一种灵菌红素的分离纯化方法
【专利摘要】本发明属于生物化学【技术领域】，涉及一种直接从发酵液中分离纯化灵菌红素的方法。本发明公开了一种灵菌红素的分离纯化方法，发酵液离心后，经超声波提取、浓缩、乙酸乙酯溶解、硅胶层析、浓缩干燥，得到精制灵菌红素。本发明采用超声波破壁技术，具有操作简便、效率高、成本低、有效成分不被破坏等优点。本发明制备的灵菌红素纯度≥98.5％，工艺适于规模化生产需求。
【专利说明】一种灵菌红素的分离纯化方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物化学【技术领域】，涉及一种直接从发酵液中分离纯化灵菌红素的方 法。
【背景技术】
[0002] 灵菌红素（prodigiosins，PG)是一类具有多个批咯环结构的天然红色素，分子式 为C 2QH25N30(M = 323. 1968)，其结构式见附图1。
[0003] 灵菌红素1929年由Amak等研究发现，由Harashiniak等首次分离并纯化鉴定出 来。灵菌红素早期的研究主要集中在该色素具有抗菌、抗真菌、抗症疾、和其他生物活性，现 在研究最热门的表现在其免疫抑制活性和抗肿瘤辅助作用上，这种天然的抗癌药物，己越 来越受到研究界的广大关注并有待成为抗癌药的待选药物。近些年关于灵菌红素的研究还 包括其在食品和工业领域的应用价值。
[0004] 早在20世纪早期，就有科学家描述了灵菌红素化学合成的全过程，但比较复杂和 困难。随后有新研究提出了新的制备灵菌红素类似物的方案得到灵菌红素前体物质，步骤 简单，合成效率明显提高，但无法得到天然的十二烷基灵菌红素。利用化学合成法大量制 备灵菌红素一直未能实施，研究人员将目光转向了微生物发酵生产。灵菌红素可由多种细 菌和放线菌产生，包括链霉菌属（Streptomyces)、沙雷氏菌属（Serratia)和假单胞菌属 (Pseudomonas),其中关于沙雷氏菌属（Serratia)的研究最多。
[0005] 灵菌红素是细胞壁的组成部分，在Serratia发酵生产灵菌红素的过程中，产生的 灵菌红素大部分附着在细菌的内外膜上，只有少部分呈游离状态存在于发酵液中，通过加 入表面活性剂可将灵菌红素释放到溶液中，从而增加游离态灵菌红素的比例，而细胞膜的 完整性对于灵菌红素的生物合成是必需的。基于此，灵菌红素的分离纯化过程主要采取发 酵结束后离心取菌体，然后用酸性甲醇萃取的方法，萃取液再经过硅胶柱和反向柱分离纯 化得到灵菌红素纯品。此技术是目前灵菌红素分离纯化的主要方法，该工艺有机溶剂耗量 大，产品收率低，很难满足批量生产的需要。
[0006] 为了克服以上技术难题，本发明提供一种灵菌红素的分离纯化方法。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于解决现有技术缺陷，提供一种灵菌红素的分离纯化方法，为规 模化生产提供依据。与现有技术相比，本发明提取收率高、化学试剂用量少、用时短和产品 纯度高。
[0008] 本发明的技术方案是：一种灵菌红素的分离纯化方法，包括以下步骤：
[0009] 步骤一、取灵菌红素发酵液离心，收集菌体，溶解；
[0010] 步骤二、将步骤一中的溶液进行超声波提取，提取时间为20?30min，温度为25? 28°C，频率为30?45kHz，离心，真空浓缩；
[0011] 步骤三、将所得浓缩物加入乙酸乙酯溶解，密封振荡，离心，收集上清液；
[0012] 步骤四、将所述上清液进行硅胶柱层析，收集洗脱组分；
[0013] 步骤五、将所述洗脱组分经常压蒸发浓缩去乙酸乙酯等溶剂，将浓缩液烘干，得到 精制灵菌红素。
[0014] 优选的是，所述的灵菌红素的分离纯化方法中，所述步骤四中，硅胶柱层析法进行 梯度洗脱的流动相为石油醚和乙酸乙酯的混合溶液，梯度洗脱的条件为起始阶段石油醚和 乙酸乙酯体积比为60 : 1，中间阶段石油醚和乙酸乙酯体积比为50 : 1和20 : 1，最终阶 段石油醚和乙酸乙酯体积比为4 : 1，收集最终阶段洗脱下来的组分。
[0015] 优选的是，所述的灵菌红素的分离纯化方法中，所述步骤四中，所述硅胶柱层析法 的载体为200目硅胶层析柱。
[0016] 优选的是，所述的灵菌红素的分离纯化方法中，所述步骤一中，灵菌红素发酵液在 转速为l〇〇〇〇rpm下进行离心，离心时间为10?15min。
[0017] 优选的是，所述的灵菌红素的分离纯化方法中，所述步骤一中，收集菌体后，加入 丙酮溶解所述菌体，所述菌体与丙酮的体积比为1 : 3?1 : 2。
[0018] 优选的是，所述的灵菌红素的分离纯化方法中，所述步骤二中，超声波提取液在转 速为lOOOOrpm下离心10?15min。
[0019] 优选的是，所述的灵菌红素的分离纯化方法中，所述步骤三中，乙酸乙酯与浓缩物 的体积比为10 : 1?15 : 1，密封之后，在温度为30°C下，转速为200rpm振荡2?3天。
[0020] 优选的是，所述的灵菌红素的分离纯化方法中，所述步骤三中，将振荡后的溶液在 转速为l〇〇〇〇rpm下进行离心，离心时间为10min。
[0021] 优选的是，所述的灵菌红素的分离纯化方法中，所述步骤五中，精制得到的灵菌红 素纯度不低于98. 5%。
[0022] 本发明的优点在于：
[0023] 1、基于超声波空化作用，在提取时间为20?30min，温度为25?28°C，频率为 30?45kHz条件下，促进发酵液细胞破壁，使更多的灵菌红素进入料液中；
[0024] 2、利用硅胶柱层析梯度洗脱分离方法，使收集到的灵菌红素纯度达到98. 5%以 上，而且可大量处理灵菌红素；
[0025] 3、过程操作简便、效率高、不破坏有效成分；
[0026] 4、有机溶剂可回收循环利用，节约了有机溶剂的用量。
【专利附图】
【附图说明】
[0027] 图1是灵菌红素结构式；
[0028] 图2是精制灵菌红素的工艺流程图。
【具体实施方式】
[0029] 下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文 字能够据以实施。
[0030] 如图2所示，本发明所述的灵菌红素的分离纯化方法，包括以下步骤：
[0031] 步骤一、取灵菌红素发酵液离心，收集菌体，溶解；
[0032] 步骤二、将步骤一中的溶液进行超声波提取，提取时间为20?30min，温度为25? 28°C，频率为30?45kHz，离心，真空浓缩；
[0033] 步骤三、将所得浓缩物加入乙酸乙酯溶解，密封振荡，离心，收集上清液；
[0034] 步骤四、将所述上清液进行硅胶柱层析，收集洗脱组分；
[0035] 步骤五、将所述洗脱组分经常压蒸发浓缩去乙酸乙酯等溶剂，将浓缩液烘干，得到 精制灵菌红素。。
[0036] 所述的灵菌红素的分离纯化方法中，所述步骤四中，硅胶柱层析法进行梯度洗脱 的流动相为石油醚和乙酸乙酯的混合溶液，梯度洗脱的条件为起始阶段石油醚和乙酸乙酯 体积比为60 : 1，中间阶段石油醚和乙酸乙酯体积比为50 : 1和20 : 1，最终阶段石油醚 和乙酸乙酯体积比为4 : 1，收集最终阶段洗脱下来的组分。
[0037] 所述的灵菌红素的分离纯化方法中，所述步骤四中，所述硅胶柱层析法的载体为 200目硅胶层析柱。
[0038] 所述的灵菌红素的分离纯化方法中，所述步骤一中，灵菌红素发酵液在转速为 lOOOOrpm下进行离心，离心时间为10?15min。
[0039] 所述的灵菌红素的分离纯化方法中，所述步骤一中，收集菌体后，加入丙酮溶解所 述菌体，所述菌体与丙酮的体积比为1 : 3?1 : 2。
[0040] 所述的灵菌红素的分离纯化方法中，所述步骤二中，超声波提取液在转速为 lOOOOrpm 下离心 10 ?15min。
[0041] 所述的灵菌红素的分离纯化方法中，所述步骤三中，乙酸乙酯与浓缩物的体积比 为10 : 1?15 : 1，密封之后，在温度为30°C下，转速为200rpm振荡2?3天。
[0042] 所述的灵菌红素的分离纯化方法中，所述步骤三中，将振荡后的溶液在转速为 lOOOOrpm下进行离心，离心时间为10min。
[0043] 所述的灵菌红素的分离纯化方法中，所述步骤五中，精制得到的灵菌红素纯度不 低于98. 5%。
[0044] 上述所用到的所有有机溶剂可真空浓缩回收，循环利用。
[0045] 本发明同时做了两组对比试验A和B。
[0046] 对比试验A
[0047] 1、取30L发酵液，在lOOOOrpm下离心10min，收集菌体，加60L丙酮充分混和，溶 解。
[0048] 2、将含灵菌红素的混合溶液真空旋转蒸发浓缩。
[0049] 3、将上述浓缩物加15倍体积乙酸乙酯溶解，密封，在30°C下，200rpm振荡2天，在 lOOOOrpm下离心10min，收集上清液。
[0050] 4、将所得上清液上200目硅胶层析柱，石油醚、乙酸乙酯混合液进行梯度洗脱，控 制石油醚：乙酸乙酯起始配比为60 : 1，中间阶段50 : 1和20 : 1，最终配比为4 : 1，收 集石油醚与乙酸乙酯的比例为4:1时洗脱下来的组分。
[0051] 5、再将洗脱组分经常压蒸发浓缩去乙酸乙酯等溶剂，将浓缩液烘干，得到精制灵 菌红素340. 0g，纯度95. 12 %。
[0052] 对比试验B
[0053] 1、取30L发酵液，在lOOOOrpm下离心10min，收集菌体，加60L丙酮充分混和，溶 解。
[0054] 2、将上述溶液进行超声波处理，提取时间为25min，超声温度为25°C，超声频率为 30kHz，在lOOOOrpm下离心lOmin，真空旋转蒸发浓缩。
[0055] 3、将上述浓缩物加15倍体积乙酸乙酯溶解，密封，在30°C下，200rpm振荡2天，在 lOOOOrpm下离心lOmin，收集上清液。
[0056] 4、将所得上清液上200目硅胶层析柱，石油醚、乙酸乙酯混合液进行梯度洗脱，控 制石油醚：乙酸乙酯起始配比为50 : 1，中间阶段20 : 1和10 : 1，最终配比为5 : 1，收 集石油醚与乙酸乙酯的比例为5:1时洗脱下来的组分。
[0057] 5、再将洗脱组分经常压蒸发浓缩去乙酸乙酯等溶剂，将浓缩液烘干，得到精制灵 菌红素343. 4g，纯度96. 09 %。
[0058] 实施例1
[0059] 1、取30L发酵液，在lOOOOrpm下离心lOmin，收集菌体，加60L丙酮充分混和，溶 解。
[0060] 2、将上述溶液进行超声波处理，提取时间为25min，超声温度为25°C，超声频率为 30kHz，在lOOOOrpm下离心lOmin，真空旋转蒸发浓缩。
[0061] 3、将上述浓缩物加15倍体积乙酸乙酯溶解，密封，在30°C下，200rpm振荡2天，在 lOOOOrpm下离心lOmin，收集上清液。
[0062] 4、将所得上清液上200目硅胶层析柱，石油醚、乙酸乙酯混合液进行梯度洗脱，控 制石油醚：乙酸乙酯起始配比为60 : 1，中间阶段50 : 1和20 : 1，最终配比为4 : 1，收 集石油醚与乙酸乙酯的比例为4:1时洗脱下来的组分。
[0063] 5、再将洗脱组分经常压蒸发浓缩去乙酸乙酯等溶剂，将浓缩液烘干，得到精制灵 菌红素352. 5g，纯度98. 63 %。
[0064] 实施例2
[0065] 1、取30L发酵液，在lOOOOrpm下离心lOmin，收集菌体，加60L丙酮充分混和，溶 解。
[0066] 2、将上述溶液进行超声波处理，提取时间为25min，超声温度为25°C，超声频率为 35kHz，在lOOOOrpm下离心lOmin，真空旋转蒸发浓缩。
[0067] 3、将浓缩物加12倍体积乙酸乙酯溶解，密封，在温度30°C下，200rpm振荡2天，再 在lOOOOrpm下离心lOmin，收集上清液。
[0068] 4、将所得上清液上200目硅胶层析柱，石油醚、乙酸乙酯混合液进行梯度洗脱，控 制石油醚：乙酸乙酯起始配比为60 : 1，中间阶段50 : 1和20 : 1，最终配比为4 : 1，收 集石油醚与乙酸乙酯的比例为4:1时洗脱下来的组分。
[0069] 5、再将洗脱组分经常压蒸发浓缩去乙酸乙酯等溶剂，将浓缩液烘干，得到精制灵 菌红素359. 8g，纯度98. 59 %。
[0070] 实施例3
[0071] 1、取30L发酵液lOOOOrpm离心15min，收集菌体，加90L丙酮充分混和，溶解。
[0072] 2、将上述溶液进行超声波处理，提取时间为30min，超声温度为26°C，超声频率为 40kHz，在lOOOOrpm下离心15min，真空旋转蒸发浓缩。
[0073] 3、将浓缩物加10倍体积乙酸乙酯溶解，密封，在温度30°C下，200rpm振荡3天，然 后在lOOOOrpm下离心lOmin，收集上清液。
[0074] 4、将所得上清液上200目硅胶层析柱，石油醚、乙酸乙酯混合液进行梯度洗脱，控 制石油醚：乙酸乙酯起始配比为60 : 1，中间阶段50 : 1和20 : 1，最终配比为4 : 1，收 集石油醚与乙酸乙酯的比例为4:1时洗脱下来的组分。
[0075] 5、洗脱组分经常压蒸发浓缩去乙酸乙酯等溶剂，将浓缩液烘干，得到精制灵菌红 素 370. 6g，纯度 98. 72%。
[0076] 实施例4
[0077] 1、取30L发酵液lOOOOrpm离心15min，收集菌体，加60L丙酮充分混和，溶解。
[0078] 2、将上述溶液进行超声波处理，提取时间为30min，超声温度为28°C，超声频率为 30kHz，lOOOOrpm离心15min，真空旋转蒸发浓缩。
[0079] 3、将浓缩物加15倍体积乙酸乙酯溶解，密封，在温度30°C下，200rpm振荡3天，在 lOOOOrpm下离心10min，收集上清液。
[0080] 4、将上清液上200目硅胶层析柱，石油醚、乙酸乙酯混合液进行梯度洗脱，控制石 油醚：乙酸乙酯起始配比为60 : 1，中间阶段50 : 1和20 : 1，最终配比为4 : 1，收集石 油醚与乙酸乙酯的比例为4:1时洗脱下来的组分。
[0081] 5、洗脱组分经常压蒸发浓缩去乙酸乙酯等溶剂，将浓缩液烘干，得到精制灵菌红 素 368. 2g，纯度 98. 75%。
[0082] 实施例5
[0083] 1、取30L发酵液lOOOOrpm离心15min，收集菌体，加90L丙酮充分混和，溶解。
[0084] 2、将上述溶液进行超声波处理，提取时间为30min，超声温度为28°C，超声频率为 45kHz，lOOOOrpm离心15min，真空旋转蒸发浓缩。
[0085] 3、浓缩物加15倍体积乙酸乙酯溶解，密封，在温度30°C下，200rpm振荡3天，然后 在lOOOOrpm下离心10min，收集上清液。
[0086] 4、将所得上清液上200目硅胶层析柱，石油醚、乙酸乙酯混合液进行梯度洗脱，控 制石油醚：乙酸乙酯起始配比为60 : 1，中间阶段50 : 1和20 : 1，最终配比为4 : 1，收 集石油醚与乙酸乙酯的比例为4:1时洗脱下来的组分。
[0087] 5、洗脱组分经常压蒸发浓缩去乙酸乙酯等溶剂，将浓缩液烘干，得到精制灵菌红 素 373. 4g，纯度 98. 66%。
[0088] 本发明得到的灵菌红素纯度达到98. 5%以上，对比试验A的产品纯度为95. 12%， 对比试验B的产品纯度为96. 09 %，均小于98. 5 %。由此可知，对灵菌红素进行超声波提取， 然后进行硅胶层析分离提纯，这样得到的灵菌红素的纯度是最高的。
[0089] 超声波萃取时，溶剂内部溶解了一些微气泡，这些气泡在超声波的作用下产生振 动，当声压达到一定值时，气泡由于定向扩散而增大，形成共振腔，然后突然闭合，气泡在闭 合时会在其周围产生几千个大气压的压力，形成微激波，它可造成发酵液细胞壁破裂，而且 整个破裂过程在瞬间完成，有利于有效成分的溶出。超声波在溶剂的传播过程中，其声能不 断被溶剂的质点吸收，溶剂将所吸收的能量全部或大部分转变成热能，增大了灵菌红素的 溶解速度，由于这种吸收声能引起的灵菌红素内部温度的升高是瞬间的，因此灵菌红素的 生物活性保持不变。
[0090] 尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列 运用，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等 同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实例。
【权利要求】
1. 一种灵菌红素的分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤： 步骤一、取灵菌红素发酵液离心，收集菌体，溶解； 步骤二、将步骤一中的溶液进行超声波提取，提取时间为20?30min，温度为25? 28°C，频率为30?45kHz，离心，真空浓缩； 步骤三、将所得浓缩物加入乙酸乙酯溶解，密封振荡，离心，收集上清液； 步骤四、将所述上清液进行硅胶柱层析，收集洗脱组分； 步骤五、将所述洗脱组分经常压蒸发浓缩去乙酸乙酯等溶剂，将浓缩液烘干，得到精制 灵菌红素。
2. 如权利要求1所述的灵菌红素的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤四中，硅胶 柱层析法进行梯度洗脱的流动相为石油醚和乙酸乙酯的混合溶液，梯度洗脱的条件为起始 阶段石油醚和乙酸乙酯体积比为60 : 1，中间阶段石油醚和乙酸乙酯体积比为50 : 1和 20 : 1，最终阶段石油醚和乙酸乙酯体积比为4 : 1，收集最终阶段洗脱下来的组分。
3. 如权利要求2所述的灵菌红素的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤四中，所述硅 胶柱层析法的载体为200目硅胶层析柱。
4. 如权利要求1所述的灵菌红素的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤一中，灵菌红 素发酵液在转速为l〇〇〇〇rpm下进行离心，离心时间为10?15min。
5. 如权利要求4所述的灵菌红素的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤一中，收集菌 体后，加入丙酮溶解所述菌体，所述菌体与丙酮的体积比为1 : 3?1 : 2。
6. 如权利要求1所述的灵菌红素的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤二中，超声波 提取液在转速为lOOOOrpm下离心10?15min。
7. 如权利要求1所述的灵菌红素的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤三中，乙酸乙 酯与浓缩物的体积比为10 : 1?15 : 1，密封之后，在温度为30°C下，转速为200rpm振荡 2?3天。
8. 如权利要求7所述的灵菌红素的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤三中，将振荡 后的溶液在转速为l〇〇〇〇rpm下进行离心，离心时间为10min。
9. 如权利要求1所述的灵菌红素的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤五中，精制得 到的灵菌红素纯度不低于98. 5 %。
【文档编号】C07D207/44GK104193665SQ201410387848
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年8月8日 优先权日:2013年8月30日
【发明者】张春颖, 杨旭锦 申请人:西藏天虹科技股份有限责任公司