双特异性抗体分子和抗原-转染的t-细胞以及它们在医药中的用途

双特异性抗体分子和抗原-转染的t-细胞以及它们在医药中的用途
【专利摘要】本发明涉及双特异性(单克隆)抗体分子，其具有与CD8+T-细胞上的抗原结合的第一结合结构域，所述的抗原非天然地存在于CD8+T-细胞之中和/或之上；和与天然地存在于肿瘤细胞表面上的肿瘤-特异性抗原结合的第二结合结构域。所述的双特异性(单克隆)抗体分子在与转导的CD8+T-细胞，和/或T-细胞受体的结合特别有用，所述转导的CD8+T-细胞包含非天然地存在于所述CD8+T-细胞之中和/或之上的抗原。本发明提供应用所述(双特异性)抗体分子作为药物，所述(双特异性)抗体分子用于具体疾病的治疗，以及用于包含所述(双特异性)抗体分子的药物组合物/药物，其中，在特定的治疗方案中，所述的(双特异性)抗体分子与转导的CD8+T-细胞，和/或T-细胞受体结合施用，所述的CD8+T-细胞包含非天然地存在于所述CD8+T-细胞之中和/或之上的抗原。本发明的另外的方面还涉及编码所述双特异性(单克隆)抗体分子的核酸，载体，宿主细胞，制备所述(双特异性)抗体分子的方法，以及包含本发明的(双特异性)抗体分子的试剂盒。
【专利说明】双特异性抗体分子和抗原-转染的T-细胞以及它们在医药 中的用途
[0001] 本发明涉及双特异性（单克隆）抗体分子，其具有与CD8+T-细胞上的抗原结合的 第一结合结构域，所述的抗原非天然地存在于CD8+T-细胞之中或之上；和与天然地存在于 肿瘤细胞表面上的肿瘤-特异性抗原结合的第二结合结构域。此外，还提供了编码本发明 的（单克隆）双特异性抗体分子的核酸。本发明的另外方面还提供包含所述核酸序列的载 体和宿主细胞，生产本发明的双特异性抗体分子的方法，以及包含所述（双特异性）抗体分 子的药物/组合物。再有，本发明还涉及经转导的⑶8+T-细胞，其包含非天然地存在于所述 CD8+T-细胞之中和/或之上的抗原，和/或T-细胞受体。本发明还提供所述双特异性抗体 分子在制备用于治疗具体疾病以及在包含所述（双特异性）抗体分子的药物组合物/药物 中的用途，其中，在特定的治疗方案中，所述的（双特异性）抗体分子与经转导的CD8+T-细 胞，和/或T-细胞受体结合施用，所述的CD8+T-细胞包含非天然地存在于所述CD8+T-细胞 之中和/或之上的抗原。本发明还提供治疗具体疾病的方法和包含本发明的（双特异性） 抗体分子的试剂盒。
[0002] 发明背景
[0003] T-细胞（即T淋巴细胞）输入（transfusion)，称为过继T-细胞疗法，已 经过测试用于癌症和慢性感染的治疗。过继T-细胞疗法具有增强抗肿瘤免疫，提 高疫苗效力以及限制移植物-抗-宿主疾病的潜力。过继T-细胞疗法用作细胞源， 尤其是，细胞毒性T-细胞（CTLs)，或肿瘤浸润淋巴细胞（TILs)。双特异性抗体 可用于"武装（arm)"（活化的）T-细胞以形成它们和肿瘤细胞表面抗原之间的桥 梁。双特异性抗体在一侧靶向肿瘤细胞上的表面标记/抗原，在另一侧靶向另一种天 然地/内源性地在细胞中或细胞上表达的标记/抗原，例如在下述文献中所描述的， 如 Glorius 等，Bloodll6(2010), 1173 ;Rothe 等，Bloodll8(2011), 1585 ;Zhengxing 等，Bloodlll (2007) ,2211-2219, Herrmann 等，Cancer Research68(2008) ,1221-1227; Singer 等，Journal of Immunotherapy33(2010)，599-608 ;Brandl 等,Experimental Hematology27(1999)，1264-1270 ;James 等,European Journal of Cancer35(1999)，S343-S344;Chen 等，Clinical Cancer Researchl (1995) ,1319-1325; Valera 等，Molecular Cancer Therapeutics9 (2010),1872-1883 ;Gelderman 等,European Journal of Immunology36(2006), 977-984 ；Schweizer 等,Cancer Immunology Immunotherapy51 (2002)，621-629 ;Friedman等，Biotechnology and Applied Biochemistry54(2009)，12卜131;Schaefer 等，Cancer Cell20(2011)，472-486and Kazuhiko 等，International Journal of Molecular Medicine25(2010)，209-215。
[0004] 已知抗原特异性的细胞毒性T-细胞（CTLs)具有杀死人癌细胞的能力，如向 患有黑素瘤的患者过继转移先体外后体内（ex-vivo)扩增的肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocytes, TILs)或T-细胞受体基因-转染的T-细胞后所显示的肿瘤 阻抑（regression)那样（Leen 等，Annu. Rev. Immunol. 115 (2007)，98-104)。一种已知 的替代途径是利用双特异性抗体重新定向大量的内源T-细胞。这些双特异性抗体，其中 的一些设计形式（formats)称作BiTE(指"双特异性T-细胞衔接器（engager)"）是以 如下方式构建的，即在一侧靶向表面标记CD3(其天然地存在于/内源性地表达于T-细 胞之上），在另一侧靶向肿瘤细胞上的表面抗原（其天然地/内源性地表达于肿瘤细胞 表面）。此外，在之前的工作中已表明，这一具体设计的抗-CD3抗-靶抗原双特异性抗 体具有异常高的效力并可以衔接（engage)CD8+T-细胞和CD4+T-细胞，以极低的效应物 对革G标（E:T)比率裂解癌细胞。两种BiTE抗体目前处于临床试验中：Blinatumomab(又 名MT103)是对⑶3和⑶19具有双特异性。其正在患有晚期复发性非霍奇金淋巴瘤 (non-Hodgkin，s lymphoma，NHL) (Bargou 等，Science321 (2008) ,974-977)的患者中进行 I期临床试验，并在患B-前体急性成淋巴细胞白血病（B-precusor acute lymphoblastic leukemia，B-ALL) (Topp 等，Bloodl 12 (2008)，1926)的患者中进行 II 期临床试验。所 述的第二种、处于I期临床试验阶段的BiTE抗体是MT-IlO (Micromet Inc)，其革巴向 泛-癌-相关-抗原（pan-carcinoma-related antigen),上皮细胞黏附分子（EpCAM 或 CD326)和 CD3(fcischwein 等，Mol. Immunol. 43(2006)，1129-1143)。双特异性抗体 (catumaxumab [ Removab? ];抗CD3和人EpCAM双特异性）已于2009年在欧洲获准面世。
[0005] 体外（In vitro)和小鼠模型系统中，双特异性抗体能通过同时结合⑶3和革巴抗 原连接T-细胞和癌细胞触发包括细胞毒性颗粒融合以及瞬时细胞因子和粒酶释放在内的 T-细胞活化。但是，在利用此类双特异性抗体，例如作为用于人的治疗方案的一部分时，大 量T-细胞的活化（不依赖于T-细胞抗原特异性）和/或肿瘤细胞裂解的旁观者效应，导 致严重的问题。
[0006] -种此类的问题是所谓的"细胞因子释放综合症（cytokine release syndrome, CRS)"，其在小鼠模型系统中通常不产生什么效果，但在人中具有灾难性的影响 (Suntharalingam 等，The New England Journal of Medicine355(2006) ,1018-1028)。 CRS包括头痛，肌肉疼痛，恶心，腹泻，红斑，血管扩张和低血压。最严重的形式导致肺浸润， 肺损伤，肾衰竭和弥漫性血管内凝血（Suntharalingam等，The New England Journal of MediCine355 (2006)，1018-1028)。即使CRS与双特异性抗体的应用无关，也已观察到施用 双特异性抗体后的大量其他副作用（超过80%的三级或更高的毒性）（Topp等，Journal of Clinical 0ncology29 (2011) ,2093 - 2098)。这样的副作用也归因于T-细胞衔接作用 (engagment)，包括淋巴细胞减少症，血液化学变化和eurologic症状。
[0007] 鉴于双特异性抗体这种副作用严重的状况，不可能使用长半寿期的抗体设计形 式，因为假如出现CRS，长半寿期是不理想的。
[0008] 因此，本发明的技术问题为提供通过诱导T-细胞介导的免疫应答用于治疗恶性 疾病，如起源于上皮、内皮或间皮的癌以及血液癌症的手段和方法。
[0009] 发明简述
[0010] 上述通过诱导T-细胞介导的免疫应答治疗恶性疾病，如起源于上皮、内皮或间皮 的癌以及血液癌的手段和方法，应当克服已知的基于双特异性抗体的疗法的不利之处。
[0011] 所述技术问题的解决方案通过权利要求中所描述的具体实施方案实现。
[0012] 因此，本发明涉及以非天然地存在于⑶8+T-细胞中和/或⑶8+T-细胞的表面的 标记蛋白对CD8+T-细胞的转导，以及它们通过双特异性抗体分子向肿瘤的靶向募集（参 见图7和21)。在本发明中，所述CD8+T-细胞的转导可通过下述的反转录病毒系统进行。 本发明涉及双特异性抗体分子，其包含与⑶8+T-细胞上、非天然地存在于⑶8+T-细胞之 中和/或之上的抗原特异结合的第一结合结构域；和与天然地存在于肿瘤细胞表面上的 肿瘤-特异性抗原结合的第二结合结构域，其中，所述的CD8+T-细胞已用非天然地存在 于CD8+T-细胞之中和/或之上的抗原转导。在本发明的内容中，所述的双特异性抗体分 子包含与CD8+T-细胞上的抗原特异结合的第一结合结构域，所述的抗原非天然地存在于 CD8+T-细胞之中和/或之上；和与天然地存在于肿瘤细胞表面上的肿瘤-特异性抗原结合 的第二结合结构域，其中，所述的双特异性抗体分子是（单克隆）抗体分子。如所附加的实 施例所示，作为本发明构思（inventive concept)的证据，构建了双特异性抗体，其中，所述 的第一结合结构域与（人）EGFR(代表非天然地存在于T-细胞（CD8+T-细胞）之中或之上 的抗原）相互作用/结合，所述的第二结合结构域与EpCAM (代表天然地存在于肿瘤细胞表 面上的肿瘤特异性抗原）相互作用/结合。与对照试验相比，通过这种双特异性抗体和表 达del-(人）hEGFR蛋白的经转导的肿瘤特异性T-细胞（⑶8+T-细胞）结合治疗肿瘤，显著 地延长了小鼠的存活期（参见图12和14)。因此，出人意料地发现了用非天然地存在于这 些细胞之中和/或表面的抗原（如在所附加的实施例（作为所述构思的证据）中，通过如 5￡0 10勵：12(如由5￡0 10勵：11中所示的〇0嫩序列编码））中所示的(^1-(人）1^6卩1? 蛋白序列转导的T-细胞（CD8+T-细胞），可利用双特异性抗体分子特异性地募集，所述的 双特异性抗体分子通过其第一结构域（（人）hEGFR)与已被引入到所述T-细胞（⑶8T-细 胞）的、非天然地存在于T-细胞（CD8+T-细胞）之中和/或表面的抗原结合，通过其第二 结合结构域与天然地存在于肿瘤细胞表面上的、肿瘤-特异性抗原（EpCAM)结合。
[0013] 上下文中，所用的术语"双特异性结合构建体"特指双特异性抗体分子，其能够结 合非天然地/内源性地在CD8+T-细胞之中或之上表达的抗原、并能够诱导靶细胞的排除/ 裂解（经由与，天然地存在于（其是内源性表达的）肿瘤细胞表面的肿瘤-特异性抗原，结 合的第二结合结构域）。通过所述的双特异性结合构建体（双特异性抗体分子）与非天然 地存在于⑶8+T-细胞之中和/或之上的抗原结合（例如抗体，抗体衍生物或抗体片段）使 肿瘤特异性T-细胞（CD8+T-细胞）与肿瘤细胞实际接触（参见图7和21)。非-转导的或 内源T-细胞（CD8+T-细胞）不受所述双特异性结合构建体（双特异性抗体分子）的影响。 因此，本发明的双特异性抗体分子具有在体内和/或体外裂解靶细胞的能力。相应的靶细 胞包含表达表面分子的细胞，其被本发明的双特异性抗体分子的第二（Ig-衍生的）结合结 构域所识别。此类表面分子在下文中进行描述。
[0014] 可利用本领域已知的方法检测靶细胞的裂解。因此，此类方法包括，特别是体外 生理学测定。此类生理学测定可以是检测细胞死亡，例如通过丧失细胞膜的完整性（例如 基于FACS的碘化丙锭测定，台盼蓝灌注测定，酶释放光度测定（LDH)，51Cr释放辐射测定， 荧光铕释放和CalceinAM释放测定）。此外的测定包括细胞生存力监控，例如通过光度 MTT，XTT，WST-I和alamarBlue测定，放射性3H-Thd掺入测定，测量细胞分裂活性的产克隆 测定，测量线粒体跨膜梯度的罗丹明123测定。此外，通过例如基于FACS的磷脂酰丝氨酸曝 光（phosphatidylserin exposure)测定,基于ELISA的TUNEL试验,胱冬酶活性测定（基 于光度、突光或ELISA)或者分析细胞形态变化（缩小，膜气泡（membrane blebbing))。
[0015] 在本发明的内容中所用的术语"与……结合"定义至少两个"抗原_相互作用-位 点"彼此之间的结合（相互作用）。根据本发明，术语"抗原-相互作用-位点"定义与特异 性抗原或特异性抗原组表现出特异相互作用的能力的多肽基序。所述的结合/相互作用也 可以理解为定义"特异性识别"。根据本发明，术语"特异性识别"指所述的抗体构建体能够 特异性地相互作用于（interacting with)和/或结合于本申请所定义的每一人祀分子的 至少两个氨基酸。抗体可以识别，相互作用和/或结合相同靶分子上的不同表位。这一术 语涉及抗体分子的特异性，即，涉及其在本申请所定义的人靶分子的特异性区域间进行辨 别的能力。所述抗原-相互作用-位点与其特异性抗原之间的特异性相互作用可能导致信 号引发，例如由于所述抗原的构象改变的诱导，所述抗原的寡聚化等。由此，抗原-相互 作用-位点的氨基酸序列中的特异性基序与抗原彼此结合形成其初级，二级或四级结构， 并导致所述构建体二级修饰。
[0016] 本发明中所使用的术语"特异性相互作用"指本发明的双特异性结合构建体（双 特异性抗体分子）不与或基本上不与类似结构的（多）肽交叉反应。因此，本发明所述的 双特异性构建体特异性地结合于/相互作用于肿瘤标记、细胞表面标记，非天然地存在于 ⑶8+T-细胞之中和/或之上的抗原，并能基于其第二（Ig-衍生的）结构域与特异性的、所 选择的其他化合物、抗原、细胞-表面标记，天然地存在于肿瘤细胞表面的肿瘤标记等相互 作用。下文中给出所述第一，第二，Ig-衍生的结构域所定向针对的此类分子的具体示例。
[0017] 可以对在研究中的构建体组（panel)的交叉反应性进行测定，例如，通过评估在 常规条件（参见，例如Harlow and Lane,抗体：A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988) and Using 抗体：A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1999))下，所述双特异性抗体构建体组与所述所关注的（多）肽以 及一些或多或少在（结构和/或功能）密切相关的（多）肽之间的结合。只有那些与所关 注的（多）肽/蛋白质结合、但不与或基本上不与任何与所关注的（多）肽相同的组织，例 如由肿瘤组织的细胞，表达的其他（多）肽结合的构建体（即，抗体，（双特异性）scFvs等 等）被认为是特异于所关注的（多）肽/蛋白质，其被选择出来用于在本申请所提供的方 法中进一步研究。这些方法可以包括，特别是，与结构和/或功能密切相关的分子的结合研 究，阻断以及竞争研究。这些结合研究还包括FACS分析，表面等离振子共振（SPR，例如与 BIAcore)，分析超速离心，等温线滴定量热学，荧光各向异性，荧光光谱学或通过放射性 同位素标记的配体结合测定。此外，也可以应用生理学测定，如细胞毒性测定以及上述提及 的测定。因此，抗原-相互作用-位点与特异性抗原的特异性相互作用示例可以包括所述 配体对于其受体的特异性。所述的定义特别地包括配体一旦与其特异性受体结合诱导信号 的相互作用。相应的配体的示例包括细胞因子，其与特异性的细胞因子-受体相互作用/与 与特异性的细胞因子-受体结合/结合于其特异性的细胞因子-受体。还特别地包含于所 述定义中的是抗原-相互作用-位点与抗原，如选凝素家族，整联蛋白以及EGF之类的生 长因子家族的抗原，之间的结合。所述相互作用的另一示例，其也特别包含于所述定义中， 是抗原决定簇（表位）与抗体的抗原性结合位点之间的相互作用。
[0018] 术语"结合于"并不仅仅涉及线性表位，也涉及构象表位，结构表位，或由人靶分 子或其部分的两个区域组成的不连续的表位。在本发明的内容中，构象表位是由在初级结 构中相分离的两个或以上分立的（discrete)、在所述多肽折叠成其天然的蛋白质时聚拢 (come together)在所述分子表面的氛基酸序列定义的（Sela, Sciencel66 (1969)，1365and Laver, Cell61 (1990)，553-536)。再有，术语"结合于"在本发明的内容中可以与术语与…… 相互作用"互换使用。
[0019] 因此，特异性可通过本领域已知的方法以及本申请中所描述的方法实验确定。此 类方法包括，但不限于，Western Blots, ELISA-，RIA-，ECL-，IRMA-试验，以及肽扫描。
[0020] 术语（Ig-衍生的）"第一结合结构域"涉及"免疫球蛋白-衍生的结构域"，具体 涉及抗体或其片段，单链抗体，合成抗体，抗体片段，如Fab，F (ab2) '，Fv或SCFv片段等，或 上述任何抗体或片段经化学修饰的衍生物。这些抗体分子可由不同的种类衍生，或者可以 是嵌合来源的。在本发明的内容中（如所附加的实施例所示例性描述的），所述的（Ig-衍生 的）、包含在本发明的双特异性抗体分子中的第一结构域可以是，与第二（Ig-衍生的）"结 合结构域"融合的（单克隆）抗体。
[0021] 术语（Ig-衍生的）"第二结合结构域"涉及免疫球蛋白_衍生的结构域。具体涉 及抗体或其片段，单链抗体，合成抗体，抗体片段，如Fab, F (ab2) '，Fv或scFv片段等，或上 述任何抗体或片段经化学修饰的衍生物。这些抗体分子可由不同的种类衍生，或者可以是 嵌合来源的。在本发明的内容中（如所附加的实施例所示例性描述的），所述的（Ig-衍生 的）、包含在本发明的双特异性抗体分子中的第二结构域可以是scFv。
[0022] 本发明的双特异性抗体分子是（单克隆）双特异性抗体，其对至少两 个不同的位点具有结合特异性，并可以是任何涉及形式。不久之前，已经开发 出了多种多样的重组抗体设计形式，例如二价的、三价的或四价的双特异性抗 体。示例包括，IgG抗体设计形式和单链结构域（针对不同的设计形式，参见 例如 Coloma,M.J?，等，Nature Biotechl5 (1997),159-163 ;W02001/077342; Morrison,S.L. , Nature Biotech25 (2007), 1233-1234 ；Holliger, P. , et. al, Nature Biotech.23(2005), 1126-1136 ；Fischer, N. ,and Leger,0.,Pathobiology74(2007) ，3-14 ;Shen, J.，et. al.，J. Immunol. Methods318 (2007)，65-74 ;Wu, C.,等，Nature Biotech. 25(2007),1290-1297)的融合。此处所述的双特异性抗体或片段还包括TO 2009/080251 ；W0 2009/080252 ；W0 2009/080253 ；W0 2009/080254 ；W0 2010/112193 ；W0 2010/115589 ;W0 2010/136172 ;W0 2010/145792 ;W0 2010/145793 以及 TO 2011/117330 中所描述的二价的、三价、或四价的双特异性抗体。
[0023] 本发明的"抗体"具有两个或以上的结合结构域并且是双特异性的。也就是说，所 述的抗体可能是双特异性，即使在有两个以上结合结构域的情况下（即，所述的抗体是三 价的或多价的）。本发明的双特异性抗体包括，例如，多价单链抗体，双抗体，三链抗体，以及 具有全长抗体的恒定结构域的抗体，其中抗原-结合结构域（例如单链Fv，a VH结构域和 /或VL结构域，Fab，或（Fab) 2，）通过一个或以上的肽接头与所述全长抗体的恒定区结构 域连接。所述的抗体可以是来自单一种类的全长的，或嵌合的或人源化的抗体。对于具有 两个或以上抗原结合结构域的抗体，一些结合结构域可以是同一的，只要所述的蛋白质具 有针对两个不同抗原的结合结构域即可。
[0024] 本申请中所用的术语"价"代表在抗体分子中存在的结合结构域的具体数量。例 如，术语"二价"，"四价"，和"六价"分别代表在抗体分子中存在两个结合结构域，四个结 合结构域，和六个结合结构域。本发明所述的双特异性抗体至少是"二价的"，也可以是"三 价的"或"多价的"（例如"四价"或"六价"）。优选地，本发明的双特异性抗体是二价的， 三价的，或四价的。据此，在本发明的内容中，所述的双特异性抗体是二价的。在本发明的 内容中，所述双特异性抗体是三价的。在本发明的内容中，所述的双特异性抗体是四价的。
[0025] 如上所述（以及在图1中示例性描述的），本发明的双特异性抗体分子，最优选地， 包含（Ig-衍生的）第二结构域，其可以是scFv。由此，在本发明的示例性具体实施方案中， 作为构思的证据，提供了双特异性抗体分子，其具有一个针对（人）EGFR(经由第一结合结 构域）的特异性，并且还有另一个特异性，该特异性通过第二scFv介导、定向针对另外的分 子/化合物或能够与之相互作用。这些另外的分子/化合物可包括细胞表面分子，肿瘤标 记，肿瘤抗原等等。此类另外的分子/化合物在下文中举例说明。
[0026] 因此，在本发明的内容中，双特异性结合分子可能涉及包含两个抗体衍生的结合 结构域的抗体分子，其中，一个结合结构域可以是scFv。所述的结合结构域之一由抗体的可 变区（或其部分），抗体片段或其衍生物组成，能够特异性地结合于/相互作用于非天然地 存在于CD8+T-细胞（如下文中所定义的）之中和/或之上的（人）靶分子1。所述第二结 合结构域由抗体的可变区（或其部分），抗体片段或其衍生物组成，能特异性地结合于/相 互作用于如下文中所定义的另外的（人）抗原（靶分子2)。因此根据本发明，所述的第二 结合结构域是如上所述的（Ig-衍生的）第二结构域，其包含对天然地存在于肿瘤细胞表面 上的细胞表面分子或天然地存在于肿瘤细胞表面上的肿瘤特异性标记（抗原）具有特异性 的、特异性抗原-相互作用-位点。所述双特异性抗体分子中的两个结构域/区域，优选地 彼此间共价相连。这种连接可以是直接的作用（结构域1 [对于非天然地存在于CD8+T-细 胞之中或之上的（人）靶分子1具有特异性，其包含上述定义的CDR-区或CDR-区和框架 区]-结构域2 [对细胞表面分子和/或肿瘤特异性标记具有特异性]或结构域1 [对于细 胞表面分子和/或肿瘤特异性标记具有特异性]-结构域2 [对非天然地存在于⑶8+T-细 胞之中和/或之上的（人）靶分子1具有特异性，其包含如上述定义的CDR-区或CDR-区 和框架区])，或者是通过附加的多肽接头序列（结构域1-接头序列-结构域2)。在使 用接头的情况下，在本发明的内容中，接头的长度和序列要足以保证所述第一和第二结构 域中的每一个，彼此间独立地保持它们不同的结合特异性。在本发明的内容中，所述附加的 多肽接头序列也可以是抗体自身的片段，其可以是，例如Fc部分，或者一个或以上的抗体 恒定区结构域。
[0027] 在本发明的内容中，结合结构域1也可以是抗体臂1的一部分，结合结构域2也可 以是抗体臂2的一部分，反之亦然，其中所述的两个抗体臂通过界面（interface)相连。所 述的抗体臂1由抗体的可变区（或其部分），抗体片段或其衍生物组成，能够特异性地结合 于/相互作用于非天然地存在于如下述定义的CD8+T-细胞之中或之上的（人）靶分子1。 所述的抗体臂2由抗体的可变区（或其部分），抗体片段或其衍生物组成，能够特异性地结 合于/相互作用于天然地存在于肿瘤细胞表面上的细胞表面分子或天然地存在于肿瘤细 胞表面上的肿瘤特异性抗原。所述的"界面"包含第一抗体臂中的那些接触氨基酸残基（或 其他非_氨基酸基团，例如碳水化合物基团），其与所述第二抗体臂中的一个或以上"接触" 氨基酸残基（或其他非-氨基酸基团）相互作用。优选的界面是免疫球蛋白结构域，如抗体 重链的恒定结构域（或其中的区域），其中，所述经由界面的结合/相互作用使得所述的两 个抗体臂异源二聚体化（参见例如 Ridgway, J. B?，等，Protein Eng. 9 (1996)，617-621 ;W0 96/027011 !Merchant, A. M?，等，Nature Biotech. 16 (1998)，677-681 ;Atwell, S.，等，J. Mol.Biol. 270(1997), 26 - 35 ；EP I 870 459 Al ；W0 2007/147901 ；W0 2009/089004(Al) 和 TO 2010/129304)。
[0028] 应用于本发明的抗体，抗体构建体，双特异性抗体分子，抗体片段，抗体衍生物 (均由Ig-衍生），或它们相应的免疫球蛋白链，可通过本领域已知的常规技术进行修饰，例 如，利用氨基酸缺失，插入，取代，添加，和/或重组和/或任何本领域已知的其他单独的 或组合的修饰方式。向免疫球蛋白氨基酸序列的相应DNA序列中引入此类修饰方法是本领 域普通技术人员公知的；参见，例如以上所引用的Sambrook(1989)。术语"Ig-衍生的结构 域"，具体涉及包含至少一个CDR的（多）肽构建体。所述的Ig-衍生的结构域的片段或衍 生物界定（多）肽，其是上述抗体分子的部分和/或它们通过化学/生物化学或分子生物 学方法修饰的形式。所述的方法是本领域已知的特别是在实验室操作手册中有描述（参见 Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual ;Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd edition(1989)and3rd edition (2001) ;Gerhardt 等，Methods for General and Molecular Bacteriology ASM Press (1994) ；Lefkovits,Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques ；Academic Press (1997)； Golemis, Protein-Protein interactions:A Molecular Cloning Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press (2002))〇
[0029] 本申请所用的术语"⑶R"指"互补决定区"，其是本领域公知的。所述的⑶R是 免疫球蛋白的部分，其决定所述分子的特异性，并与特异性的配体相接触。CDR是所述分 子中可变性最高的区域，是这些分子多样性的基础。在每个V结构域中有三种CDR区， ⑶Rl,⑶R2和⑶R3。⑶R-H表示可变重链的⑶R区，⑶R-L指可变轻链的⑶R区。VH指可 变重链，VL指可变轻链。Ig-衍生区域的CDR区可如Kabat "Sequences of Proteins of Immunological Interest"，5th edit. NIH Publication no.91-3242U. S. Department of Health and Human Services (1991) ；Chothia J. Mol. Biol. 196(1987), 901-917or Chothia Nature342 (1989)，877-883中所描述的进行确定。
[0030] 因此，在本发明的内容中，所述的抗体分子，诸如上述的双特异性抗体，选自：完全 抗体（免疫球蛋白，诸如 IgGl，IgG2, IgG2b，IgG3, IgG4, IgA，IgM，IgD 或 IgE)，F(ab)-，Fa b'-SH-，Fv-，Fab'-，F(ab'）2-片段，嵌合抗体，CDR-移植抗体，完全人抗体，二价抗体-构建 体，抗体-融合蛋白，合成抗体，二价单链抗体，三价单链抗体和多价单链抗体。
[0031] 本申请中所用的术语"完全-人抗体"指仅包含人免疫球蛋白的蛋白质序列的抗 体。如果是在小鼠中，或在小鼠细胞中，或衍生自小鼠细胞的杂交瘤中制备的完全人抗体， 可能包含鼠碳水化合物链。类似地，"小鼠抗体"或"鼠抗体"指仅包含小鼠（鼠）免疫球蛋 白蛋白质序列的抗体。另外，如果是在大鼠中，在大鼠细胞中，或在衍生自大鼠细胞的杂交 瘤中制备的"完全人抗体"，可能包含大鼠碳水化合物链。类似地，术语"大鼠抗体"指仅包 含大鼠免疫球蛋白序列的抗体。制备完全-人抗体可通过，例如，噬菌体展示，其是被广泛 应用的筛选技术，能用来生产以及筛选完全人抗体。噬菌体抗体也可以用于本发明。噬菌 体展示方法在，例如US 5, 403, 484, US 5, 969, 108和US 5, 885, 793中有描述。另一种能研 发完全-人抗体的技术涉及对小鼠杂交瘤技术的修饰。通过转基因制备包含人免疫球蛋白 基因组，以替代其自身的小鼠基因的小鼠（参见，例如，US 5, 877, 397)。
[0032] 本申请所用的术语抗体也包含嵌合抗体。术语"嵌合抗体"指包含与来自另一种 人或非-人种（例如小鼠，马，兔，狗，牛，鸡）的抗体区域（例如恒定区）融合或嵌合的人 或非-人种的可变区的抗体。
[0033] 术语抗体也指重组的人抗体，异种抗体和异杂合抗体。术语"重组的人抗体"包括 通过重组的手段制备、表达、创建或分离的全部人序列抗体，如由人免疫球蛋白基因转基因 的动物（例如小鼠）分离的抗体；利用转染进入宿主细胞的重组表达载体表达的抗体，由重 组组合人抗体文库分离的抗体，通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列的 任何其他手段制备、表达、创建或分离的抗体。此类重组的人抗体具有衍生自人种系免疫球 蛋白序列的可变和恒定区（如果存在的话）。但是，可以对此类抗体进行体外诱变（或者当 使用人Ig序列转基因的动物时，体内体细胞诱变），由此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序 列虽然是衍生自人种系VH和VL序列且与其相关，但是并非天然地存在于人抗体种系体内 所有组成成分（repertoire)之中。
[0034] "异种抗体"是相对于涉及生产所述抗体的转基因非-人生物体定义的。该术语指 具有不是在所述转基因非-人动物生物体中的，而通常是来自所述转基因非-人动物之外 的种类的氨基酸序列或其编码核酸序列的抗体。
[0035] 术语"异杂合抗体"指具有不同的生物来源的轻链和重链的抗体，例如，具有与鼠 轻链相关联的人重链的抗体是异杂合抗体。异杂合抗体的示例包括嵌合的和人源化的抗 体。
[0036] 术语抗体还指人源化抗体。非-人（例如鼠或兔）抗体的"人源化"形式是嵌合 免疫球蛋白，免疫球蛋白链或其片段（如Fv，Fab，Fab'，F (ab'）2或抗体的其他抗原-结合 序列），其包含最低限度的衍生自非_人免疫球蛋白的序列。常见地，人源化抗体是人免疫 球蛋白（受体抗体），其中来自受体的互补决定区（CDR)的残基被具有所需特异性，亲和力 以及能力的、来自非-人种类（供体抗体）如小鼠，大鼠或兔的CDR的残基替代。有些情 况下，人免疫球蛋白的Fv框架残基被相应的非-人残基替代。此外，人源化抗体可包括既 不是受体抗体中的残基，也不是被引入的CDR或框架序列中的残基。进行这些修饰使得抗 体的性能被进一步地改善并优化。一般而言，所述的人源化抗体基本上包含至少一个，典型 地是两个可变结构域的全部，全部或基本上全部的CDR区相应于非-人免疫球蛋白中的那 些区域，全部或基本上全部的FR区是人免疫球蛋白共有序列中的那些区域。所述人源化 抗体还可以包括至少一部分免疫球蛋白恒定区（Fe)，特别是人免疫球蛋白的恒定区。更详 细的内容请参见：J〇nesNature321 (1986)，522-525 ;Reichmann Nature332 (1998)，323-327 和 Presta Curr Op Struct Biol2 (1992) ,593-596。
[0037] 通常使用的抗体人源化方法包括⑶R移植（grafting)，其中，来自非-人'供体' 抗体的功能性抗原-结合位点被移植到人'受体'抗体。CDR移植方法是本领域已知的，并 在例如US 5, 225, 539, US 5, 693, 761和US 6, 407, 213中有描述。另一种相关的方法是由 转基因动物生产人源化抗体，所述的转基因动物经遗传工程化以包含一个或以上能够进行 基因重排和基因转变的人源化免疫球蛋白基因座（参见，例如US 7, 129, 084)。
[0038] 因此，在本发明的内容中，术语"抗体"涉及完整的免疫球蛋白分子以及这种免疫 球蛋白分子的部分。另外，如上所述，该术语涉及经修饰的和/或经改变的抗体分子。该 术语也涉及通过重组或合成的方式产生/合成的抗体。这一术语也指完整抗体（intact antibody)以及其抗体片段，诸如经分离的轻链和重链，Fab，Fab/c，Fv，Fab'，F(ab'）2。术 语"抗体"也包含双功能抗体，三功能抗体，完全-人抗体，嵌合抗体，人源化抗体和抗体构 建体，诸如单链Fvs (scFv)或抗体-融合蛋白。
[0039] 在本发明的内容中，"单链Fvs"或"scFv"抗体片段具有抗体的V1^P八结构 域，其中，这些结构域存在于单一的多肽链中。一般而言，scFv多肽还包括Vh和八结构域 之间的多肽接头，其使得scFv形成抗原结合所需的结构。生产单链抗体的技术在，例如 Pliickthun 的 The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Rosenburg和 Moore eds. Springer-Verlag，N.Y. 113(1994),269-315 中有描述。
[0040] 本发明中所使用的"Fab片段"包含一条轻链以及重链的CH1和可变区。Fab分子 的重链不能与另一重链分子形成二硫键。
[0041] "Fc"区包含抗体CH2和CH3结构域的两个重链片段。所述的两个重链片段通过两 个或以上的二硫键以及CH3结构域的疏水相互作用保持在一起。
[0042] "Fab'片段"包含一条轻链以及一条重链的一部分，所述重链部分包含Vh结构域， ChI结构域以及ChI和CH2结构域之间的区域，由此，可以在Fab'片段的两重链之间形成链 间二硫键，以形成F (ab'）2分子。
[0043] "F(ab'）2片段"包含两条轻链和两条重链，其中的重链包含C0I和CH2结构域之间 的恒定区的一部分，由此在上述两条重链之间形成链间二硫键。F(ab'）2片段由两个Fab' 片段组成，所述两个Fab'片段通过两条重链间的二硫键保持在一起。
[0044] "Fv区"包含来自重链和轻链的可变区，但缺乏恒定区。
[0045] 值得注意的是，本发明的双特异性抗体分子可能包含，除此处所定义的第一 (Ig-衍生的）结构域和（Ig-衍生的）第二结构域之外的附加的结构域，例如用于通过重组 方式生产的构建体的分离和/或制备。
[0046] 应当注意的是，根据本发明，不仅是以上描述的本发明的分子或构建体（S卩，本 申请所述的双特异性抗体分子）的第一结构域可以被修饰，所述第一结构域特异性地与 ⑶8+T-细胞上的、非天然地存在于⑶8+T-细胞之中和/或之上（人）的抗原相互作用/ 结合。也可以预计，（Ig-衍生的）第一结构域，（Ig-衍生的）第二结构域和/或连接接 头-区，被修饰，例如人源化抗体，CDR移植抗体或完全人抗体。
[0047] "人源化方式"是本领域公知的，特别是有关抗体分子，例如Ig-衍生的分子的描 述。术语"人源化的"指非-人（例如鼠）抗体的、或其片段（如Fv，Fab，Fab'，F(ab'），SCFv S或抗体的其他抗原-结合部分序列）的人源化形式，所述的片段包含有衍生自非-人抗体 的序列的一些部分。人源化抗体包括人免疫球蛋白，其中来自人免疫球蛋白互补决定区 (CDR)的残基被具有所需特异性，亲和力以及能力的、来自非-人种如小鼠，大鼠或兔的 CDR的残基替代。通常，人源化抗体基本上包含至少一个，通常是两个可变结构域的全部， 其中，全部或基本上全部的CDR区相应于非-人免疫球蛋白中的那些区域，全部或基本上全 部的FR区是人免疫球蛋白共有序列中的那些区域。所述人源化抗体还可以包括至少一部 分免疫球蛋白恒定区（Fe)，最佳地，人免疫球蛋白的恒定区；具体参见，尤其是，Jones等，N ature321 (1986)，522-525, Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2 (1992)，593-596。非-人抗体 的人源化方法是本领域公知的。通常，人源化抗体具有一个或以上被引入其中的非-人来 源的氨基酸，但其仍然保持其固有的抗体结合活性。有关抗体/抗体分子人源化的方法， 在 Jones 等，Nature321 (1986) ,522-525 ;Reichmann 等，Nature332(1988) ,323-327 ;和 Verhoeyen等，Science239 (1988)，1534-1536中有更详细的描述。人源化抗体的具体示例， 例如定向针对EpCAM的抗体是本领域已知的，参见例如（LoBuglio, Proceedings of the American Society of Clinical Oncology Abstract(1997)，1562and Khor, Proceedings of the American Society of Clinical Oncology Abstract (1997)，847)〇 [0048] 在本发明的内容中特别提供了双特异性抗体分子，其是人源化的并可以被成功地 应用于药物组合物。在本发明的内容中，所述的（人源化的）双特异性抗体分子可应用于 下述的试剂盒中。
[0049] 在本发明的内容中，所述双特异性抗体分子的（Ig-衍生的）第一结构域包含对非 天然地存在于CD8+T-细胞之中和/或之上的抗原具有特异性的抗原-相互作用-位点。
[0050] 所用的术语"非天然地存在于⑶8+T-细胞之中和/或之上的抗原"指掺入到 ⑶8+T-细胞中的分子，其天然状态下不存在于⑶8+T-细胞之中和/或⑶8+T-细胞表面上， 并且非（内源性地）在（非-转导的）CD8+T-细胞之中或之上表达。因此，非天然地存在于 ⑶8+T-细胞之中和/或之上的抗原/标记是通过人工的方式引入到⑶8+T细胞中的。在本 发明的内容中，所述的CD8+T-细胞是由本申请所定义的待治疗的受试者分离/获取的。在 本发明的内容中，天然地存在于/内源性地表达于⑶8+T-细胞的T-细胞受体的抗原肽从 上述术语"非天然地存在于CD8+T-细胞上的抗原"中被排除。因此，这些通过人工方式引 入并随后呈现于所述⑶8+T-细胞之中和/或所述⑶8+T-细胞表面上的分子包含能够接近 (体外或体内）（Ig-衍生的）结合结构域，优选抗体，抗体的片段或衍生物的结构域或表位， 其非天然地存在于CD8+T-细胞之中和/或之上。在本发明的内容中，如下文中所述，这些 人工方式引入的分子是在（反转录病毒）转导后呈现在⑶8+T-细胞之中和/或⑶8+T-细 胞表面上的。
[0051] 在本发明的内容中，术语"非天然地存在于⑶8+T-细胞之中和/或之上的抗 原"指具有高于 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 或 1000 抗原分子 / 每个 CD8+T-细胞的、非天然地存在于/非内源性地表达于CD8+T-细胞之中和/或之上的抗原/ 标记。由此，所述的抗原/标记不以高于1. 0, 1. 1，1. 2, 1. 3, 1. 4, 1. 5, 1. 6, 1. 7, 1. 8, 1. 9或 S-OcVcitl(Promille)存在于/内源性地表达于正常的（非-转导的）⑶8+T-细胞群细胞之中 和/或之上。所述天然地存在于CD8+T-细胞之中和/或之上的抗原/标记的存在和数量 可通过本领域已知的方法，如FACS分析，ELISA，共焦显微术，分析HPLC等等，监控。
[0052] 这些分子的示例包括非-免疫源性的蛋白质，优选人来源的。换言之，所述的分 子可能或者其本身是功能上惰性的蛋白质分子，或将通过本领域已知的基因重组技术成为 功能上惰性的（示例可以是缺失了细胞内信号结构域的蛋白质分子（如所附加的实施例 中所说明的，通过没有细胞内信号结构域的（人）EGFR，指本申请中所述的del-hEGFR构 建体（SEQ ID NOs: 11和12))或胞外结构域的失活点突变使得所述的分子成为功能上惰 性的）。突变的（人）EGFR形式（version)的另一个示例是所附加的实施例中所使用的 (^1-1^?1^111构建体（5￡〇10勵：17所示的0嫩，5￡〇10勵：18所示的（编码的）氨基酸 序列）。hEGFRvIII是在胶质母细胞瘤和乳腺癌，卵巢癌和肺癌中发现的人表皮生长因子受 体的突变体。所述突变体的受体在其胞外结构域中有缺失（Lorimer等，Proc. Natl. Acad. Sci USA93:14815-14820(1996))。
[0053] 下文中给出了符合上述标准的标记的示例，其包括但不限于cripto (隐蔽家族蛋 白(cryptic family protein))，CD (分化族（cluster of differentiation))-家方矣（非 T-细胞）的成员，EGFR或TSH-R。
[0054] 在本发明的内容中所描述的双特异性抗体分子与非天然地存在于CD8+T-细胞之 中和/或之上的抗原结合，所述抗原选自cripto (隐蔽家族蛋白），CD (分化簇）-家族（非 T-细胞）的成员，EGFR和TSH-R。由此本申请所述的双特异性抗体分子与（排他地）不是天 然地存在于T-细胞（CD8+T-细胞）（如术语"非T-细胞"所称的）之中和/或之上CD-家 族的成员，cripto, EGFR或TSH-R(排他地）相互作用/结合。在本发明的内容中，所述的 双特异性抗体分子与非内源性的在T-细胞（CD8+T-细胞）（如术语"非T-细胞"所称的） 之中和/或之上表达的⑶-家族的成员，cripto, EGFR或TSH-R相互作用/结合。
[0055] (人）cripto(隐蔽家族蛋白）成员，CD(分化簇）_家族（非T-细胞）家族成 员，EGFR或TSH-R的氨基酸序列可获自UniProtKB/Swiss-Prot数据库并可在http: //www. uniDrot.org/uniprot/? auery = reviewed% 3Ayes 找至丨丨。这些（蛋白质）序列也涉及 经注释的修饰序列。本发明还提供技术和方法，其中用到本申请中的简明序列（concise sequences)的同源序列、遗传等位基因变体（genetic allelic variants)等等。优选地， 使用所述简明序列的"变体"等等。优选地，此类"变体"是遗传变体。本领域技术人员能 够容易地推断出这些数据库条目（entries)中的这些（蛋白质）序列的相关编码区，所述 的数据库还可能包括基因组DNA以及mRNA/cDNA的条目。
[0056] 本申请中所用的、与"非天然地存在于⑶8+T-细胞/非内源性地在⑶8+T-细胞之 中和/或之上表达的抗原"相关的术语"CD (分化簇）-家族（非T-细胞）"指选自下组的
【权利要求】
1. 试剂盒，其包括： (A) 双特异性抗体分子，其包含： (i) 与CD8+T-细胞上的抗原结合的第一结合结构域，所述的抗原非天然地存在于 ⑶8+T-细胞之中或之上；和 (ii) 与天然地存在于肿瘤细胞表面上的肿瘤-特异性抗原结合的第二结合结构域；和 (B) 用非天然地存在于所述⑶8+T-细胞之中或之上的抗原转导获自待治疗的受试者 的⑶8+T-细胞所需的材料。
2. 权利要求1的试剂盒，其中，所述转导CD8+T-细胞所需的材料是编码非天然地存在 于所述⑶8+T-细胞之中或之上的抗原的核酸。
3. 双特异性抗体分子，其包含： (i) 与CD8+T-细胞上的抗原结合的第一结合结构域，所述的抗原非天然地存在于 ⑶8+T-细胞之中或之上；和 (ii) 与天然地存在于肿瘤细胞表面上的肿瘤-特异性抗原结合的第二结合结构域 用作药物（medicament)，其中，所述的双特异性抗体分子在施用来自所述受试者的、经 转导的⑶8+T-细胞之前、同时或之后施用，所述的⑶8+T-细胞包含非天然地存在于⑶8+T 细胞之中或之上的抗原。
4. 药物组合物，其包含双特异性抗体分子，所述的双特异性抗体分子包含： (i) 与CD8+T-细胞上的抗原结合的第一结合结构域，所述的抗原非天然地存在于 ⑶8+T-细胞之中或之上；和 (ii) 与天然地存在于肿瘤细胞表面上的肿瘤-特异性抗原结合的第二结合结构域 其与包含非天然地存在于CD8+T细胞之中或之上的抗原的、经转导的CD8+T-细胞结合 施用，其中，所述的双特异性抗体分子在施用所述经转导的CD8+T-细胞之前、同时或之后 施用，并且所述的CD8+T-细胞由待治疗的受试者获得。
5. 双特异性抗体分子，其包含： (i) 与CD8+T-细胞上的抗原结合的第一结合结构域，所述的抗原非天然地存在于 ⑶8+T-细胞之中或之上；和 (ii) 与天然地存在于肿瘤细胞表面上的肿瘤-特异性抗原结合的第二结合结构域 用于治疗恶性疾病（malignantdisease)的方法，其中，所述的双特异性抗体分子在施 用包含非天然地存在于CD8+T细胞之中或之上的抗原的、经转导的CD8+T-细胞之前、同时 或之后施用，并且所述的CD8+T-细胞由待治疗的受试者获得。
6. 恶性疾病治疗方法，所述方法包括向所需受试者施用双特异性抗体分子，所述的双 特异性抗体分子包含： (i) 与CD8+T-细胞上的抗原结合的第一结合结构域，所述的抗原非天然地存在于 ⑶8+T-细胞之中或之上；和 (ii) 与天然地存在于肿瘤细胞表面上的肿瘤-特异性抗原结合的第二结合结构域， 其中，所述的双特异性抗体分子在施用来自所述受试者的经转导的CD8+T-细胞之前、 同时或之后施用，所述的CD8+T-细胞包含非天然地存在于CD8+T细胞之中或之上的抗原。
7. 权利要求5的双特异性抗体，或权利要求6的方法，其中，所述的恶性疾病选自：起 源于上皮、内皮或间皮的癌以及血液癌症。
8. 权利要求1或2的试剂盒，权利要求4的药物组合物，权利要求3、5或7任一项的 双特异性抗体分子，或权利要求6或7的方法，其中，所述的双特异性抗体分子选自：完全抗 体，F(ab)_，Fab' -SH-，Fv_，Fab' _，F(ab'）2-片段，嵌合抗体，CDR-移植抗体，完全人抗体， 二价抗体-构建体，抗体-融合蛋白，合成抗体，二价抗体，三价抗体，四价抗体，二价单链抗 体，三价单链抗体和多价单链抗体。
9. 权利要求1、2或8的试剂盒，权利要求4或8的药物组合物，权利要求3、5、7或8的 双特异性抗体分子，或权利要求6-8任一项的方法，其中所述的非天然地存在于CD8+T-细 胞之中或之上的抗原选自：cripto(隐秘家族蛋白（crypticfamilyprotein))，CD(分化 族（clusterofdifferentiation))-家族（非T_ 细胞）成员，EGFR和TSH-R。
10. 权利要求1，2, 8或9的试剂盒，权利要求4,8或9的药物组合物，权利要求3、5或 7-9中任一项的双特异性抗体分子，或权利要求6-9中任一项的方法，其中，所述的天然地 存在于肿瘤细胞表面上的抗原选自：EpCAM，HER-1，HER-2,HER-3,CD20,CD22,CD33,CD52,C A-12-5,HLA-DR，MUC-1 (黏蛋白），A33-抗原，PSMA(前列腺特异性膜抗原），运铁蛋白-受 体，生腱蛋白和CA-IX。
11. 权利要求1，2或8-10中任一项的试剂盒，权利要求4或8-10中任一项的药物组 合物，权利要求3、5或7-10中任一项的双特异性抗体分子，或权利要求6-10中任一项的方 法，其中，所述的第一结构域和/或第二结合结构域是人的和/或人源化的。
12. 权利要求1，2或8-11中任一项的试剂盒，权利要求4或8-11中任一项的药物组 合物，权利要求3、5或7-11中任一项的双特异性抗体分子，或权利要求6-11中任一项的方 法，其中，所述经转导的⑶8+T-细胞还包括天然地存在于所述T-细胞上的T-细胞受体和 /或通过基因工程引入所述T-细胞的T-细胞受体。
13. 权利要求1，2或8-12中任一项的试剂盒，权利要求4或8-12中任一项的药物组 合物，权利要求3、5或7-12中任一项的双特异性抗体分子，或权利要求6-12中任一项的方 法，其中，所述的双特异性抗体分子由核酸序列编码。
14. 载体，其包含权利要求13的核酸序列。
15. 权利要求14的载体，其中，所述的载体还包括与权利要求13的核酸序列可操作连 接的调节序列。
16. 权利要求14或权利要求15的载体，其中，所述的载体是表达载体。
17. 用权利要求14-16中任一项所定义的载体转化的宿主细胞。
18. 用于生产权利要求1-11中任一项所定义的双特异性抗体分子的方法，所述方法包 括： (a) 在允许如权利要求1-11中任一项所定义的双特异性抗体分子表达的条件下，培养 权利要求17所定义的宿主细胞；和 (b) 从所述的培养物中回收所产生的双特异性抗体分子。
19. 权利要求1-11中任一项所定义的双特异性抗体分子，其包含： (i) 与CD8+T-细胞上的抗原结合的第一结合结构域，所述的抗原非天然地存在于 ⑶8+T-细胞之中或之上；和 (ii) 与天然地存在于肿瘤细胞表面上的肿瘤-特异性抗原结合的第二结合结构域， 其中，所述的抗体分子由权利要求18的方法生产。
20. 在受试者中治疗疾病的方法，其包括下述步骤： (a) 由受试者分离CD8+T-细胞； (b) 如上述权利要求1-11中任一项所述，用非天然地存在于所述⑶8+T-细胞之中和/ 或之上的抗原转导上述分离的⑶8+T-细胞；和 (c) 将所述经转导的CD8+T-细胞施用于所述受试者。
21. 权利要求20的方法，其中，所述经转导的CD8+T-细胞通过静脉输注施用于所述受 试者。
22. 权利要求20或21的方法，其中，所述经转导的CD8+T-细胞与T-细胞受体共-转 导。
23. 权利要求20-22任一项的方法，其中，所述经转导的⑶8+T-细胞通过抗-⑶3和 抗-⑶28抗体扩增。
24. 权利要求23的方法，其中，所述经转导的CD8+T-细胞的扩增在细胞因子，优选白介 素-2(IL-2)和/或白介素-15(IL-15)存在下进行。
25. 权利要求20-24任一项的方法，其还包括： (d) 将权利要求1-11或19中任一项所定义的双特异性抗体分子施用于所述受试者。
26. 权利要求20-25中任一项的疾病治疗方法，其中，所述的双特异性抗体在所述经转 导的CD8+T-细胞施用之前、同时或之后施用。
27. 权利要求20-26中任一项的疾病治疗方法，其中，所述的疾病是恶性疾病。
28. 权利要求27的治疗方法，其中，所述的恶性疾病选自起源于上皮、内皮或间皮的癌 以及血液癌症。
【文档编号】C07K16/30GK104379601SQ201380016362
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2013年1月24日 优先权日:2012年2月3日
【发明者】C.布尔奎因, R.卡斯托尔蒂, S.恩德雷斯, C.克莱恩, S.科博尔德, G.尼德菲尔纳, C.苏斯特曼 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司, 慕尼黑路德韦格马克西米利安斯大学