树突状细胞靶向肽及编码基因及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种树突状细胞靶向肽及编码基因及应用，树突状细胞靶向肽，命名为NP，是序列表中SEQ ID NO.1所述的氨基酸序列。本发明以树突状细胞为靶细胞，对噬菌体随机肽库进行消减筛选，从众多短肽中筛选出一个高效靶向树突状细胞的靶向肽。本发明以树突状细胞靶向肽与肿瘤相关抗原MUC1的融合，显著提高了树突状细胞的抗原呈递能力和对大多数肿瘤如宫颈癌，乳腺癌的等的杀伤能力。在大多数癌症的诊疗中有具有广泛的应用价值。
【专利说明】树突状细胞靶向肽及编码基因及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及树突状细胞靶向肽、编码基因、包含树突状细胞靶向肽的融合肽、重组 表达载体、转基因细胞系及应用。
【背景技术】
[0002] 癌症是全球导致死亡的主要原因之一，2007年全球死于癌症的人数达到790万， 约占所有死亡人数的13%，发病率呈逐年上升趋势。其治疗主要以手术、化疗和放疗为主， 但放化疗副作用大，疗效都不是很理想。目前，免疫细胞治疗正在成为一种新的癌症治疗手 段。
[0003] 随着分子生物学和免疫学等基础学科的飞速发展，对肿瘤的研究日益深入，特别 是近十几年来，多种与肿瘤的发生发展密切相关的肿瘤抗原被发现，这些抗原可以作为癌 症免疫治疗的靶标。肿瘤特异性的抗原可以通过树突状细胞递呈给T细胞，启动T细胞的 特异性杀伤肿瘤的能力。（Banchereau，J.，andSteinman，R.M.(l998)Dendriticcells andthecontrolofimmunity.Nature392, 245 - 2522.Palucka,K. ,Banchereau,J. ,and Mellman,I. (2010)Designingvaccinesbasedonbiologyofhumandendritic cellsubsets.Immunity33, 464 - 478)。如何让抗原准确高效的到达树突状细胞，是肿瘤免 疫治疗的关键。噬菌体展示技术为我们提供了一种筛选树突状细胞靶向分子的方法。
[0004] 噬菌体展示技术，在1985年首次被Smith阐述，原理是通过将外源蛋白或肽段 的基因克隆到丝状噬菌体的基因组DNA中，与噬菌体的外壳蛋白形成融合蛋白，从而使 该外源分子呈现于噬菌体表面。该技术的主要特点是将特定分子的基因型和表型统一在 同一噬菌体颗粒内，即在噬菌体表面表达特定蛋白，而在噬菌体核心DNA中含有该蛋白 的结构基因，通过表型筛选就可以获得其编码基因，因此噬菌体展示技术是一种强有 力的基因表达筛选技术。噬菌体展不肤库技术具有_库容、_效方便及灵活的筛选技术 等特点，近几年已经广泛用于抗肿瘤疫苗，药物，及肿瘤诊断标志物的筛选研发（Johnson DH.Targetedtherapyinnon-smallcelllungcancer,mythandreality[J].lung Cancer, 2003, 41(suppl1):S3-S8)
[0005]MUC1又称附膜蛋白，是由mucl基因表达的一种高分子量，高糖基化蛋白，它 一种是跨膜分子。它在上皮更新与分化，维持上皮完整性和癌的发生与转移等方面都起到 重要的作用(MoniauxN,EscandeF,PorchetN,etalStructuralorganizationand classificationofthehumanmucingenes〔J〕FrontBiosci,2001 ;6 (1):D1192 206)。 正常情况下，MUC1可在多种组织、器官中的上皮细胞如消化道、呼吸道、乳腺、胰腺、生殖道 中表达，主要分布于腺细胞顶膜或以分泌形式存在于腺腔内，不被免疫系统识别。而在恶性 肿瘤细胞中，乳腺癌、胃癌、结肠癌等多种癌组织中，MUC1表达量可达正常时的10倍以上， 且结构发生改变，使MUC1的核心蛋白暴露出新的蛋白表位或新的糖抗原，分布于整个癌细 胞表面，作为肿瘤特异的抗原，成为免疫细胞攻击祀点（MilesDW，TaylorPapadimitriou JTherapeuticaspectsofpolymorphicepithelialmucininadenocarcinoma〔J〕 PharmacolTher,1999 ；82 (1):97 106),
【发明内容】
[0006] 本发明的目的提供一种高效靶向的树突状细胞靶向肽。
[0007] 本发明的第二个目的是提供一种树突状细胞靶向肽的编码基因。
[0008] 本发明的第三个目的是提供一种包含树突状细胞靶向肽的融合肽。
[0009] 本发明的第四个目的是提供一种包含编码树突状细胞靶向肽的基因的重组表达 载体。
[0010] 本发明的第五个目的是提供一种包含编码树突状细胞靶向肽的基因的转基因细 胞系。
[0011] 本发明的第六个目的是提供一种树突状细胞靶向肽的编码基因的重组菌。
[0012] 本发明的第七个目的是提供一种树突状细胞靶向肽在预防和治疗癌症药物中的 应用。
[0013] 一种树突状细胞靶向肽，命名为NP，是序列表中SEQIDNO. 1所述的氨基酸序列。
[0014] 编码上述树突状细胞靶向肽的基因，是SEQIDN0. 2所述的核苷酸序列。
[0015] 包含上述树突状细胞靶向肽的融合肽，融合肽是以Cys为linker将树突状细胞靶 向肽序列与MUCI肿瘤抗原多肽序列链接在一起，所述融合肽如SEQIDN0. 3所示。
[0016] 包含编码树突状细胞靶向肽的基因的重组表达载体，所述重组表达载体为重组噬 菌体。
[0017] 包含编码树突状细胞靶向肽的基因的转基因细胞系，所述细胞系为导入重组表达 载体的转基因细胞系。
[0018] 含有树突状细胞靶向肽的编码基因的重组菌，所述重组菌为导入重组表达载体的 重组菌。
[0019] 上述一种树突状细胞靶向肽在制备预防和治疗癌症药物中的应用。
[0020] 本发明的优点：
[0021] (1)靶向性和DC细胞富集能力：筛选出的树突状细胞靶向肽可以与树突状细胞靶 向结合，将肿瘤特异性抗原（例如MUC1)与靶向肽融合之后，靶向肽就可以精确的将肿瘤特 异性抗原定位并富集到DC细胞表面。
[0022] (2)高效抗原递呈能力：本发明中采用特殊的柔性Linker设计将靶向肽与肿瘤抗 原融合在一起，这样使肿瘤抗原的表达相对独立，从而使DC细胞能高效递呈肿瘤抗原，进 而提_对肿瘤的杀伤能力。
[0023] (3)安全性：本发明中筛选的树突状细胞靶向肽是一个七肽，与病毒载体相比较， 不包含对细胞有害的转染试剂和病毒成分，不存在外源基因污染的问题，不会引起不良免 疫反应以及不存在致突变风险。因此，与病毒载体靶向技术相比，本发明中的靶向技术安全 性极高。
[0024] (4)本发明以树突状细胞为靶细胞，对噬菌体随机肽库进行消减筛选，从众多短肽 中筛选出一个高效靶向树突状细胞的靶向肽。本发明以树突状细胞靶向肽与肿瘤相关抗原 MUC1的融合，显著提高了树突状细胞的抗原呈递能力和对大多数肿瘤如宫颈癌，乳腺癌的 等的杀伤能力。在大多数癌症的诊疗中有具有广泛的应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0025] 图1树突状细胞靶向的噬菌体筛选。
[0026] 图2噬菌体克隆结合树突状细胞的能力。
[0027] 图3靶向融合肽结合树突状细胞的能力。
[0028] 图4激光共聚焦显微镜观察DC细胞吸收能力。
[0029] 图PH-TdR掺入实验。
[0030] 图6CTL(细胞毒性T淋巴细胞）体外杀伤MUC1阳性肿瘤实验。
【具体实施方式】
[0031] 本发明通过噬菌体展示技术从随机七肽库中筛选得到了一种可以高效靶向树突 状细胞的多肽，并与MUC1肿瘤特异性多肽抗原融合，利用多肽固相合成方法合成了 "树突 状细胞靶向融合肽"。并对其树突状细胞靶向能力、树突状细胞致敏能力和激活CTL(细胞 毒性T淋巴细胞）细胞肿瘤杀伤能力进行了评价。
[0032] 下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的阐述。
[0033] 实施例1
[0034] 以树突状细胞为靶细胞筛选获得本发明的树突状细胞靶向肽，本发明利用商品化 的噬菌体展示七肽库（NewEnglandBioLabs公司），来筛选获得祀向树突状细胞的革巴向 肽：
[0035] 1.以树突状细胞为靶细胞进行筛选：
[0036] (1)获取树突状细胞：
[0037] 从健康人的外周血中分离单个核细胞（peripheralblood mononuclearcell，PBMC)，经体外诱导培养获取成熟树突状细胞，方法：
[0038] ①取健康人新鲜外周血，加入淋巴细胞分离液，经密度梯度离心法分离，获得单 个核细胞。
[0039] @在含10%胎牛血清的1?^1-1640培养基中培养.置371：、5%〇) 2培养箱内静 直培养2h后除去悬浮细胞。
[0040] ③培养液中加入rhGM-CSF和rhIL-4继续培养贴壁细胞5d，然后加入TNF-a促 进其分化成熟。
[0041] ④倒置显微镜下观察树突状细胞形态，流式细胞仪（flowcytometer,FCM)对其进 行表型鉴定。
[0042] ⑤在显微镜到观察树突状细胞形态不规则，表面有大量的毛刺状突起；越成熟的 树突状细胞表面⑶83、⑶80分子表达明显增高。
[0043] (2)以树突状细胞为固相筛选目标来筛选：
[0044] 噬菌体随机七肽库的体外消减筛选，树突状细胞为靶细胞，进行3轮消减筛选，并 逐渐增加筛选强度。所得噬菌体经扩增、滴定。具体步骤如下：选择生长状态良好的树突状 细胞一瓶（细胞总数约5X106个）；倾去原有的培养基，然后用洗脱液PBST充分洗脱3遍， 去除杂蛋白的的干扰；加入用PBST稀释到10n/ml的噬菌体随机七肽库约lml后继续孵育 lh。用PBST充分洗脱3遍，去除未结合的噬菌体；再次用PBST强力洗脱3遍，去除特异性 结合但结合不紧密的噬菌体；后采用细胞刮刀收集贴壁的细胞以及结合在上面的候选噬菌 体；收集物加入预先准备好的感受态细菌（大肠杆菌）中进行扩增，然后采用常规的纯化方 法扩增后进行第三轮的筛选；将扩增好的洗脱物重复淘洗3次，获得与树突状细胞紧密特 异性结合的噬菌体克隆。实验结果如图1所示。
[0045] 2?阳性噬菌体克隆的ELISA鉴定：
[0046] 噬菌体肽库经过3轮减性筛选后，随机挑选10个噬菌体的单克隆，用常规ELISA 法来鉴定噬菌体克隆对树突状细胞的亲和力。具体步骤如下：将树突状细胞按IX105/孔 的密度接种于96孔板上，放到37°C、5%C02培养箱中；对细胞进行营养饥饿处理lh;用4% 的多聚甲醛固定20min，0. 1%的TritonX-100处理lOmin;用3%的BSA封闭lh，加入一定 浓度的噬菌体（大于1〇12) 37°C孵育2h;用PBST洗3次，加入抗体HRP-antiM13抗体，37°C 孵育lh;PBST洗5遍，之后每孔加入lOOul的TMB显色作用2min;用150ul，2M的H2S04终 止反应，用酶标仪测定反应液的A450值。随机挑取噬菌体原库斑作为对照，以排除非特异 性吸附的隐性噬菌体克隆对实验结果的影响，结果见图2。
[0047] 由图2可知，其中8号噬菌体单克隆对树突状细胞的亲合力最强，0D值为 (1.832±0. 008)，8号高于对照（空心柱为对照组）同时高于其他，对照为原库随机噬菌体 克隆，0D值为（0? 664±0. 02)P< 0? 05,n= 8。
[0048] 3.阳性噬菌体克隆的测序及靶向树突状细胞的靶向肽的合成：
[0049] 我们将筛选所得的8号噬菌体克隆进行测序，根据测序结果推出氨基酸序列为： GinTrpTyrLeuProLysLeu，用SEQIDNO. 1 所不。
[0050] 编码上述树突状细胞靶向肽的基因，序列为：CAAUAGUACUUGCCAAAGUUG，用SEQID NO. 2所示。
[0051] 实施例2:包含树突状细胞靶向肽的融合肽的获得
[0052] 1 ?包含树突状细胞靶向肽的融合肽（简称NP-MUC1)合成：
[0053] 将实施例1筛选到的树突状细胞靶向肽与MUC1肿瘤抗原多肽中间通过柔性 linker(Cys)相连接，合成包含树突状细胞靶向肽的融合肽，所述融合肽如SEQIDN0. 3所 示。同时制备荧光素FITC标记的该融合肽备用。
[0054] 2?融合肽与树突状细胞的结合能力鉴定：
[0055] 以树突状细胞为靶细胞对制备出来的融合肽NP-MUC1进行结合能力鉴定，以Hela 细胞作对照，具体步骤如下：
[0056] 将树突状细胞按1X105/孔的密度接种于96孔板上，放到37°C、5%C02培养箱中； 细胞进行营养胁迫处理2h;无水甲醇固定20min, 0. 1%的TritonX-100处理10min;5%的 脱脂牛奶封闭lh，以50ug/mL的浓度加入刚制备的融合肽NP-MUC1，37°C孵育2h;PBST洗5 次，加入MUC1的抗体，37°C孵育lh;PBST洗8遍，之后每孔加入100ul的TMB显色作用2min; 150ul，2M的H2S04终止反应，用酶标仪测定反应液的A450值。
[0057] 结果如图3所示，与HeLa细胞相比，融合肽NP-MUC1能特异靶向树突状细胞并与 其相结合。
[0058] 实施例3:融合肽效果评价
[0059] 1.抗原递呈细胞即树突状细胞对融合肽NP-MUC1的吸收
[0060] 利用激光共聚焦显微镜观察融合肽进入树突状细胞的效率。具体步骤如下：
[0061] 将树突状细胞接种于含有小玻片的六孔板中，37°C、5% 0)2培养箱中培养；然后加 入荧光素（FITC)标记的MUC1多肽或者FITC标记的融合肽NP-MUC1。孵育6小时后，洗去 培养基；4%多聚甲醛固定后10分钟，0. 1%Triton-xlOO打孔5分钟；然后加入DAPI染色 后，利用激光共聚焦显微镜观察抗原递呈细胞对MUC1多肽以及靶向融合肽NP-MUC1的吸收 效率。实验结果如图4所示，结果表明抗原呈递细胞对融合肽NP-MUC1的吸收效率显著高 于对MUC1多肽的吸收效率。（图4中A为抗原呈递细胞对MUC1多肽的吸收图；B为抗原呈 递细胞对融合肽NP-MUC1的吸收图）
[0062] 2.混合淋巴细胞反应（allo-MLR)测定抗原递呈细胞的抗原递呈能力
[0063] 分离和体外培养单核吞噬细胞和树突状细胞（DC)。然后用多肽（MUC1多肽、 NP-MUC1融合肽，对照多肽（对照肽序列为：LLLTVLTVV))体外致敏抗原递呈细胞（DC)， 不加多肽致敏的树突状细胞（DC)，共四组：①只有DC细胞②DC细胞+靶向融合肽 NP-MUC1③DC细胞+MUC1④DC细胞+阴性对照肽。
[0064] 取正常人外周血，常规分离单个核细胞（PBMC)，加入rhIL2培养5天，作为同种 异体效应细胞。
[0065] 向四组中分别加入丝裂霉素使浓度为25yg/ml，去增殖后，按各个组的细胞数与 效应细胞的细胞数的比例为1 : 10的比例，加入效应细胞，于37°C，5%C02培养箱培养6 天，收获前12小时加入3H-TdR(3H标记的胸腺嘧啶核苷），1yCi/孔。用细胞收集器收集 细胞，液体闪烁计数器检测3H掺入的cpm值，以下为四组中3H掺入的cpm值（图5)。结 果表明与其他对照肽相比，NP-MUC1融合肽显著更强地刺激了效应细胞的增殖。
[0066] 3.CTL(细胞毒性T淋巴细胞）体外杀伤MUC1阳性肿瘤的实验
[0067] 分离和体外培养树突状细胞（DC)。然后用上述多肽（对照多肽、MUC1多肽、 NP-MUC1融合肽）体外致敏抗原递呈细胞（即DC细胞）。
[0068] 取正常人外周抗凝血，常规分离PBMC，作为同种异体效应细胞。将各组诱导培养 的DC细胞，加入25yg/ml丝裂霉素，去增殖后作为刺激细胞。将刺激细胞和效应细胞 以1 : 10比例，于37°C，5%C02培养箱中培养5天，收集细胞作为CTL细胞。选用生 长良好的MDA-MB-231乳腺癌细胞（HLAclassA2. 1和MUC1阳性）加入Na251Cr041mCi/ ml，37°C，5%C02培养4小时后收集细胞作为靶细胞。将上述制备的CTL细胞与靶细胞以 5 : 1效靶比加入96孔圆底板中培养6小时，培养结束后，收集全部上清，用Y2能谱仪 测量上清中51Cr放射性含量（cpm)。
[0069]如图6所示，与其他多肽相比较，NP-MUC1融合肽刺激的CTL杀伤肿瘤细胞的能力 显著最强。
【权利要求】
1. 一种树突状细胞靶向肽，其特征是序列表中SEQ ID NO. 1所述的氨基酸序列。
2. 编码权利要求1树突状细胞靶向肽的基因，其特征是SEQ ID NO. 2所述的核苷酸序 列。
3. 包含权利要求1树突状细胞靶向肽的融合肽，所述融合肽是以Cys为linker将树 突状细胞靶向肽序列与MUCI肿瘤抗原多肽序列链接在一起，所述融合肽如SEQ ID NO. 3所 /_J、i 〇
4. 包含权利要求2所述基因的重组表达载体，其特征是所述重组表达载体为重组噬菌 体。
5. 包含权利要求2所述基因的转基因细胞系，其特征是所述细胞系为导入权利要求4 的重组表达载体的转基因细胞系。
6. 含有权利要求2所述基因的重组菌。
7. 根据权利要求6所述的重组菌，其特征是所述重组菌为导入权利要求4重组表达载 体的重组菌。
8. 权利要求1的一种树突状细胞靶向肽在制备预防和治疗癌症药物中的应用。
【文档编号】C07K7/06GK104387453SQ201410746503
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年12月8日 优先权日:2014年12月8日
【发明者】曹捷, 杨姗姗, 陈红波 申请人:深圳市同康生物医药有限公司