专利名称：抗癌抗生素力达霉素与单链抗体的组装融合蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种组装融合蛋白LDM-Fv，抗肿瘤侵袭转移的新型导向药物。
抗癌抗生素力达霉素(Lidamycin，LDM；亦称C1027)是本所从我国湖北省土壤分离得到的一株链霉菌产生的大分子肽类抗肿瘤活性物质，对癌细胞有极强的杀伤作用，其半数抑制克隆形成浓度(IC50)比阿霉素、丝裂霉素等强10000倍以上。是迄今国内外报道的对肿瘤细胞杀伤活性最强的大分子肽类抗肿瘤抗生素。其分子由力达蛋白(Lida-protein，LDP)和力达发色团(Lida-chromophore，LDC)两部分组成，具有烯二炔结构的发色团是活性成份，蛋白对发色团起保护作用，两者以非共价键结合，可拆分与组装重建。重建后的力达霉素分子同样具有天然力达霉素的高度活性。单克隆抗体(单抗)具有高度特异性，单抗导向药物对肿瘤细胞显示选择性杀伤，动物体内有显著的疗效。但一般单抗导向药物临床应用效果欠佳，主要问题之一是由于药物包括免疫毒素是蛋白质大分子物质，使用IgG单抗与蓖麻毒素A链制备的免疫毒素，分子量为180 kDa，与绿脓杆菌毒素制备的免疫毒素分子量190 kDa，在体内运送过程中受到多种因素制约难以进入肿瘤深部。因此，研制小型的单抗导向药物受到广泛重视。在肿瘤侵袭与转移过程中，IV型胶原酶降解IV型胶原，破坏基底膜的完整性。已证实肿瘤细胞的侵袭力与其IV型胶原酶活性呈正相关。肿瘤的生长依赖于新的血管生成以提供必须的营养。肿瘤诱导的血管生成不仅有助于原发瘤的生长，而且为肿瘤转移提供了通道。血管生成过程十分复杂，其核心环节是内皮细胞的增殖，而增殖内皮细胞的特征之一是IV型胶原酶活性增高，抑制IV型胶原酶(基质金属蛋白酶)可抑制血管生成。因此，IV型胶原酶是抗肿瘤侵袭转移的重要分子靶点。本发明所涉及的单链抗体scFv-M97能抑制IV型胶原酶活性。
本项发明的目的是采用DNA重组和分子组装重建的技术路线，制备抗癌抗生素力达霉素(Lidamycin，LDM)与单链抗体的组装融合蛋白(LDM-Fv)，以获得小型、高效的抗肿瘤侵袭转移的新型导向药物。经检索，目前国内外尚未见有类似发明的有关报道。
本项发明的内容与要点包括以下步骤1.力达蛋白-特异性单链抗体融合基因的构建重组质粒pAB和pC，分别含单链抗体scFv-M97和力达蛋白基因(本研究室保存)。表达质粒pKK223-3购自Pharmacia公司，含Tac启动子，宿主菌为E.coli JM109。用Promega公司盒提取质粒DNA用作PCR模板。PCR引物由赛百盛公司合成，PAGE纯化。
单链抗体基因引物上游引物5’CGGAATTCCATATGGCCCAGGTGAAGCTG 3’EcoRI下游引物5’CATGCCATGG TGA ACC GCC TCC ACC ATGTTTGATTTCCAGCTTG 3’NcoI Ser Gly Gly Gly Gly力达蛋白基因引物上游引物5’CATGCCATGGGGGCCCGCCTTCTCCGTCAGTC 3’NcoI下游引物5’CCCAAGCTTCTCAGCCGAAGGTCAGAGCCACGTGGCGGTC 3’Hind IIIPCR反应体系预变性96℃ 10分钟扩增 94℃ 1分钟60℃ 1分钟30个循环，最后在72℃延伸10分钟。将PCR扩增后(图2)的力达蛋白和scFv-M97基因片段及质粒pUC18用限制性内切酶消化，酶切产物纯化后以2∶2∶1的分子比进行连接反应，转化感受态E.coli JM109，鉴定重组子(图3a，b)，对阳性克隆进行DNA序列分析，融合基因长1083bP，编码361个氨基酸ATG GCC CAG GTG AAG CTG CAG GAG TCT GGA CCT GAA CTG GTG AAG CCT GGGGCT TTA GTG AAA ATA TCC TGC AAG GCT TCT GGT TAC ACC TTC ACA GAC TACGAT ATA AAC TGG GTG AAG CAG AGG CCT GGA CAG GGA CTT GAG TGG ATT GGACDR 1TGG ATT TAT CCT GGA GAT GGT AGT GCT AAG TAC AAT GAG AAG TTC AAG GGCCDR 2AAG GCC ACA CTG ACT GCA GAC AAA TCC TCC AGC ACA GCC TAC ATG CAG CTCAGC AGC CTG ACT TCT GAG AAC TCT GCA GTC TAT TTC TGT GCA AGA GGG CATCDR3AAC TTT GAC TAC TGG GGC CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA GGT GGAGGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC TCT GGC GGT GGC GGA TCG GAC ATC GAG CTCLinker 1ACT CAG TCT CCA GCT TCT TTG GCT GTG TCT CTA GGG CAG AGG GCC ACC ATATCC TGC AGA GCC AGT GAA AGT GTT GAT ACT TAT GGC GAT ACT TTT ATG TACCDR1TGG TAC CAG CAG AAA CCA GGA CAG CCA CCC AAC CTC CTC ATC TAT CTT GCACDR 2ACC AAC TTA GGA TCT GGG GTC CCT GCC AGG TTC ATT GGC AGT GGG TTT AGGACA AAC TTC ACC CTC ACC ATC GAT CCT GTG GGG GCT GAT GAT GCT GCA ACCTAT TAC TGT CAG CAA AAT AAT GAG GAT CCG TAC ACG TTC GGA GGG GGC ACCCDR 3AAG CTG GAA ATC AAA CAT GGT GGA GGC GGT TCA CCA TGG GCG CCC GCC TTCLinker 2 (Gly4 Ser) Nco ITCC GTC AGT CCC GCC TCG GGT CTG AGT GAC GGA CAG AGC GTG TCG GTG TCGGTC AGC GGT GCC GCC GCC GGC CAG ACC TAC TAC ATC GCC CAG TGC GCT CCGGTC GGT GGC CAG GAC GCG TGC AAC CCG GCG ACC GCG ACG TCC TTC ACC ACGGAC GTG TCC GGA GCG GCG TCG TTC AGC TTC GTC GTG CGC AAG TCG TAC ACGGTC TCC ACG CCC GAA GGC ACG CCG GTC GGC AGC GTC GAC TGC GCC ACG GCCGCC TGT AAC CTC GGC GCC GGC AAC TCC GGG CTC GAC CTC GGC CAC GTG GCTCTG ACC TTC GGC TGA AAG CTT GC。基因序列及读框均正确地再进一步亚克隆至表达质粒pKK223-3中(图4)。
2.力达蛋白-单链抗体融合蛋白LDP-Fv在大肠杆菌中的诱导表达及纯化融合基因的诱导表达在大肠杆菌JM109(本研究室保存)中进行。挑选单一阳性克隆，接种于含氨苄青霉素的LB培养基，37℃振荡过夜，次日按1∶50转种，当A600值约0.6时，加入IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)，终浓度为1.5mmol/L，进行诱导表达约3小时。菌体总蛋白处理诱导前后的样品离心，按每0.1A值10 ul PBS(磷酸缓冲夜)重悬菌体，加等体积2×上样缓冲液，沸水浴5分钟。菌体周间质提取液的制备取与上述体积相等的菌液，离心收集菌体，加5倍体积的外周质提取液(含溶菌酶1mg/ml，20％蔗糖，30mM Tris·Hcl，PH8.0，1mM乙二胺四乙酸)，冰浴30分钟，10000g离心，收集上清，即为菌体外周质提取液。沉淀系包涵体，用6mol/L盐酸胍，20mmol/L Tris·Hcl(pH8.0)，1mmol/L EDTA，5mmol/L二硫苏糖醇的溶液溶解，即为包涵体抽提物。表达产物经12％SDS-PAGE电泳后(图5)，Bio-Rad电转移槽中进行转膜(200mA，6h)，转移后的醋酸纤维素膜用小鼠抗力达蛋白单克隆抗体及HRP标记的二抗进行显色鉴定(图6)。
3.组装融合蛋白LDM-Fv制备取溴化氰活化的Sepharose 4B 4g干胶，用1mol/L的盐酸充分膨胀，以每克干胶30mg抗力达蛋白单抗(本研究室保存)包被2小时。菌体外周质提取液经PBS透析，用F9(抗力达蛋白)-Sepharose 4B亲和层析柱纯化。依次用PBS，PBS+2.5mol/L NaCl和0.1mol/L的甘氨酸-盐酸缓冲液洗脱，将第II蛋白峰用0.3mol/L Tris-HCl(pH8.0)缓冲液中和再用PBS透析、浓缩、冷冻干燥。取高活性力达霉素冻干品，加冷甲醇振摇5分钟，-20℃放置1小时，中间振摇1次；在0℃，12000转/分钟离心20分钟，上清液含发色团，沉降物为力达蛋白，重复提取2次。发色团甲醇液蒸发浓缩，-70℃储存。发色团不稳定，实验需低温、避光进行。取力达蛋白-单链抗体融合蛋白溶于0.01mol/L PBS(pH7.0)中，加入5倍分子量的发色团，振摇混合5分钟，-20℃ 放置过夜，Sephadex G-50柱层析，收集蛋白部分。
4.组装融合蛋白LDM-Fv的免疫学活性以104/孔的密度将高转移性人肺巨细胞癌PG细胞和人肝癌BEL7402细胞接种于96孔板中，37℃培养过夜。弃上清后，以0.125％戊二醛固定细胞，1％BSA封闭，将待测抗体加入细胞板中，孵育洗涤后加入FC98，再次孵育洗涤后加入HRP-羊抗鼠IgG，以OPD为底物染色。ELISA检测结果表明，融合蛋白LDM-Fv仍保留单抗的免疫反应性(图7)。
5.组装融合蛋白LDM-Fv对肿瘤细胞的杀伤作用克隆形成测定，取对数生长期的PG细胞(购自北京医科大学病理系)加入96孔培养板，每孔50个细胞/0.2ml，培养24小时。10倍稀释各药物和偶联物，每浓度4孔，每孔加50ul，37℃温育1h，无血清PRMI 1640培养液洗2次，加入新鲜培养液，继续培养7天，镜下计数细胞集落，大于50个细胞的集落列入计数。结果显示组装融合蛋白对IV型胶原酶高表达的人肺细胞癌系PG细胞具有强烈的杀伤作用，明显高于阿霉素和丝裂霉素。抑制50％克隆形成的浓度(IC50)为9.5×10-15mol/L(图8)。
6.融合蛋白LDP-Fv阻断肿瘤细胞的侵袭重组人工基底膜侵袭实验，取200ul NIH3T3细胞(北京市肿瘤研究所)培养液上清作为趋化因子加入BoydenChamber(Costar公司)中的下室，上、下室之间用孔径为8um的无PVP聚碳酸脂膜分开，在膜上铺50ul 1∶6稀释的人工基底膜胶(Matrigel)，37℃聚合30分钟后，每孔各加入100ul浓度为2×106/ml细胞悬液和不同浓度的药物，总体积200ul/孔。常规培养10小时，甲醇固定，HE染色，显微镜下计穿膜的细胞数，每组设3个平行样本，为避免细胞毒作用对实验结果的影响，所用药物为组装前的融合蛋白，并以除去发色团的力达蛋白作对照。结果表明，融合蛋白能抑制IV型胶原酶的活性，有较强的抗侵袭能力(图9)。
本发明的优点与积极效果是采用DNA重组和分子组装重建的技术路线制备的组装融合蛋白(LDM-Fv)属于新型导向药物，对IV型胶原酶高表达的人肺细胞癌系PG细胞具有强烈的杀伤作用，融合蛋白能抑制IV型胶原酶的活性，具有较强的抗侵袭能力
图1力达霉素与单链抗体的组装融合蛋白构建技术路线其中 1-力达蛋白2-力达发色团3-力达霉素4-单链抗体scFv-M975-重组融合蛋白6-组装融合蛋白图2琼脂糖凝胶电泳分析PCR修饰性扩增结果其中 1.分子量λDNA/EcoRI+HindIII. 2.scFv-M97基因.
3.力达蛋白基因.4.分子量标准pBR322/BstI图3重组融合蛋白LDP-Fv的DNA序列测定其中a-正链b-负链图4表达质粒限制性内切酶鉴定其中 1.分子量λDNA/EcoRI+HindIII. 2.重组质粒/EcoRI+HindIII.
3.重组质粒/EcoRI. 4.重组质粒
5.空载pKK223-3/EcoRI. 6.空载pKK223-3图5重组融合蛋白LDP-Fv表达及纯化产物的SDS-PAGE鉴定其中1.分子量标准 2.pKK223-3转化菌3.融合基因转化菌(IPTG诱导前).4.融合基因转化菌(IPTG诱后)5.经亲和层析纯化的重组融合蛋白LDP-Fv图6Western blot鉴定重组融合蛋白LDP-Fv图7ELISA检测单抗3D6和组装融合蛋白LDM-Fv对肺癌PG细胞和肝癌BEL7402细胞的免疫反应性其中△3D6(PG细胞)□组装融合蛋白LDM-Fv(PG细胞)*3D6(BEL7402细胞，本研究室保存)○组装融合蛋白LDM-Fv(BEL7402细胞)图8组装融合蛋白LDM-Fv及天然力达霉素对肺癌细胞的杀伤作用其中●天然力达霉素IC50为2.5×10-16mol/L□组装融合蛋白LDM-FvIC50为9.5×10-15mol/L阿霉素IC50为1.5×10-12mol/L■丝裂霉素IC50为2.1×10-11mol/L图9体外抗侵袭实验分析其中
力达蛋白处理组
融合蛋白LDP-Fv处理组●P＜0.0权利要求
1.抗癌抗生素力达霉素(LDM.)与单链抗体scFv的组装融合蛋白(LDM-Fv)，其特征是所说的方案的实施包括以下步骤A.力达蛋白/单链抗体scFv融合基因的构建；B.融合蛋白LDP-Fv在大肠杆中的诱导表达；C.组装融合蛋白LDM-Fv的制备；D.组装融合蛋白LDM-Fv抗肿瘤作用的检测。
2.按照权利要求1所述的组装融合蛋白，其特征是所说的力达蛋白/单链抗体scFv融合基因是运用基因工程技术，将力达蛋白基因和单链抗体scFv基因连接，融合基因长1083bp，编码361个氨基酸。
3.按照权利要求1所述的组装融合蛋白，其特征是力达蛋白/单链抗体scFv融合基因克隆至大肠杆菌表达质粒，并在大肠杆菌中表达融合蛋白LDP-Fv。
4.按照权利要求1所述的组装融合蛋白，其特征是提取纯化融合蛋白并与力达发色团组装，获得最终产物力达霉素与单链抗体scFv的组装融合蛋白LDM-Fv。
5.按照权利要求1所述的组装融合蛋白，其特征是体外培养高转移性人巨细胞肺癌细胞系PG细胞和人肝癌BEL-7402细胞，用克隆形成法测定组装融合蛋白LDM-Fv对肿瘤细胞的杀伤作用；用重组人工基底膜侵袭实验分析融合蛋白LDP-Fv抗侵袭能力。
全文摘要
抗癌抗生素力达霉素分子由力达蛋白(Lida－protein,LDP)和活性成份力达发色团(Lida－chromophore LDC)两部分组成,并以非共价键结合,可拆分与组装重建,由于单链抗体scFv能特异性与Ⅳ型胶原酶结合并抑制其活性,为提高药物对毛细管的通透性以及在实体瘤内的穿透性,本发明运用DNA重组和分子重建技术,制备得到新型小型抗肿瘤导向药物力达霉素与单链抗体的组装融合蛋白LDM－Fv,分子量约37kDa,它有抑制Ⅳ型胶原酶的活性、抗侵袭和极强的杀伤肿瘤细胞作用,其半数抑制克隆形成的浓度(IC
文档编号C07K16/00GK1251840SQ99121668
公开日2000年5月3日 申请日期1999年10月13日 优先权日1999年10月13日
发明者甄永苏, 李顺强, 江敏 申请人:中国医学科学院医药生物技术研究所