取代：亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋 氨酸、0-甲基丝氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸及环己基丙氨酸组成的组；天冬氨酸、 谷氨酸、异天冬氨酸、异谷氨酸、2-氨基己二酸及2-氨基辛二酸组成的组；天冬酰胺及谷氨 酰胺组成的组；赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2,4-二氨基丁酸及2, 3-二氨基丙酸组成的组；脯 氨酸、3-羟基脯氨酸及4-羟基脯氨酸组成的组；丝氨酸、苏氨酸及高丝氨酸组成的组；苯丙 氨酸及酪氨酸组成的组。此外，上述组中的某一种氨基酸可与其它组的氨基酸互换，为保持 本发明的蛋白质的生物学功能，可以参考氨基酸的亲水指数（Kyte等，J. Mol. Biol.，157 : 105-131(1982))。
[0107] -般来讲，与SEQ ID N0 :1所示的氨基酸序列同源性越高的多肽或者蛋白质，其生 物学活性与SEQ ID N0 :1所示的氨基酸序列越相近，比如可以是与SEQ ID N0 :1所示的氨 基酸序列具有约90%以上、91 %以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、 97%以上、98 %以上、99 %以上、99. 1 %以上、99. 2 %以上、99. 3 %以上、99. 4%以上、99. 5% 以上、99. 6%以上、99. 7%以上、99. 8%以上、99. 9%以上同源性的氨基酸序列。
[0108] 本发明的IL-37的衍生物包括在SEQ ID N0 :1所示的氨基酸序列的基础上添加氨 基酸得到的多肽，例如N端添加 CS、GSRDDDK、GSRIEGR或其他添加或替代的序列。本发明还 可能包括添加利于纯化的多肽序列，例如剪切识别序列（凝血酶、肠激酶或因子Xa识别序 列)。
[0109] 本发明的IL-37的变异体作广义的理解，是指白细胞介素37或其衍生物连接糖和 /或脂肪PEG修饰侧链得到的功能与白细胞介素37相同或相似的修饰肽。蛋白质连接糖侧 链得到糖蛋白，连接脂肪PEG修饰侧链得到脂蛋白，因此本发明的修饰肽相应可以是糖蛋 白（或糖肽）或者脂蛋白（或脂肽)。
[0110] 所谓糖蛋白，针对本发明是指白细胞介素37或其衍生物加成至少1个糖链得到 的，并无特别限定，只要所加成的糖链对本发明的白细胞介素37或其衍生物的生物学活性 没有负面影响即可。优选实施方式中，本发明的糖蛋白，为具有N结合型糖链或0结合型糖 链的糖蛋白质。糖蛋白中，糖链与蛋白质中的氨基酸残基，可为直接结合，也可为通过连结 子（linker)而结合。糖链与氨基酸的结合部位并无特别限制，优选为在糖链的还原末端结 合氨基酸。
[0111] 所谓脂蛋白，针对本发明是指白细胞介素37或其衍生物加成至少1个脂肪链得到 的，并无特别限定，只要所加成的脂肪链对本发明的白细胞介素37或其衍生物的生物学活 性没有负面影响即可。
[0112] 本发明的IL-37的截短多肽作广义的理解，是指包括如SEQ ID N0 :1中部分氨基 酸序列的活性片段的截短多肽，具体的可以是指在SEQ ID N0 :1所示的氨基酸序列的N端 或者C端缺少一个或者多个氨基酸得到的、与SEQ ID N0 :1所示的氨基酸序列相比其生物 学活性没有实质性改变的多肽。
[0113] 2、本发明的编码白细胞介素37或其衍生物的核苷酸序列
[0114] 本发明编码白细胞介素37或其衍生物的核苷酸序列可以完全相同于如SEQID N0 :2所示的核苷酸序列，也可以由于遗传密码的简并性，不完全等同于上述核苷酸的编码 序列。例如，根据每个具体的原核宿主或者真核宿主所使用的密码子的频率不同，可以选择 相应的密码子，从而提高所述的多核苷酸在相应的宿主中表达效率。也可以为了获得比天 然的核苷酸序列具有更好性能的核苷酸序列(如更长的半衰期）而转换密码子。
[0115] 需要注意的是，本发明的如SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列编码如SEQ IDN0:1所 示的氨基酸序列。但是，如上所述，本发明白细胞介素37还可以产生出其衍生物和截短多 肽，因此本发明的核苷酸序列还包括任何编码其衍生物和截短多肽的核苷酸序列。
[0116] 本发明所提供的白细胞介素37或其衍生物及编码白细胞介素37或其衍生物的核 苷酸序列，是分离的蛋白或其免疫性片段及核苷酸序列。所述"分离的"是指物质从其原始 环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态 下的核苷酸或蛋白或多肽氨基酸序列是没有分离纯化的，但同样的核苷酸或蛋白或多肽如 果从天然状态中与共同存在的其它物质分开，则为分离纯化的。这样的核苷酸可能是某一 载体的一部分，也可能这样的核苷酸或蛋白或多肽是某一组合物的一部分，既然载体或组 合物不是它们的天然环境的成分，这些核苷酸或蛋白多肽仍然是分离的。
[0117] 本发明的核苷酸序列能用本领域已有的方法获得。这些技术包括但不局限于： (1)人工化学合成DNA序列；（2)通过构建cDNA文库而获得所需的核苷酸序列；（3)PCR扩 增技术。例如，本发明的编码IL-37的核苷酸序列可以依据标准的PCR扩增技术将cDNA、 mRNA或者基因组DNA作为模板，并选取合适的寡核苷酸引物扩增得到。这样得到核苷酸可 以克隆至合适的载体中，然后利用在所述载体中的复制得到。也可以通过标准DNA合成技 术得到，例如，使用可以按本领域熟知的固相亚磷酸酰胺三酯法在DNA合成仪上合成。
[0118] 本发明的编码白细胞介素37或其衍生物的核苷酸序列可以插入适合的载体中组 成重组载体，本发明的重组载体可以是普通载体或表达载体等。其中普通载体主要用于各 种基因组文库和cDNA文库的建立。表达载体主要用于研究基因的表达或是用于大量生产 一些有用的转录产物或蛋白质，表达载体中应含有适当的启动子、核糖体结合位点和终止 子等。为了便于表达的产物在细胞中定位，在多肽编码序列上游可加入适当的前导序列。 必要时，为了提高编码本发明白细胞介素37或其衍生物的DNA在高等真核细胞中的转录效 率，可在载体中插入增强子序列。合适载体和启动子的选择为本领域技术人员周知。具体 地，术语"载体"指本领域熟知的质粒、粘粒、人工染色体、腺病毒、慢病毒或噬菌体。
[0119] 粘粒又称柯斯质粒（Cosmid)，是一类由人工构建的含有λ DNA粘性末端cos序列 和质粒复制子的杂种质粒载体。它是为克隆和增殖真核基因组DNA的大区段而设计的，是 组建真核生物基因文库及从多种生物中分离基因的有效手段。
[0120] 人工染色体（artificial chromosome)指人工构建的含有天然染色体基本功能单 位的载体系统。包括酵母人工染色体（YAC)、细菌人工染色体（BAC)、P1派生人工染色体 (PAC)、哺乳动物人工染色体(MAC)和人类游离人工染色体（HAEC)。
[0121] 本发明编码白细胞介素37或其衍生物的核苷酸序列或包含所述核苷酸序列的重 组载体负载于脂质体中，通过脂质体进行转运进入细胞，然后从脂质体中释放出来，在细胞 内表达白细胞介素37或其衍生物，并发挥相应功能。
[0122] 脂质体（liposome)是一种人工膜，在水中磷脂分子亲水头部插入水中，脂质体疏 水尾部伸向空气，搅动后形成双层脂分子的球形脂质体，直径25?lOOOnrn不等。脂质体可 用于转基因，或制备的药物，利用脂质体可以和细胞膜融合的特点，将药物送入细胞内部。 药剂学定义脂质体（liposome)是指将药物包封于类脂质双分子层内而形成的微型泡囊 体。
[0123] 目前，已经由很多转运核酸类药物的脂质体开发出，可以应用于本发明进行对编 码白细胞介素37或其衍生物的核苷酸序列或包含所述核苷酸序列的重组载体的转运。比 如，美国专利申请公布号US2010/0151573A1，及中国发明专利申请公布号CN103194489A、 CN1473621A和CN101120921A，均公开了相应的脂质体类型的药物转运载体。
[0124] 本发明的药物活性成分还可以通过适合的肿瘤靶向药物载体系统进行转运，比如 生物大分子(例如血清蛋白、脂蛋白、纤维蛋白原和运铁蛋白等)、合成大分子及单克隆抗体 等大分子载体系统，脂质体、纳米微粒、乳剂、微泡及微球等微粒载体系统。
[0125] 在药物运输系统中，靶向载体是近年来的热点，目前可作为主动靶向的靶向载体 有抗体、多肽、叶酸、多糖和核酸适体等，本发明的药物活性成分也可以通过上述靶向载体 进行转运，实现靶向给药的目的，提高给药靶向性和药效的最优化。
[0126] 3、本发明的宿主细胞及蛋白表达、纯化
[0127] 本发明的编码白细胞介素37或其衍生物的核苷酸序列或者包含所述核苷酸序列 的重组载体可以转化适当的宿主细胞，以使其能够表达人类分泌性细胞因子的蛋白质。该 宿主包括但不限于：原核宿主，例如大肠杆菌、芽孢杆菌属和链霉菌属等；真核宿主，诸如： 酵母属、曲霉属、昆虫细胞(例如果蝇S2和草地夜蛾Sf9)、植物细胞（比如来源于菜籽、大 豆、棉花、红花或亚麻等油料作物的细胞）和动物细胞的细胞系。
[0128] 典型但非限定性的大肠杆菌，包括：大肠杆菌K-12菌株(诸如大肠杆菌C600、 ATCC23724、大肠杆菌 HB101NRRLB-11371、ATCC-33694 等）。
[0129] 典型但非限定性的酵母细胞，包括酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、粟酒 裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe)、汉逊酵母属（Hanseula)或巴氏毕赤酵母（Pichia pastoris)。
[0130] 典型但非限定性的哺乳动物宿主细胞系，包括：C0S_7系猴肾细胞、L细胞、C127细 胞、3T3细胞、中国仓鼠卵巢（CH0)细胞、HeLa细胞和BHK细胞系等。
[0131] 将含有本发明的核苷酸序列的重组载体导入上述宿主细胞的方法是本领域技术 人员公知的，包括但不限于：氯化钙介导的转化、脂质体转化、磷酸钙转染、DEAE-15葡聚糖 介导的转染、电穿孔、显微注射、粒子轰击法或基因枪方法（Sambrook，J. (1989)，Molecular Cloning，a Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press)，在适当的培养条件与培养基 中培养经转化的宿主菌株或细胞，使其生长到恰当的细胞密度之后，用适当的方法(例如温 度转变或化学药品诱导)诱导所选择的启动子，并将细胞再培养一段时间。针对不同的宿主 菌株或细胞以及所表达的目的蛋白或多肽的性质选择相应的培养条件和培养基在本领域 技术人员知识范围之内。当宿主细胞为原核细胞如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞 可在指数生长期后收集，用CaCl 2法处理，所用步骤是本领域众所周知的，也可用电穿孔的 方法处理。当宿主是真核细胞时，可选择以下转染方法：磷酸钙共沉淀法、常规机械方法如 显微注射、电穿孔、脂质体包装等。获得的转化子可以用常规方法培养，来表达本发明的核 苷酸序列所编码的蛋白或多肽。
[0132] 本发明还提供一种生产白细胞介素37或其衍生物的方法：在适于表达的条件下， 培养含有编码本发明的核苷酸序列或其片段的宿主细胞；从所述细胞培养物中获得核苷酸 序列编码的蛋白或多肽。上述方法中的重组蛋白或多肽可包被于细胞内、细胞外或在细胞 膜上表达或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方 法分离和纯化重组蛋白或多肽。具体地说，在转化宿主细胞并在被转化的宿主细胞生长到 适当的细胞密度后，用适当的方法(如温度变动或化学特质诱导）诱导启动子，然后继续培 养。
[0133] 培养完成后，可用离心法收集细胞，并用任何已知的方法，这些方法是本领域技术 人员所熟知的，如冻融法、超声处理法、渗透破菌、溶菌酶溶解法或机械破碎法破碎细胞。可 以用各种已知的方法从宿主细胞培养物中回收和纯化本发明的蛋白或多肽或其片段或融 合蛋白或多肽，这些方法包括硫酸铁或乙醇沉淀法、酸萃取法、超离心、超滤法、离子交换层 析法、磷酸纤维层析法、疏水相互作用层析法、凝胶过滤法、亲和层析法、高效液相层析和其 它各种液相层析技术或这些方法的结合。
[0134] 4、药学上可接受的载体
[0135] 本发明提到的药学上可接受的载体是指对本发明活性成分（白细胞介素37、其衍 生物、变异体和/或截短多肽，或者它们的编码序列）具有载运作用、保护作用或其他作用 的成分。具体可以是指无毒的载体、佐剂或媒介物，其不会破坏与其一起配制的活性成分的 药理学活性。可用于本发明组合物中的药学上可接受的载体、佐剂或媒介物包括，但不限 于：离子交换剂，氧化铝，硬脂酸铝，卵磷脂，血清蛋白例如人血清白蛋白，缓冲物质如磷酸 盐类，甘氨酸，山梨酸，山梨酸钾，饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物，水，盐类或电解质类 例如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐，胶体二氧化硅，三硅酸镁，聚乙烯 吡咯烷酮，基于纤维素的物质，聚乙二醇，环糊精类，羧甲基纤维素钠，聚丙烯酸酯类，蜡类， 聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段共聚物，聚乙二醇和羊毛脂。
[0136] 特别地，由于本发明的活性成分白细胞介素37、其衍生物、变异体和/或截短多肽 属于蛋白类物质，因此药学上可接受的载体优选包括蛋白稳定剂。此外，上述的脂质体也可 以认为是核酸类药物的药学上可接受的载体；赋形剂和其它有利于活性成分混合于制备剂 利于药物服用的成分也属于药学上可接受的载体。
[0137] 本发明的药物的制备方法可以是将本发明活性成分（白细胞介素37、其衍生物、变 异体和/或截短多肽，或者它们的编码序列)与上述药学上可接受的载体进行适当混合得到 药物制剂。制备药物制剂的方法是本领域技术人员公知的。
[0138] 5、本发明的药物服用方法及制剂形式
[0139] 本发明提供的方法制备的药物服用方法可以是口服（oral)或非肠胃服用 (parenteral，又称胃肠外服用）。所述非肠胃服用方法包括局部、关节腔、动脉、肌肉内、皮 下、骨髓内、囊内、心室内、静脉、腹膜内、粘膜或鼻腔注射等方式。
[0140] 口服药物组合物可用本领域中药学上可接受的载体制备适当的口服剂量。这些载 体使药物组合物以药丸、药片、注射剂、胶囊、液体、胶体、糖衣丸、糖浆、浆体、悬浮液或其它 适合吸收的形式制备。
[0141] 口服药物组合物可以通过活性成分与固体赋形剂混合得到，可通过研磨目标混合 物，加工成小颗粒混合物，如果需要可添加适宜的其他化合物获得药片或糖衣丸核心。合适 的赋形剂包括碳水化合物或蛋白填装物，如糖(乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇）；淀粉(来 源玉米、小麦、大米、马铃薯或其他植物）；纤维素（甲基化纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲 基纤维素钠）;粘胶(阿拉伯树胶或黄芪胶）;蛋白（明胶或胶原)。如果需要，可以添加分散剂 和可溶剂，如(交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、海藻酸或及其相应的盐类)。
[0142] 糖衣丸核心可带有合适的外衣，如浓糖汁(阿拉伯胶、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝 胶、聚乙二醇、二氧化钛、适宜的有机溶解剂或混合溶解剂)。染色剂和色素也可能被添加到 药片或糖衣丸外衣，利于产品的鉴定或标明活性化合物的剂量。
[0143] 用于口服的包括由凝胶组成的推进式（push-fit)胶囊，还有由凝胶和外衣(如甘油 或山梨醇）组成软的、密封的胶囊。push-fit胶囊可包括活性成分以及填充剂和结合剂（乳 糖或淀粉）和合适的稳定剂。在软胶囊中，这些活性成份可溶解或悬浮在适宜的液体中，如 脂肪油、液体石蜡、含有或不含有稳定剂的液体聚乙二醇。
[0144] 非肠胃形式服用的药物形式包括活性化合物的水溶物。用于注射，本发明的药物 组合物制备成水溶液形式，优选的在生理相容的缓冲液中，如Hanks' s溶液、Ringer' s溶 液或生理盐水。水悬浮液注射剂可包含增加悬浮液粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨醇 和右旋糖酐。另外，活性成份的悬浮液可制备成合适的油状悬浮液注射剂。合适的亲脂性 溶剂或载体包括脂肪油（芝麻油)，或合成脂肪酸酯(油酸乙酯或甘油三酸酯）或脂质体。可 选的，所述悬浮液也可含有适宜的稳定剂或增加化合物的可溶性以利于成高浓度溶液。药 物组合物也可包含辅佐剂增强或调整免疫原性。
[0145] 局部或鼻腔注射服用，针对特殊屏障的渗透剂可被添加在药物制备剂中。
[0146] 本发明的药物成分可根据行业标准的生产流程进行大批量生产。
[0147] 本发明的药物组合物可任选地包括常规的防腐剂例如季铵盐（如苯扎氯铵和苄 索氯铵），葡萄糖酸氯己定，对羟基苯甲酸酯（如对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯）， 以及醇化合物（如氯丁醇和苯甲醇）；和/或稳定剂如不含无机阳离子的抗坏血酸和生育 酚。
[0148] 本发明对活性成分在药剂中的含量，没有特别限制，只要发挥对文中所提到的疾 病中的一种或任意多种的治疗或预防效果即可，并且可以根据每天优选的活性成分摄入量 适当确定，该量优选为0. 0005至100质量％，更优选为0. 005至90质量％，并且特别优选 为0.05至80质量％。
[0149] 本发明的药物组合物的给药剂量和给药时间没有限制，可以是根据患者年龄、患 者症状的严重性和其他条件等适当选择。
[0150] 本发明的药物可以以单活性成分形式给予，或与其它药物组合给予。与并用药物 组合的给药形式没有特别限制，只要在给药的时候本发明活性成分与并用药物组合就是可 以接受的。
[0151] 6、本发明的药物的适用对象：
[0152] 本发明的药物适用于患有自身免疫或慢性非感染性炎症疾病的病人，包括但不限 于患有类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、特应性皮炎、银屑病、克罗恩病、多发性硬化、哮喘、 糖尿病、移植排斥、动脉粥样硬化、炎症性肠疾病、强直性脊柱炎、甲亢、乔本氏甲状腺炎或 再生障碍性贫血的病人，也适用于遗传显示的上述疾病的高发生风险的人群，还适用于患 有相关疾病的动物(如狗、猫、牛、马、猪、绵羊、山羊、猴、兔、小鼠、大鼠、仓鼠等)，包括用人 工建模方法产生的患有相关疾病的动物。
[0153] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理 解，以下实施例仅为本发明的优选实施例，以便于更好地理解本发明，因而不应视为限定本 发明的范围。对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化，凡在本发明的精 神和原则之内，所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，《分子克隆 实验指南》（第三版）（Cold Spring Harbor Laboratory (CSHL)Press，2〇01)中所述的条 件，或按照制造厂商所建议的条件。所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂 厂商购买得到的。
[0154] 1实验材料来源：
[0155] 1.1质粒和菌种：
[0156] 原核表达载体 pET-32a、pET-28a、pGEX-4T-l 和 pGEX-6P-2 购于 Invitrogen 公司； E.coli Trans T1克隆菌、大肠杆菌Transetta(DE3)、大肠杆菌origami (DE3)、大肠杆菌 Rosetta-gamiB(DE3)均购于北京全式金生物技术有限公司。
[0157] 1. 2主要试剂和工具酶：
[0158] 质粒DNA小量提取试剂盒和DNA胶纯化试剂盒购于生工生物工程(上海)股份有限 公司；Taq酶、DNA marker购于北京全式金生物技术有限公司；蛋白Marker购于Fermentas 公司；限制性内切酶BamH I和Hind III、T4连接酶均购于Takara公司。
[0159] 1.3 鼠：
[0160] 鼠（Mouse)来源于美国 Jackson lab。
[0161] 1.4主要仪器：
[0162] 电泳仪（A101439, BI0-RAD，美国）
[0163] 超纯水系统（Classic DI，ELGA，英国）
[0164] 突光定量 PCR 仪（7500fast，Applied Biosystem，美国）
[0165] 制冰机（SANYO,日本）
[0166] 倒置突光显微镜（Olympus,日本）
[0167] 激光扫描共聚焦显微镜（Leica，德国）
[0168] 流式细胞仪（BD，美国）
[0169] 离心机（Thermo Scientific，德国）
[0170] PCR 扩增仪（BI0-RAD，美国）
[0171] 转膜仪（BI0-RAD，美国）
[0172] 凝胶成像系统（Carestream，美国）
[0173] 二氧化碳孵育箱（Thermo Froma，美国）
[0174] 加样器（Eppendorf，德国）
[0175] 琼脂糖凝胶水平电泳槽（BI0-RAD，美国）
[0176] ffesten blot 垂直电泳槽（BI0-RAD，美国）
[0177] 加热磁力搅拌器（IKAC-MAG，德国）
[0178] -80°C冰箱(海尔，中国）
[0179] -20°C冰箱(海尔，中国）
[0180] 4 °C冰箱(海尔，中国）
[0181] 超净工作台（苏州苏洁净化设备有限公司，中国）
[0182] 电子分析天平（ALC-210. 3,赛多利斯科学仪器(北京）有限公司，中国）
[0183] 电子分析天平（ATL-124-I，赛多利斯科学仪器(北京）有限公司，中国）
[0184] 酶标仪（RT-2100C，深圳雷杜生命科学股份有限公司，中国）
[0185] 液氮罐（100Z5449,乐山市东亚机电工贸有限公司，中国）
[0186] 通风橱（JC，广州庄齐实验室工程有限公司，中国）。
[0187] 2具体实施例：
[0188] 实施例1 :牛II型胶原蛋白的提取和鉴定
[0189] (1)牛II型胶原蛋白的提取
[0190] 1)研磨：取新鲜牛软骨，去骨膜切成薄片，液氮冷冻研磨(软骨研磨的越碎越均匀， 最终牛II型胶原蛋白的产率就越高)。
[0191] 2)盐酸胍消化：10倍体积的4M盐酸胍混悬后，于4°C下搅拌24h后，5000rpm离心 20min，弃上清，收集沉淀(盐酸胍能够除去软骨中大量的多糖蛋白）。
[0192] 3)胃蛋白酶消化：沉淀用0. 5M Tris-HCl和0. 5M乙酸充分洗涤后，用5倍体积的 胃蛋白酶消化液混悬，4°C搅拌48h，5000rpm离心30min，收集上清液，用5M NaOH溶液调节 上清液至PH7. 5 (胃蛋白酶消化过程中pH应控制在2-3之间，这样胃蛋白酶才能充分发挥 其酶活力)。
[0193] 4)盐析：加入200mM NaCl溶液，使其浓度逐渐达到3M，4°C盐析过夜，离心得到沉 淀用0. 5M乙酸溶解后，2M NaOH溶液调PH至7. 5。
[0194] 5)透析：用50mM Tris-HCl透析平衡，取透析液4°C下，5000rpm离心30min，弃上 清，收集沉淀，沉淀用TBS溶液（50mM Tris-HCl buffer+200mM NaCl，pH7. 5)溶解即得牛II 型胶原蛋白粗提液(牛II型胶原蛋白不溶于50mM Tris-HCl buffer中，形成乳池液，通过 离心可以除去溶解在缓冲液中的杂蛋白）。
[0195] 6)离子交换层析：离心收集得到的牛II型胶原蛋白粗提液上样到已用TBS缓冲 液平衡的HiTrap Q HP柱，最后用NaCl溶液洗脱；在228nm下检测样品的光吸收值；收集得 到的样品最后用3M NaCl溶液盐析沉淀；离心得到的沉淀进行SDS-PAGE电泳检测。
[0196] 7)检测提取的牛II型胶原蛋白浓度，用冻干机冻干，_20°C保存备用。
[0197] (2 ) SDS-PAGE 电泳检测
[0198] 配制蛋白胶：浓缩胶浓度5% (pH6. 8)，分离胶浓度12% (pH8. 8)，分别取胃蛋白酶 消化、透析、离子交换层析后的样品SDS-PAGE电泳检测。
[0199] 实施例2 :RA动物模型的建立
[0200] (1)胶原乳剂的制备
[0201] 将一定量的牛II型胶原蛋白加入0. 1M冰醋酸溶液中，浓度为2. 5mg/ml，置于4°C 冰箱过夜乳化；乳化好的胶原，冰上等体积充分混合含结核杆菌的弗氏完全佐剂CFA，使之 乳化完全，即得胶原乳剂。乳化完全的标准：滴在水上乳滴不扩散；一般至少要乳化2小时， 如果滴在水上扩散了应该继续乳化。
[0202] (2)免疫致敏
[0203] 取8到10周龄雄性实验小鼠，保持在24°C ±2°C，12小时光/暗周期的SPF级动 物房。
[0204] DBA小鼠免疫：DBA小鼠麻醉后，每只小鼠尾部皮下注射胶原乳剂共100 μ 1，第21 天进行胶原乳剂二次加强免疫（1〇〇μ 1/只)，对照组（control)小鼠注射同体积的生理盐 水。
[0205] (3)结果
[0206] 实验小鼠进行两次胶原乳剂注射后，28天开始发病，建立RA动物模型。
[0207] 实施例3 :牛II型胶原蛋白诱导RA动物模型的评价：
[0208] (1) 一般情况观察
[0209] 在建模期间观察不同组别小鼠的生长情况，观察小鼠的膝关节、踝关节、足爪和足 垫有无发热和肿胀，有无行走障碍，隔天仔细观察一次并详细记录观察结果，统计小鼠发病 情况，计算小鼠的发病率。
[0210] (2)关节炎指数评分
[0211] 参照文献（Deng GM, Zheng L, Chan FK, Lenardo M. Amelioration of inflammatory arthritis by targeting the pre-ligand assembly domain of tumor necrosis factor receptors[J]· Nature medicine. 2005, 11 (10) :1066-1072)的方法米用 关节炎评分法（0-3级)分别对实验小鼠评分。关节炎评分标准为：0分一关节无红肿；1分一 关节轻度肿胀和红斑；2分一关节明显肿胀；3分一关节严重肿胀不能负重；每只小鼠的四 肢总评分后求平均值，即为关节平均临床得分。
[0212] 实施例4 :小鼠标本的采集和处理
[0213] (1)血清的采集和PBMC分离
[0214] 建模完成后，用无水乙醚麻醉小鼠，采用摘眼球取血的方法取血，部分全血于 2500rpm离心15min后，取上清置于新的离心管中，-80°C保存备用。
[0215] 部分全血用枸橼酸钠抗凝剂抗凝（1 :9)，将抗凝血先与生理盐水1:1轻轻混匀，用 无菌吸管轻轻加在等量小鼠外周血淋巴细胞分离液上，2500rpm离心15min，小心吸取白膜 层，加生理盐水lOOOrpm离心5min洗两次，即得PBMC，提取RNA，用于后续相关试验。
[0216] (2)膝关节和踝关节的采集
[0217] 建模完成后，用锐利的手术剪刀剪取适中长度的小鼠膝关节和踝关节，迅速浸于 甲醛溶液中固定20小时，用7%硝酸脱钙液脱钙1-2天至针刺组织无抵抗为止，用于后续石 蜡切片。部分膝关节浸于甲醛溶液4°C放置过夜(不断搅拌)，加14%EDTA，4°C不断搅拌5天 (每24小时更换新鲜的EDTA)，制作冰冻切片。在脱钙过程中禁盖瓶盖，以使脱钙过程中产 生的C0 2气体溢出。
[0218] (3)脾脏的采集
[0219] 实验小鼠建模完成后，用无水乙醚麻醉小鼠，用手术剪分离脾脏，拍照，称重。
[0220] (4)滑膜组织采集和滑膜巨噬细胞分离
[0221] 建模完成后，用无水乙醚麻醉小鼠，剥离膝关节，露出膝盖骨，继续向下分离，可见 平滑的滑膜，用手术刀分离关节囊的滑膜层和纤维层，然后取出滑膜层组织。部分滑膜组织 用于提取总蛋白和核蛋白，部分滑膜组织用于提取RNA。部分滑膜用PBS清洗，剪碎，用II 胶原酶37°C消化1-1. 5小时，lOOOrpm离心5min离心取上清，-20°C保存备用。离心后收集 细胞，加 RPMI-1640完全培养基培养2h，去除培养基，加胰酶消化贴壁细胞3min，收集细胞 加 RPMI-1640完全培养基继续培养，即为巨噬细胞，部分提取RNA和蛋白，部分用于细胞免 疫荧光等后续相关试验。
[0222] (5)关节腔滑膜液采集和巨噬细胞的分离
[0223] 建模完成后，用无水乙醚麻醉小鼠，取带股骨和胫骨的膝关节，小心剔除肌肉和连 接组织，吸取200 μ 1的PBS反复冲洗关节腔，收集关节腔的溶液1500rpm离心3min，收集 上清置于EP管中，-20°C保存备用。离心后加 RPMI-1640完全培养基培养2h，去除培养基， 加胰酶消化贴壁细胞3min，收集细胞lOOOrpm离心5min，用RPMI-1640培养基洗3次，力口 RPMI-1640完全培养基培养基继续培养，即为关节腔巨噬细胞培养部分用于流式分析和细 胞免疫荧光，部分提取RNA和蛋白用于后续相关试验。
[0224] (6)腹腔巨噬细胞的收集
[0225] 颈椎脱臼法处死小鼠，将小鼠腹面朝上固定于解剖台上，以70%酒精消毒；用剪刀 在尾侧腹部皮肤上剪一小切口，撕开皮肤暴露下层腹壁；70%酒精消毒腹壁，用镊子稍提起 腹壁，以5ml或10ml注射器从尾侧脂肪较多部位向腹腔注射10ml不完全1640培养液(用 lml注射器的针头，斜面朝上刺入);移去固定针，轻轻摇动鼠体2-3min，并按摩腹壁；用镊子 稍提起腹壁，以5ml或10ml注射器从腹部两侧脂肪较少部位进针(用5ml注射器的针头，斜 面朝上刺入后旋转180度)，吸取腹腔灌洗液，将收集的细胞悬液置于冰的离心管，1500rpm 离心3min，用RPMI-1640培养基洗3次，加 RPMI-1640完全培养基培养基继续培养，用于体 外试验的相关检测。
[0226] 实施例5 :分离人PBMC细胞的cDNA
[0227] (1)全血的采集和PBMC分离
[0228] 本研究的健康人全血和各类疾病患者的全血样本来自北大深圳医院。
[0229] 全血样本与生理盐水1:1轻轻混匀，然后用无菌吸管轻轻加在等量人外周血淋巴 细胞分离液上，2500rpm离心15min，小心吸取中间白色膜层，加生理盐水lOOOrpm离心5min 洗两次，即得PBMC，用于后续相关实验。
[0230] (2)细胞总RNA提取
[0231] 1)将分离的人PBMC细胞移入1. 5ml无 RNA酶的EP管中，加入lmL Trizol试剂， 用移液枪反复吹打，直到无明显沉淀，常温静置5min ;
[0232] 2)在上述EP管中，按照lml Trizol加200 μ 1氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖 子，在手中用力震荡15sec，待溶液充分乳化到无分相后，室温静置5min ;
[0233] 3) 4。〇，13000rpm 离心 lOmin ;
[0234] 4)小心取出EP管，可见浆液分为三层：上层为无色上清，中间为白色蛋白层，下层 为有机相；小心吸取上清至另一新的无 RNA酶的EP管中，切忌吸出白色蛋白层；
[0235] 5)按照lml Trizol加500 μ 1异丙醇的量向上一步骤的上清中加入异丙醇，轻轻 的颠倒充分混匀，室温静置l〇_15min ;
[0236] 6) 4。〇，13000rpm 离心 lOmin ;
[0237] 7)弃上清，按照lml Trizol加 lml75%乙醇进行洗涤(不要触及沉淀)，轻轻上下颠 倒洗涤沉淀；
[0238] 8) 4。。，13000rpm 离心 5min ;
[0239] 9)小心弃去乙醇，将离心管放置于超净台上室温干燥5-10min ;
[0240] 10)向EP管中加入适量DEPC水，移液枪轻轻吹打溶解沉淀，待RNA沉淀溶解完全 后，取2 μ 1 RNA用超微量分光光度计检测RNA的纯度和浓度。以A260/A280比值确定RNA 的纯度，比值应在1. 8-2. 0范围内，若小于1. 8说明有蛋白质或其它有机杂质污染。若大于 2. 0则说明可能有异硫氰酸残存或RNA降解。1%琼脂糖凝胶电泳进一步验证所提RNA的含 量和纯度，并将RNA定量，尽快将RNA逆转录成cDNA，RNA保存于-80°C。
[0241] (3 ) RNA 逆转录为 cDNA
[0242] 按照操作说明书，根据iScript? cDNA Synthesis kit将RNA逆转录成cDNA。所 有操作均在冰上进行。
[0243] 1)反应体系：RNA 样品 2μ 1，01igo(dt)18primerly 1 适量 DEPC 水分别加入 500 μ 1的无 RNA酶PCR薄壁离心管中，总体系12 μ 1 ;
[0244] 2)在冰上将上述试剂混合，注意在超净台上操作并带上口罩，帽子，严防RNA降 解；
[0245] 3)将上述反应体系置于PCR仪上反应65°C温育5min ;
[0246] 4)然后置于冰上2-3min，向上述离心管分别加入10mM dNTP Μ?χ2μ 1，RiboLock TM RNase Inhibitorlμ 1,5XReaction Buffer4μ 1, RevertAidTM M~MuLV Reverse Transcriptasel μ 1，总体系 20 μ 1，充分混勻；
[0247] 5)上述反应体系置于PCR仪上反应42 °C温育60min，70°C温育5min，即得 cDNA，-80°C冰箱保存备用。
[0248] 实施例6 :IL_37编码基因的克隆
[0249] 根据 IL-37 完整 cDNA 的 0RF (Open Reading frame)序列（Genbank 登录号NM_014439)，设计含BamH I酶切位点（带下划线的序列）的引物F : 5' ~CGGGATCCATGGTTCACACAAGTCCA~3, (SEQ ID NO :3)和含 Xhol 酶切位点的引物 R : 5' -CCGCTCGAGCTAATCGCTGACCT-3, (SEQ ID N0 :4)，以 PBMC 的 cDNA 为模版，通过 PCR 技术 从PBMC的cDNAs中扩增出IL-37的编码基因(去掉信号肽)。PCR体系为60μ 1，其中引物F 和 R 分别为 〇· 4 μ 1，Taq 酶 30 μ 1 (含有 mix dNNPs, Buf f er, Mg2+)，cDNA 为 0· 6 μ 1，补水至 60 μ 1。将以上体系混匀后分装6管进行温度梯度PCR反应，同时以水为模版进行阴性对照。 ?〇?反应程序为：951：5111丨11;951：3〇86(3,55-7〇1：3〇86(3,721：358,30个循环 ；721：1〇11^11。
[0250] 实施例7 :IL-37在E. coli Transetta(DE3)中的表达和鉴定
[0251] 原核表达重组质粒pET32a-IL_37的构建：将实施例6中获得PCR产物纯化后，和 pET32a分别用BamH I和Xhol进行双酶切反应。回收、纯化酶切产物，用DNA Ligation Kit 的Solution I将PCR片段和pET32a在16°C进行连接反应。用氯化钙法将连接产物转化 E. coli TransTl克隆菌，在含氨苄青霉素（SOyg/ml)的LB平板进行筛选，挑取阳性菌落 (含重组质粒pET32a-IL-37)进行菌落PCR (图lA)、BamH I/Xho I双酶切鉴定，并进行测 序验证（广州Ivitrogen公司），测序结果与NCBI的序列比较，验证克隆IL-37的PCR产物 序列完全正确（图1B)。
[0252] 重组蛋白的诱导表达：将构建成功的pET32a-IL_37重组质粒分别转化 E. coliTransetta(DE3)，挑取单菌落培养过夜，按1%比例接种于20ml LB培养基（含 50 μ g/ml氨苄青霉素），37°C培养至菌液的A600nm达到0. 6时，加异丙基-β -D-硫代吡喃 半乳糖苷（IPTG)至终浓度为lmmol/L，诱导4h后，收集菌体，通过SDS-PAGE考马斯亮蓝染 色检测重组菌表达的IL-37蛋白（图1C)。
[0253] 实施例8 :构建IL-37的腺病毒表达系统
[0254] (1)腺病毒穿梭载体 pShuttle-IRES-hrGFP2-IL_37 的构建
[0255] 1)设计并合成带有EcoR V酶切位点（带下划线的序列）的引物： 5' -CGGATATCATGGTTCACACAAGTCC-3' (SEQ ID NO :5)和带有 Xho I 酶切位点（带下划线的 序列）的引物：5' -CCGCTCGAGCTAATCGCTGACCTCAC-3, (SEQ ID N0 :6)，以 pET32a_IL_37 重 组质粒为模板扩增带有EcoRV和Xhol酶切位点的IL-37基因；与T载体连接，转化到感受 态，选择阳性克隆，测序验证；将测序验证正确的克隆菌进行扩增，提取重组质粒。
[0256] 2)用 DNA Ligation Kit 的 Solution I 将经 EcoR V 和 Xho I 酶切的 IL-37 片 段连接到经同样内切酶酶切的腺病毒穿梭质粒pShuttle-IRES-hrGFP2 (图2A)，将连接产 物化学法转化到大肠杆菌DH5 α，在LB固体筛选培养板（含50 μ g/ml卡那霉素）上37°C 培养过夜。扩增克隆菌，提取重组质粒进行PCR (图2B)、双酶切鉴定，筛选阳性重组质粒 pShuttle-IRES-hrGFP2-IL-37〇
[0257] (2) pShuttle-IRES-hrGFP2-IL37 电转 BJ5183-AD-1 感受态细菌，同源重组构建 pAd-IL37腺病毒载体
[0258] 1)酶切线性化：取 0· 1-0. 5 μ g 的重组质粒 pShuttle-IRES-hrGFP2-IL-37 和对照 空载体质粒，Pme I酶切线性化，琼脂糖凝胶电泳检测，回收纯化DNA，通过琼脂糖凝胶电泳 对线性化产物进行验证（图2C)，样品和没有酶切线性化用来对照。
[0259] 2)电转BJ5183-AD-1感受态细菌，然后抽提质粒进行Pac I酶切，之后用琼脂糖凝 胶电泳鉴定腺病毒同源重组载体（图2D)。
[0260] (3)重组腺病毒载体pAd_IL37在AD-293细胞内的包装：
[0261] 使用上述构建的重组腺病毒载体pAd_IL37转染AD-293细胞，包装出腺病毒颗粒。 使用荧光显微镜观察，显示出病毒对细胞的感染率较高（图2F)。
[0262] (4)为考察Ad-IL-37在体内表达情况，使用腺病毒（Ad-IL-37)和表达空载体的 腺病毒（Ad-EV)注射DBA小鼠关节腔3天，利用小鼠活体成像系统（IVIS)检测小鼠关节 Ad-IL-37和Ad-EV的GFP荧光信号。图2E显示IL-37体内表达的鉴定结果，其中转Ad-EV 的小鼠呈GFP荧光，说明质粒呈GFP阳性，转Ad-IL-37的小鼠呈GFP荧光，说明IL-37-GFP 融合蛋白表达成功。
[0263] 实施例9 :重组IL-37蛋白的纯化和鉴定
[0264] (1)纯化及SDS-PAGE电泳鉴定
[0265] 培养实施例7阳性克隆菌Transetta (含重组质粒pET32a-IL_37)，收集菌 体进行超声破碎，将破菌液的上清过已平衡好的His Trap HPlml柱，平衡缓冲液20mM Tris-HCl，20mM咪唑，0. 5M NaCl，PH8. 0,采用不同浓度的咪唑进行梯度洗脱，收集洗脱峰， 用SDS-PAGE电泳检测（图1D)目的蛋白。将含有IL-37目的蛋白的洗脱峰透析至PBS中， 4°C过夜，Brandford法测定蛋白浓度，于-20°C保存备用。
[0266] (2)蛋白免疫印迹（WB)鉴定
[0267] 1)十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)
[0268] 配制分离胶浓度为12% (pH8. 8)、浓缩胶浓度为5% (pH6. 8)的SDS-PAGE凝胶，然 后将上述纯化获得的蛋白样品经适当的去离子水和蛋白上样缓冲液处理后加至上样孔。盖 上电泳槽盖，将电极插入电泳仪中进行电泳,80V恒压电泳约25min，分离胶恒压100V电泳 lOOmin，待染料迁移至凝胶底部时将电泳仪电源关闭，取出凝胶进行电转印。
[0269] 2)电转印
[0270] 将电泳完成的玻璃板取出并打开，根据凝胶上的Marker条带标记位置裁下目标 条带，剪取与目标条带凝胶大小一致的一张 NC膜和六层滤纸，在电转印之前浸泡于IX的 转移缓冲液中平衡30min;在转移压板从阴极到阳极放置的顺序依次为三层滤纸-凝胶-NC 膜-三层滤纸，每放一层排空气泡一次，最后盖上阳极电极，放入转移槽中进行电转，将电 压调到320V，保持恒流160mA，电转60min后，将转移压板取出并打开，NC膜与凝胶接触面 为正面，并在右上角进行标记以区分正反面。
[0271] 3)杂交与显影
[0272] 电转印结束后，将转印好的NC膜用适量洗涤缓冲液（TBS)洗膜3次，每次5min，之 后将NC膜浸入提前配好的5%脱脂奶粉溶液中放置于摇床中进行封闭，室温封闭l_2h。一 抗按合适比例用TBS进行稀释配制，将稀释好的一抗溶液与NC膜一并放入杂交袋中，放置 于脱色摇床4°C中孵育过夜。次日取出NC膜，放入平皿中置于摇床上，加入TBS-T(0. 5%的 吐温20)溶液漂洗3次，每次lOmin，提前将二抗按合适比例用TBS进行稀释配制，将稀释好 的二抗溶液与NC膜一并放入杂交袋中，放置于摇床中室温缓慢摇动孵育lh，随后用TBS-T 溶液漂洗3次，每次lOmin，再用TBS溶液漂洗1次，lOmin，取出漂洗完毕的NC膜，浙干漂洗 液后，与显影液共孵育l_2min，放入凝胶成像仪中曝光，拍照保存（图1E)。
[0273] 实施例10 :实时荧光定量PCR (qPCR)
[0274] 按照实施例5的方法获得cDNA模版
[0275] (1)目的基因及内参基因引物设计
[0276] 首先从Genbank里查找目的基因及内参基因的mRNA序列，然后利用引物设计软件 Primerf. 0设计引物，由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物列表如下，其顺序都是从5 端到 3 端；来源：鼠 （Mus musculus)和人（Homo sapiens)。
[0277] 表1基因的名称、来源、登录号和序列
[0278]

【权利要求】
1. 一种用于治疗自身免疫或慢性非感染性炎症疾病的药物，其特征在于，所述药物以 白细胞介素37、其衍生物、变异体和/或截短多肽为活性成分；任选地，还包括药学上可接 受的载体； 优选地，所述白细胞介素37具有如SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列； 优选地，所述衍生物是如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列取代、缺失和/或插入一个或 多个氨基酸并具有与SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列相同或相似活性的氨基酸序列； 优选地，所述变异体是白细胞介素37或其衍生物连接糖和/或脂肪PEG修饰侧链得到 的功能与白细胞介素37相同或相似的修饰肽； 优选地，所述截短多肽是包括如SEQ ID NO :1中部分氨基酸序列的活性片段的截短多 肽； 优选地，所述疾病包括类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、特应性皮炎、银屑病、克罗恩 病、多发性硬化、哮喘、糖尿病、移植排斥、动脉粥样硬化、炎症性肠疾病、强直性脊柱炎、甲 亢、乔本氏甲状腺炎或再生障碍性贫血。
2. 根据权利要求1所述的药物，其特征在于，所述药物经口服或非肠胃方式服用； 优选地，所述非肠胃方式服用包括局部、关节腔、动脉、肌肉内、皮下、骨髓内、囊内、心 室内、静脉、腹膜内、粘膜或鼻腔注射服用。
3. 根据权利要求1或2所述的药物，其特征在于，所述药物的制剂形式为药丸、药片、注 射剂、胶囊、液体、胶体、糖衣丸、糖浆、浆体或悬浮液。
4. 一种如权利要求1至3任一项所述的药物的制备方法，其特征在于，所述方法包括制 备白细胞介素37、其衍生物、变异体和/或截短多肽作为药物的活性成分的步骤；任选地， 还包括将所述活性成分与药学上可接受的载体混合制成药物制剂形式的步骤； 优选地，所述白细胞介素37通过原核细胞表达系统进行表达和分离纯化； 优选地，所述表达和分离纯化的方法为：将编码白细胞介素37的基因片段连入原核 表达载体得到重组表达载体；将所述重组表达载体转化大肠杆菌，并筛选得到阳性克隆菌； 大量培养所述阳性克隆菌，并用诱导物诱导白细胞介素37表达；超声破碎，并利用亲和层 析进行分离纯化得到白细胞介素37重组蛋白； 优选地，所述原核表达载体为pET32a ; 优选地，所述大肠杆菌菌株为E. coli Transetta(DE3); 优选地，所述诱导物为异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷。
5. -种用于治疗自身免疫或慢性非感染性炎症疾病的药物，其特征在于，所述药物包 含编码白细胞介素37或其衍生物的核苷酸序列；任选地，还包括药学上可接受的载体； 优选地，所述白细胞介素37具有如SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列； 优选地，所述衍生物是如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列取代、缺失和/或插入一个或 多个氨基酸并具有与SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列相同或相似活性的氨基酸序列； 优选地，所述核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示； 优选地，所述核苷酸序列插入重组载体中； 优选地，所述重组载体来自质粒、粘粒、人工染色体、腺病毒、慢病毒或噬菌体； 优选地，所述核苷酸序列或包含所述核苷酸序列的重组载体负载于脂质体中； 优选地，所述疾病包括类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、特应性皮炎、银屑病、克罗恩 病、多发性硬化、哮喘、糖尿病、移植排斥、动脉粥样硬化、炎症性肠疾病、强直性脊柱炎、甲 亢、乔本氏甲状腺炎或再生障碍性贫血。
6. -种白细胞介素37、其衍生物、变异体和/或截短多肽在制备用于治疗自身免疫或 慢性非感染性炎症疾病的药物中的用途； 优选地，所述白细胞介素37具有如SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列； 优选地，所述衍生物是如SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列取代、缺失和/或插入一个或 多个氨基酸并具有与SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列相同或相似活性的氨基酸序列； 优选地，所述变异体是白细胞介素37或其衍生物连接糖和/或脂肪PEG修饰侧链得到 的功能与白细胞介素37相同或相似的修饰肽； 优选地，所述截短多肽是包括如SEQ ID NO :1中部分氨基酸序列的活性片段的截短多 肽； 优选地，所述疾病包括类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、特应性皮炎、银屑病、克罗恩 病、多发性硬化、哮喘、糖尿病、移植排斥、动脉粥样硬化、炎症性肠疾病、强直性脊柱炎、甲 亢、乔本氏甲状腺炎或再生障碍性贫血。
7. -种编码白细胞介素37或其衍生物的核苷酸序列在制备用于治疗自身免疫或慢性 非感染性炎症疾病的药物中的用途； 优选地，所述白细胞介素37具有如SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列； 优选地，所述衍生物是如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列取代、缺失和/或插入一个或 多个氨基酸并具有与SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列相同或相似活性的氨基酸序列； 优选地，所述核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示； 优选地，所述核苷酸序列负载于脂质体中； 优选地，所述疾病包括类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、特应性皮炎、银屑病、克罗恩 病、多发性硬化、哮喘、糖尿病、移植排斥、动脉粥样硬化、炎症性肠疾病、强直性脊柱炎、甲 亢、乔本氏甲状腺炎或再生障碍性贫血。
8. -种具有编码白细胞介素37或其衍生物的核苷酸序列的重组载体在制备用于治疗 自身免疫或慢性非感染性炎症疾病的药物中的用途； 优选地，所述白细胞介素37具有如SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列； 优选地，所述衍生物是如SEQ ID NO : 1所示的氨基酸序列取代、缺失和/或插入一个或 多个氨基酸并具有与SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列相同或相似活性的氨基酸序列； 优选地，所述核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示； 优选地，所述重组载体来自质粒、粘粒、人工染色体、腺病毒、慢病毒或噬菌体； 优选地，所述重组载体负载于脂质体中； 优选地，所述疾病包括类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、特应性皮炎、银屑病、克罗恩 病、多发性硬化、哮喘、糖尿病、移植排斥、动脉粥样硬化、炎症性肠疾病、强直性脊柱炎、甲 亢、乔本氏甲状腺炎或再生障碍性贫血。
9. 一种包含重组载体的宿主细胞在制备用于治疗自身免疫或慢性非感染性炎症疾病 的药物中的用途，其中所述重组载体具有编码白细胞介素37或其衍生物的核苷酸序列； 优选地，所述白细胞介素37具有如SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列； 优选地，所述衍生物是如SEQ ID NO : 1所示的氨基酸序列取代、缺失和/或插入一个或 多个氨基酸并具有与SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列相同或相似活性的氨基酸序列； 优选地，所述核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示； 优选地，所述重组载体来自质粒、粘粒、人工染色体、腺病毒、慢病毒或噬菌体； 优选地，所述重组载体负载于脂质体中； 优选地，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞； 优选地，所述原核细胞包括大肠杆菌、芽孢杆菌和链霉菌； 优选地，所述真核细胞包括酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞和哺乳动物细胞； 优选地，所述疾病包括类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、特应性皮炎、银屑病、克罗恩 病、多发性硬化、哮喘、糖尿病、移植排斥、动脉粥样硬化、炎症性肠疾病、强直性脊柱炎、甲 亢、乔本氏甲状腺炎或再生障碍性贫血。
【文档编号】C07K1/22GK104083755SQ201310594514
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2013年11月21日 优先权日:2013年11月21日
【发明者】黄钟, 叶亮, 温中阳, 肖淑英, 李小青 申请人:深圳意达凯生物科技有限公司