专利名称：肠炎沙门氏菌的检测的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于检测家禽和其蛋中的肠炎沙门氏菌的方法。更具体地说，本发明涉及用于检测肠炎沙门氏菌的方法，包括在将从怀疑含有肠炎沙门氏菌的家禽获得的生物学样品与肠炎沙门氏菌的伞毛蛋白的片段或肠炎沙门氏菌的鞭毛蛋白的片段接触，其中所述的片段特异性地识别存在于样品中的肠炎沙门氏菌抗体并且将肠炎沙门氏菌与其他沙门氏菌区分开。
沙门氏菌的可能的毒力因子包括伞毛蛋白结构和脂多糖，伞毛结构是参与侵入真核细胞的基因产物。另一个因子是鞭毛，它授予细菌的运动特性，所以对细菌形成菌落有作用。
根据每年报道的大量的肠炎沙门氏菌病例，显然需要对感染了肠炎沙门氏菌的蛋禽进行检测的可靠的方法。如由Williams，J.E.，和A.D.Whittemore，鸟类疾病，20728(1976)公开的那些用于分离肠炎沙门氏菌的生物学技术是费力，费时和昂贵的。当由于样品中存在的其他沙门氏菌血清型的生长超过肠炎沙门氏菌时产生假阴性。另外，这些方法不能识别感染了肠炎沙门氏菌的所有鸟类，因为沙门氏菌的排泄是间歇的。
有一些现有的血清学方法，例如血清平板测试(SPF)，胶乳凝集素测试(LAT)和酶联免疫吸附测试(ELISA)，这些方法是快速的并且易于操作，已经发现在感染的鸡血清中有相对高水平的抗肠炎沙门氏菌的抗体，使得抗体检测成为现实。大多数ELISAs利用了脂多糖(LPS)或鞭毛抗原以检测抗肠炎沙门氏菌的抗体。但是在近来的报道中这些抗原的利用已经产生了假阳性结果，使得将沙门氏菌血清型区分开变得困难。参见Christopher，J.等人临床微生物杂志34792-797(1996)；van Zijderveld，Fred，临床微生物杂志362560-2566(1992)；Barrow，P.A.，流行和感染109361-369(1992)；和Barrow，P.A.，食品微生物杂志2155-68(1994)。因此寻求进一步的方法。
本发明的另一个实施方案包括检测肠炎沙门氏菌的方法，该方法包括在足于使存在于样品中的肠炎沙门氏菌抗体与抗原片段之一或两者之间形成免疫复合物的条件下，将所述的从怀疑感染了肠炎沙门氏菌的家禽获得的生物学样品与肠炎沙门氏菌的伞毛蛋白的抗原性片段和肠炎沙门氏菌的鞭毛蛋白的抗原性片段的结合物接触和检测所述的复合物的形成；其中所述的各个片段特异性地识别存在于样品中的肠炎沙门氏菌抗体并且将抗肠炎沙门氏菌的抗体与抗其他沙门氏菌区的抗体分开。
本发明进一步涉及诊断试剂盒，包括肠炎沙门氏菌的伞毛蛋白的抗原性片段，肠炎沙门氏菌的鞭毛蛋白的抗原性片段或其两者，当与从怀疑感染了肠炎沙门氏菌的家禽获得的生物学样品结合时，其中所述的片段特异性地识别存在于样品中的肠炎沙门氏菌抗体并且将抗肠炎沙门氏菌的抗体与抗其他沙门氏菌区的抗体分开。
图2A列出了肠炎沙门氏菌的伞毛蛋白的氨基酸序列，图2B列出了称为C128的片段的氨基酸序列。
图3是说明经测试证实对肠炎沙门氏菌有反应的伞毛蛋白SEF14的8个亚片段的图。
图4代表肠炎沙门氏菌的鞭毛蛋白抗原的全长以及从实施例2描述的全长序列获得的片段。
图5列出了图4描述的全长肠炎沙门氏菌鞭毛蛋白的氨基酸序列，以及由270碱基对片段编码的氨基酸序列和如实施例2描述分离的四个亚片段的各个的氨基酸序列。
发明的详细描述抗原片段的测定A.伞毛抗原的抗原性片段第一次在1994年描述了命名为SEF14的伞毛蛋白(Thorns，C.J.等人，临床微生物杂志282409-2414)。证实命名为sefA的编码SEF14的基因的分布只限于属于沙门氏菌血清型D的血清型。仅仅在肠炎沙门氏菌，都柏林沙门氏菌，布雷丹沙门氏菌和莫斯科沙门氏菌中检测到SEF14抗原表达为表面结构，但是肠炎沙门氏菌是从家禽分离的唯一的血清型，并且SEF14的伞毛由所有的肠炎沙门氏菌菌株表达。已知在肠炎沙门氏菌感染之后产生了抗SEF14的抗体。SefA基因的完整序列是已知的并且在文献中(Thorns，C.J.等人，临床微生物杂志4(34)792-797(1996))和GenBank(入藏号L03833)公开。
图1提供了SefA基因的DNA序列，并且标记为SEQ ID NO1。SEF14的氨基酸序列在图2A提供。该序列鉴别为SEQ ID NO2。
为了测定SEF14的部分是否特异性地识别肠炎沙门氏菌，用从GenBank序列数据设计的引物从基因组DNA扩增SefA基因。将获得的扩增片段克隆到表达载体。选择载体以便SefA基因表达为融合蛋白。优选的融合配体是日本血吸虫的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)。
用来自于试验感染肠炎沙门氏菌和其它沙门氏菌血清型的鸡血清进行免疫印迹测试获得的重组GST-SEF14融合蛋白的反应性。GST-SEF14由所有肠炎沙门氏菌感染的血清识别，并且用来自于森夫顿堡沙门氏菌，阿姆斯特丹沙门氏菌，爪哇沙门氏菌，鸡白痢沙门氏菌，鼠伤寒沙门氏菌，会聚沙门氏菌和奥兰宁堡沙门氏菌也获得了弱反应谱带。与哈特沙门氏菌，蒙特维的沙门氏菌，副鼠伤寒沙门氏菌，依米克沙门氏菌和感染前的血清没有发现反应。从这些数据显示SEF14融合蛋白与引起这些交叉反应的其他沙门氏菌血清型共有一些共同的表位。
为了将特异于肠炎沙门氏菌的SEF14的部分片段定位，如图3显示的SEF14的165个氨基酸的8个亚片段表达为与GST的融合蛋白。通过免疫印迹测试测试了各个片段的反应性。含有SEF14的三个片段，只有全长SEF14，即F165(165aa)由来自于肠炎沙门氏菌感染的所有血清识别。其他两个片段，N150(150aa)和N136(136aa)没有被一些肠炎沙门氏菌血清识别，提示不能被识别可能是由aa151和aa165之间的C-末端的一些表位缺失产生的。
含有SEF14的C-末端的四个片段中，有两个片段C145(145aa，aa121-165)和C128(128aa；aa38-165)与所有的肠炎沙门氏菌血清型反应。其他两个片段，C95(95aa)和C88(88aa)没有被一些肠炎沙门氏菌血清检测到，这表明aa37和aa70之间的表位与抗体结合相关。C128片段的氨基酸序列在图2B列出并且本文标记为SEQ ID NO3。
通过亲水性作图Kyte-Doolittle和抗原性指数Jameson-Wolf计算机为基础的程序可以分析SEF14氨基酸残基的亲水性和抗原性。这些程序有助于从序列的知识预测蛋白质的性质。氨基酸41-53，144-153和159-165的区域是亲水性，据信它们代表抗原表位。从SEF14缺失这些区域导致具有降低的抗原性的多肽。
也用来自于试验感染了各种沙门氏菌血清型的鸡的血清对SEF亚片段的特异性进行测试。亚片段C128不与来自于除了肠炎沙门氏菌的沙门氏菌的血清型的血清反应。亚片段C145与来自于感染了森夫顿堡沙门氏菌，爪哇沙门氏菌，会聚沙门氏菌，阿姆斯特丹沙门氏菌，和副鼠伤寒沙门氏菌的血清反应弱。F165的aa1-36的N-末端的缺失使得亚片段C128比F165或C145更特异。当测试F165片段时，观察到交叉反应，当测试C145时观测的微弱的交叉反应。相反，当测试C128时，没有看到交叉反应。这些结果表明由aa1-36结合的区域含有至少由不同沙门氏菌血清型共享的一个抗原表位决定基。这些研究详细描述于下面的实施例1中。根据前述，本发明的范围内令人满意的片段是基本上由SEF14的C145片段的抗原性亚片段组成的，该片段特异性识别来自于家禽的生物学样品中的肠炎沙门氏菌抗体并且将肠炎沙门氏菌与其他沙门氏菌区分开。这样的亚片段包括C128亚片段，它基本上由SEF14氨基酸序列的37-165位氨基酸组成，进一步包括特异性识别来自于家禽的生物学样品中的肠炎沙门氏菌抗体并且将肠炎沙门氏菌与其他沙门氏菌区分开的亚片段。对应于，或等同于C145片段的这些亚片段之一，并且包括至少C145片段的亚片段的序列的一个氨基酸进行了保守的氨基酸替代的多肽也包括在本发明的范围内，条件是具有所述替代的序列特异性地识别来自于家禽的生物学样品的肠炎沙门氏菌抗体并且将肠炎沙门氏菌与其他沙门氏菌区分开。
利用ELISA和来自于用沙门氏菌和肠细菌超免疫接种的豚鼠的血清，和来自于试验感染了沙门氏菌的鸡的血清研究C128亚片段的特异性和敏感性。对于来自于豚鼠的血清，感染了肠炎沙门氏菌的OD值至少是比用除了都柏林沙门氏菌以外的其他血清高2倍，感染了都柏林沙门氏菌的血清具有类似的OD值，因为SEF14鞭毛蛋白与都柏林沙门氏菌具有交叉反应性。按照能够使用C128用于被感染了肠炎沙门氏菌的家禽的鉴别的诊断，与都柏林沙门氏菌的交叉反应性不是难题，因为都柏林沙门氏菌没有感染，所以不能从小鸡分离。对于从小鸡获得的血清，来自感染了肠炎沙门氏菌的小鸡的所有的血清显示比来自感染了其他的沙门氏菌血清型的小鸡的血清获得的至少高2倍。这些数据显示ELISA中的C128的反应性与免疫印迹的反应性相同。阳性的反应的截止OD值是正常血清的平均OD的三倍。
F165的C128的亚片段是检测家禽的肠炎沙门氏菌的有用的工具。
B.鞭毛蛋白抗原的抗原片段在图5显示肠炎沙门氏菌的鞭毛蛋白区域的氨基酸序列(命名为13076和保藏于ATCC入藏号为U12963的肠炎沙门氏菌菌株的754-1024位核苷酸)识别号为SEQ ID NO4。扩增编码鞭毛蛋白区域的DNA片段并克隆到表达载体。选择载体以致想要的鞭毛蛋白基因产品以融合蛋白质的方式表达。首选的融合配体是日本血吸虫的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)。表达获得了GST-鞭毛蛋白重组蛋白质。在图5提供了鞭毛蛋白的90个氨基酸的片段的氨基酸序列。该序列本文标记为SEQ ID NO5。
该重组蛋白质由都柏林沙门氏菌识别也由肠炎沙门氏菌识别，但是不被其他测试的任何沙门氏菌识别。
为了测定是否较小的序列可用于特定地识别家禽样品中肠炎沙门氏菌，将重组蛋白质的鞭毛蛋白的序列与其他的沙门氏菌的鞭毛蛋白区域的序列比较，识别了蛋白质内的显示与其他的序列有最大变化的特异的区域。鞭毛蛋白区域的四个亚片段表达为融合蛋白质，大小范围为27.2kD至31.6kD，测试每个片段的反应性。证实每个片段特定地探测和区分感染了肠炎沙门氏菌的家禽的样品与未感染了肠炎沙门氏菌的家禽的样品。在图5显示了这些四个亚片段并且本文识别为SEQ ID NOS6-9。
图5举例说明的90个氨基酸的片段和四个亚片段中的每一个因此均可用于本发明的方法。任何这些序列的抗原片段或对应于这些序列之一的氨基酸序列也是有用的，所述的氨基酸序列包含在序列中至少一个氨基酸进行了保守的氨基酸取代，条件是具有所述的取代的序列特定地识别来自家禽的生物学的样品中肠炎沙门氏菌的抗体并且将肠炎沙门氏菌与其他的沙门氏菌区分开。肠炎沙门氏菌感染的检测肠炎沙门氏菌的伞毛蛋白和鞭毛蛋白的抗原片段可用于检测来自家禽的样品中的肠炎沙门氏菌的感染。首选的样品是来自家禽蛋的血清样品或蛋黄样品。在存在于样品的肠炎沙门氏菌抗体和抗原片段形成免疫学的复合物的条件下将样品与本发明的肠炎沙门氏菌伞毛蛋白或鞭毛蛋白的抗原片段接触一段时间。采用直接的检测方法或间接的检测方法可以测定所述复合物的形成。根据进行测定。根据所选择的测定技术，如果使用，抗原片段，存在于样品的肠炎沙门氏菌抗体或第二抗体用可检测的标记物进行标记。从荧光化合物，放射性的元素，能够产生反应可检测的化合物的酶，或黄金可以选择合适的可检测的标记物。
利用直接的检测方法，例如根据标准技术由ELISA测定抗原—抗体复合物。直接的检测分析可以使用标记的抗原片段或标记的抗肠炎沙门氏菌抗体。利用标准标记技术可以进行抗体或抗原片段的标记。可检测的标记物可以是荧光化合物，放射性的元素，能够产生可检测的反应产物的酶，或黄金。例如用放射性的同位素可以标记肠炎沙门氏菌的伞毛蛋白或鞭毛蛋白的选定的抗原片段。然后根据本发明，在足于使得存在于样品中的肠炎沙门氏菌抗体与抗原片段之间形成免疫复合物条件下将样品与肠炎沙门氏菌的伞毛蛋白或鞭毛蛋白的放射性标记的抗原片段接触一段时间，这样形成的抗体—抗原复合物用放射性的标记物标记。然后采用免疫印迹法可以测定形成的复合物。或者用直接可检测的标记物例如荧光化合物或黄金对存在于样品中的肠炎沙门氏菌抗体进行标记或将其缀合到通常用于比色的或荧光检测的酶，如碱性磷酸酶。然后将未标记的肠炎沙门氏菌伞毛蛋白或鞭毛蛋白的抗原片段包被到微滴板并且与含有标记的肠炎沙门氏菌抗体的生物学的样品接触，这样再对形成的抗体—抗原复合物用可检测的标记物进行标记。例如采用标准的测定或其他的敏感的检测系统进行对形成的标记的抗原—抗体复合物的检测。
利用间接的检测方法，根据本发明的标准技术采用ELISA或免疫印迹法可以测定抗原—抗体复合物。将肠炎沙门氏菌的伞毛蛋白或鞭毛蛋白的抗原片段包被到微滴板，以提供用于俘获存在于样品中的抗肠炎沙门氏菌抗体的固相。或者，在用于免疫印迹法的溶液中可以提供抗原片段。在足于使得存在于样品中的肠炎沙门氏菌抗体与抗原片段之间形成免疫复合物条件下将片段与生物学的样品接触。然后利用缀合到可检测的标记物的第二的抗血清例如荧光标记的抗体，酶缀合的抗体，包括辣根过氧化物酶缀合的抗体或碱性的磷酸酶—缀合的抗体，放射性的微量元素标记的抗体或黄金—标记的抗体可以检测形成的抗体—抗原复合物。
与这些测定技术不同的另一条途径是，根据标准技术产生抗本发明的肠炎沙门氏菌的抗原片段的单克隆抗体，然后将单克隆抗体用于包被微滴板的孔，然后将板与被怀疑含有肠炎沙门氏菌的生物学的样品接触，样品中的抗原结合到单克隆抗体，利用如上所述的可检测的标记物可以检测。
用于本发明的优选的测定方法是如上所述的ELISA。第二优选的分析方法是侧向流动形式测定方法，其可以以快速测试试剂盒形式提供。用于其他目的的这样的商品试剂盒使得经由施加到含有抗原或者在本例中的抗原片段的试条的预定孔而吸收液体至膜上，然后将孔插入到抗原包被的膜上具有窗口的装置中。
将样品加入到孔以便流经膜，使得存在于样品中的任何抗体与膜上的抗原交互作用。也将用可检测的标记物如黄金标记的第二抗体导入到膜并且通过以样品润湿膜进行固定，并且结合样品中的任何一抗。通过从窗口看得到的黄金沉淀到膜，根据膜上谱带的出现观察到获得的阳性结果。通过将产生的抗想要的抗原片段的单克隆抗体包被到膜上也可以修饰侧向流动形式测定方法。
Western印迹，点印迹和石英晶体技术也可用于检测抗原或单克隆抗体的目的。
利用C128伞毛片段的测试方法和利用鞭毛蛋白的测定方法，可独立地用于检测家禽和它们的蛋的肠炎沙门氏菌感染。将伞毛蛋白和鞭毛蛋白片段合并使用也是实用的。抗SEF14的可检测的抗体显示早期感染，而通常在感染的后期检测到抗鞭毛蛋白的抗体，因为抗鞭毛的抗体后来产生但是较长地存在。因此通过用伞毛蛋白和鞭毛蛋白的每一抗原片段测试样品，可以从它的开始阶段到成熟的阶段检测感染的存在，如此保证没有感染就检测不到。诊断试剂盒本发明进一步包括诊断试剂盒，可用于检测和将家禽的样品中的肠炎沙门氏菌感染区分开。该试剂盒包括如上所述的肠炎沙门氏菌的伞毛蛋白或鞭毛蛋白的抗原片段，或包括肠炎沙门氏菌的伞毛蛋白的抗原片段和鞭毛蛋白的抗原片段。试剂盒进一步地包括标记物。合适的标记物包括可以附加到待测试的生物学样品中的抗原片段或抗体的标记物如酶，黄金，荧光化合物，或放射性的元素。或者，以标记的第二抗体的形式提供了标记物以用于间接的检测方法，例如酶联抗体，包括辣根过氧化物酶缀合的抗体或碱性磷酸酶标记的抗体，黄金标记的抗体，荧光标记的抗体，或放射性微量元素标记的抗体。
在一个优选的实施方案中，试剂盒包括如上所述的侧向流动形式分析方法中的必要的元件。
本发明进一步描述于下列的实施例，提供这些实施例用于解说的目的，不是有意地限制本发明。
实施例1细菌菌株由新加坡Primary Production Department提供了肠炎沙门氏菌菌株2/93噬菌体型4，119/95噬菌体型4，330/96噬菌体型11a和131/97噬菌体型37，40/97噬菌体型1，和296/96噬菌体型9b，和由美国农业部提供了分离株94/6510。所有的这些菌株均是公众可得的。这些菌株用于小鸡的实验感染。血清样品血清组1用细菌的不同菌株接种豚鼠以获得特异于下列各项的血清肠炎沙门氏菌(组D)，都柏林沙门氏菌(组C)，肯塔基州沙门氏菌(组C3)，海德堡沙门氏菌(组B)，S.newport(组C3)，哥本哈根鼠伤寒沙门氏菌(组B)，猪霍乱沙门氏菌，鸭沙门氏菌(组E1)，S.cerro(组K)，大肠杆菌，气单胞菌，多杀巴斯德氏菌，肺炎克雷白氏菌，奇异变形菌，Yersinia enterococci，Citrofreundii，宋内氏志贺氏菌，粘质沙雷氏菌和未感染的豚鼠血清。
血清组2用来自新加坡总医院获得的沙门氏菌属各种的血清型感染小鸡都柏林沙门氏菌(组D)，鼠伤寒沙门氏菌(组B)，鸭沙门氏菌(组E1)，鸡瘟沙门氏菌(组D)，爪哇沙门氏菌(组B)，副伤寒沙门氏菌A(组A)，S.haardt(组C3)，哈特沙门氏菌(组C2)，和大肠杆菌。
血清组3在隔夜的肉汤制备上面列出的六个肠炎沙门氏菌菌株，将肉汤稀释到1×108菌落形成单位(cfu)。进一步地依次稀释该肉汤，产生107和105浓度的六个培养物。将十二个十周龄的小鸡划分为六个组，每个组二个，并且每个组的一个小鸡用1毫升的105细菌肉汤接种，每个组的第二小鸡用107细菌肉汤接种。在间隔7天获得了来自每个小鸡的血清，监测鸡群从接种前到接种后二个星期脱落的沙门氏菌。
血清组4肠炎沙门氏菌阴性血清的四十个样品是从无特异的病原体的小鸡获得的，小鸡年龄范围为1天龄小鸡到十个星期龄的小鸡。特定地，四十个样品包括10个1天龄小鸡，十四个四星期大的小鸡，和十六个十星期大的小鸡。
血清组5由新加坡Primary Production Department(PPD)从田间的小鸡收集二十五个血清样品。在马来西亚从农场小鸡收集这些样品，其中已经识别到肠炎沙门氏菌感染。重组的肠炎沙门氏菌抗原sefA基因的核苷酸序列可通过Genbank(登记号L03833)获得。如下所述设计和合成伞毛蛋白SEF14的C128片段的寡核苷酸引物。在5′末端设计具有Bam H1限制位点的引物作为正向引物，在3′末端设计具有EcoR1限制位点的引物作为反向引物。
正向引物5′TGC AGC TCA GAA TAC AAC ATC A 3′(从碱基112开始)反向引物5′GTT TTG ATA CTG CTG AAC GTA(在碱基495终止)本文将正向和反向引物分别标记为SEQ ID NOS10和11。
将Beckman OLIGO 1000M DNA合成仪用于合成。利用从肠炎沙门氏菌菌株ATCC13076提取的基因组DNA，通过PCR扩增DNA片段。将扩增的DNA克隆到pGEX-4T-3表达载体(从Pharmacia Biotech，Uppsala，瑞典获得的)。将含有插入物的克隆测序以确定阅读框的正确性。在大肠杆菌菌株JM105表达融合到GST的蛋白质，该菌株是从Amersham Pharmacia Biotech，Uppsala，瑞典获得的，目录号为27-1550-01。对于融合蛋白的纯化，按照制造商的说明，将细菌细胞沉淀进行GST亲和柱纯化(Pharmacia Biotech)。为了获得更高的纯度，将蛋白质上样到SDS-PAGE凝胶，用考马斯亮蓝染色1分钟观察到蛋白质谱带并在去离子水中脱色。切下谱带在去离子水中洗脱。通过这样的凝胶纯化获得的蛋白质用作为ELISA测试的抗原。免疫印迹根据常规方式，但进行一些修改以进行Western印迹分析。将纯化的融合蛋白与含有终浓度为0.1mol/L DTT的样品缓冲液混合。将该混合物在100℃变性3分钟并且SDS-PAGE分离。将在凝胶上分离的蛋白质转移到硝酸纤维素膜，在20伏特整夜电泳。用5％脱脂乳封闭该膜并且剥离成条。
以1∶400稀释血清样品，各添加到每个条，在室温下保温1小时，接着孵育兔抗鸡IgG过氧化物酶缀合物1小时，然后用3′3′-二氨基联苯胺四盐酸(DAB)底物显色。发现所有的伞毛蛋白片段反应阳性的。ELISA利用常规的方式进行ELISA。在碳酸盐缓冲液pH9.6以每孔50纳克/100毫升将纯化的蛋白质包被到96-孔平底板(NUNC)。在用1％BSA封闭之后，将稀释1∶200的血清样品加入并且在37℃孵育15分钟，接着在37℃与二级IgG过氧化物酶缀合物孵育15分钟，最后加入底物OPD。结果表示为ELISA阅读器(Bio-dot)记录的在492纳米的光密度(OD)。
分析C128抗原片段的遗传图与肠炎沙门氏菌感染的特异性和敏感性。阳性反应的截止值是未感染的小鸡血清的OD值的3倍。测试该片段抗组2，证实肠炎沙门氏菌是阳性的，对于组3显示所有的血清反应性是阳性的，对于组4，其中显示所有的血清是阴性的。
实施例2所使用的细菌菌株和血清组与实施例1相同，如上所述，不同的是血清组2的小鸡比实施例1描述的受更少的沙门氏菌血清型感染。重组肠炎沙门氏菌抗原采用聚合酶链反应(PCR)技术扩增肠炎沙门氏菌的ATCC13076编码区的DNA的754-1024bp核苷酸。扩增的DNA克隆到pGEX-2T表达载体(公众从Pharmacia Biotech，Uppsala，瑞典获得)。为了纯化GST-鞭毛蛋白，根据制造商的说明将细菌细胞沉淀进行GST亲和柱纯化(Pharmacia Biotech)。在该步骤回收大多数的GST-鞭毛蛋白。为了获得较高的纯度，该蛋白质上样到聚丙烯酰胺凝胶。切下谱带并且在含有0.1％SDS的去离子水洗脱。ELISA程序用50纳克/100微升/孔重组蛋白质，在0.1M重碳酸钠缓冲液(pH9.6)中包被Immulon微滴板(从Dynatech实验室公司Chantilly，Va.可得)。在37℃培养该平板4小时，然后冷冻直到进一步的使用。用ELISA洗涤溶液(磷酸缓冲盐水，0.05％Tween 20[PBST])洗涤平板4次，用1％牛血清白蛋白(BSA)部分V(Sigma)在磷酸缓冲盐水(pH7.4)中，37℃饱和过量地结合位点1小时。在四次洗涤之后，将1％BSA-PBS缓冲液中的100微升的测试血清样品(1∶200稀释)加入到每个孔，在37℃平板孵育10分钟。在随后洗涤孔之后，将100微升的与辣根过氧化物酶(KPL)缀合的抗鸡免疫球蛋白加入到每个孔，在37℃将平板孵育10分钟。再一次洗涤孔并且加入100微升的底物溶液(2′2′-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)+H2O2)。使颜色反应在室温下进行10分钟，自动的ELISA平板阅读器分别记录405nm(ABTS)处每个孔的吸光度。肠炎沙门氏菌部分蛋白质的作图为了评价是否如图5中SEQ ID NO5所示的获得的部分蛋白质是最小可能用于检测家禽或其蛋中肠炎沙门氏菌的存在的片段，利用上面的相同方法将引物(下文表中列出)和获得的片段克隆到pGEX-2T载体中。将获得的四个部分蛋白质片段命名为FLP-A，FLP-B，FLP-C和FLP-D。同样采用亲和层析和凝胶切下纯化这些部分片段。将这些部分蛋白质片段定量分析，随后以每孔50纳克进行包被。将鸡血清用于ELISA中进行这些部分蛋白质片段的定性。从未感染的鸡获得的的血清产生阴性结果，而从肠炎沙门氏菌感染的鸡获得的血清产生阳性结果。
表1 所使用的引物的核苷酸序列
在本文将上面列出的引物分别标记为SEQ ID NOS12-19。数据分析对用于这些测试中的阴性血清计算平均读数并且计算标准偏差。计算标准偏差范围，其中将阴性血清的平均值加入到一个，两个，三个，四个或五个标准偏差。发现阴性参照血清的平均值+2的标准偏差其值足于包括所有的阴性，并且获得的所有已知的阳性血清的值高于上面的值。ELISA的截留值(检测极限)定义为阴性参照血清的平均值+2倍标准偏差，该值能够区分开阳性血清和野外感染的血清。
还计算了阳性/阴性的比例，这些数字作为相对于阴性参照值的反应的相对指示强度。
由t-检验(Sigma斜率程序)从统计学上分析所搜集的几组数据的差异。所获得的值表示在两组看到的差异是显著差异。低于0.01的P值被认为具有统计学意义的差异。肠炎沙门氏菌鞭毛融合蛋白的鉴定和特异性由Western印迹分析免疫学方法鉴定凝胶纯化的GST-肠炎沙门氏菌抗原。用来自组1血清的豚鼠制备的血清测试融合蛋白。在测试的10个沙门氏菌血清型中，仅仅肠炎沙门氏菌和相同血清组的都柏林沙门氏菌显示反应性。组1中其它血清型和其他生物体的血清没有显示反应性。所有的血清以1∶50的稀释进行筛选。然后经抗从实验感染的和未感染的鸡获得的血清而筛选融合蛋白。组3的所有血清反应阳性，组4的血清没有显示反应。开发利用GST-肠炎沙门氏菌融合蛋白的检测肠炎沙门氏菌的ELISA在ELISA包被缓冲液中稀释凝胶纯化的GST-肠炎沙门氏菌鞭毛蛋白抗原片段融合蛋白并且以每孔50纳克用作为微滴板上的包被抗原包被过夜。用组1的豚鼠的血清对包被抗原进行定性。利用鸡血清进行随后的定性。肠炎沙门氏菌感染的鸡的血清具有最高的吸光率，计算出比阴性参照具有高出4.59倍的阳性/阴性比例。
然后测试组3的非感染的鸡血清(在感染之前从鸡获得的血清作为prebleed)抗包被的抗原。几乎所有的血清产生基底的读数。5个不同的噬菌体类型的组3的感染的家禽血清产生100％的阳性结果。因此，该测试能够检测不同噬菌体类型的肠炎沙门氏菌。
从用哈特沙门氏菌，肺炎沙门氏菌，哈达尔沙门氏菌，伤寒沙门氏菌和爪哇沙门氏菌试验感染的家禽获得的组2的血清用测试抗原获得阴性结果。这些数据证实与其他沙门氏菌血清型没有交叉反应。与商品IDEXX肠炎沙门氏菌测试试剂盒进行比较利用IDEXX商品测试试剂盒(IDEXX实验室公司，Westbrook，ME)和本发明的抗原对组5血清进行评价。利用IDEXX试剂盒，检测了3/28个血清，利用本发明的抗原，14/28样品被鉴定为血清学阳性。因此本发明的抗原显示检测率为78.6％，大于用商品测试试剂盒获得的值。ELISA结果作图的片段进一步对肠炎沙门氏菌融合蛋白作图以评估仍能检测和区分感染的和未感染的血清的最小区域。对在图5显示为片段A-D和具有分子量(包括GST)31.6kD，30.4kD，29kD，和27.2kD的总共4个片段进行克隆并且用选定的阳性和阴性血清进行筛选。来自于用肠炎沙门氏菌实验感染的鸡的8个血清样品和SPF(没有特异性病原体)血清的8个样品用于对各个片段的敏感性进行定性。测定了片段的阳性/阴性(P/N)的比例。各个片段的平均P/N比例如下片段A3.23片段B2.95片段C3.02片段D2.97这些数据反映出与P/N比例是3.01的原始融合抗原类似的反应方式。
用存在于组2的血清样品中的其他沙门氏菌血清型测试该片段的特异性。没有片段与除了肠炎沙门氏菌以外的血清型反应。结果显示于下面的表2
表2片段与血清型特异性血清的反应性
sefA的核苷酸序列ATTTTGTAATATGCGTAAATCAGCATCTGCAGTAGCAGTTCTTGCTTTAATTGCATGTGGCAGTGCCCACGCAGCTGGCTTTGTTGGTAACAAAGCAGAGGTTCAGGCAGCGGTTACTATTGCAGCTCAGAATACAACATCAGCCAACTGGAGTCAGGATCCTGGCTTTACAGGGCCTGCTGTTGCTGCTGCTCAGAAAGTTGGTACTCTCAGCATTACTGCTACTGGTCCACATAACTCAGTATCTATTGCAGGTAAAGGGGCTTCGGTATCTGGTGGTGTAGCCACTGTCCCGTTCGTTGATGGACAAGGACAGCCTGTTTTCCGTGGGCGTATTCAGGGAGCCAATATTAATGACCAAGCAAATACTGGAATTGACGGGCTTGCAGGTTGGCGAGTTGCCAGCTCTCAAGAAACGCTAAATGTCCCTGTCACAACCTTTGGTAAATCGACCCTGCCAGCAGGTACTTTCACTGCGACCTTCTACGTTCAGCAGTATCAAAAC(SEQ ID NO1)SEF14的氨基酸序列1MRKSASAVAVLALIACGSAHAAGFVGNKAEVQAAVTIAAQNTTSANWSQDPGFTGPAVAAGQKVGTLSITATGPHNSVSIAGKGASVSGGVATVPFVDGQGQPVFRGRIQGANINDQANTGIDGLAGWRVASSQETLNVPVTTFGKSTLPAGTFTATFYVQQYQN165SEF14的C128片段的氨基酸序列Amino acid sequenca for the C128 fragment of SEF14AAQNTTSANWSQDPGFTGPAVAAGQKVGTLSITATGPHNSVSIAGKGASVSGGVATVPFVDGQGQPVFRGRIQGANINDQANTGIDGLAGWRVASSQETLNVPVTTFGKSTLPAGTFTATFYVQQYQN(SEQ ID NO3)肠炎沙门氏菌鞭毛蛋白抗原的氨基酸序列LTQNNLNKSQSSLSSAIERLSSGLRINSAKDDAAGQAIANRFTSNIKGLTQASRNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELSVQATNGTNSDSDLKSIQDEIQQRLEEIDRVSNQTQFNGVKVLSQDNQMKIQVGANDGETTTIDLQKIDVKSLGLDGFNVNGPKEATVGDLKSSFKNVTGYDTYAAGADKYRVDINSGAVVTDAAAPDKVYVNAANGQLTTDDAENNTAVDLFKTTKSTAGTAEAKAIRGAIKGGKEGDTFDYKGVTFTIDTKTGDDGNGKVSTTINGEKVTLTVADIATGATDVNAATLQSSKNVYTSVVNGQFTFDDKTKNESAKLSDLEANNAVKGESKITVNGAEYTANATGDKITLAGKTMFIDKTASGVSTLINEDAAAAKKSTANPLASIDSALSKVDAVRSSLGAIQNRFDSAITNLGNTVTNLNSARSRIEDADYATEVSNMSKAQILQQAGTSVLAQANQVPQNVLLLR(SEQ ID NO4)肠炎沙门氏菌鞭毛蛋白抗原的90个氨基酸的片段TAEAKAIRGAIKGGKEGDTFDYKGVTFTIDTKTGDDGNGKVTTINGEKVTLTVADIATGATDVNAATLQSSKNVYTSVVNGQFTFDDKT(SEQ ID NO5)片段A69个氨基酸(aa 258-327 of SEQ ID NO4)KEGDTFDYKGVTFTIDTKTGDDGNGKVSTTINGEKVTLTVADIATGATDVNAATLQSSKNVYTSVVNGQ(SEQ ID NO6)片段B40个氨基酸(aa 276-316 of SEQ ID NO4)KTGDDGNGKVSTTINGEKVTLTVADIATGATDVNAATLQS(SEQ ID NO7)片段C27个氨基酸(aa 279-306 of SEQ ID NO4)DGNGKVSTTINGEKVTLTVADIATGAT(SEQ ID NO8)片段D11个氨基酸(aa 285-296 of SEQ ID NO4)STTINGEKVTL(SEQ ID NO9)
权利要求
1.在从家禽获得的生物学样品中检测肠炎沙门氏菌的方法，该方法包括在足于使存在于所述的样品中的肠炎沙门氏菌抗体与所述的片段之间形成免疫复合物的条件下，将所述的生物学样品与肠炎沙门氏菌的伞毛蛋白的抗原性片段或肠炎沙门氏菌的鞭毛蛋白的抗原性片段接触，和检测所述的复合物的形成；其中所述的片段特异性地识别存在于样品中的肠炎沙门氏菌抗体并且将肠炎沙门氏菌与其他沙门氏菌区分开。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述的样品包括血清或蛋黄。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述的样品与肠炎沙门氏菌的伞毛蛋白的片段接触。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述的片段是以融合多肽而提供，其中将另一个多肽融合到所述的片段。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述的片段基本上由SEQID NO2的21-165位氨基酸亚片段，其抗原部分，或对应于SEQ IDNO2的21-165位氨基酸亚片段并且包含在所述序列中至少一个氨基酸的保守氨基酸取代的序列组成。
6.根据权利要求3所述的方法，其中所述的片段基本上由SEQID NO2的38-165位氨基酸，或其抗原部分，或对应于SEQ ID NO2的38-165位氨基酸并且包含在所述序列中至少一个氨基酸的保守氨基酸取代的序列组成。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述的样品与肠炎沙门氏菌的鞭毛蛋白的片段接触。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述的片段是以融合多肽而提供，其中将另一个多肽融合到所述的片段。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述的片段基本上由SEQID NO5的氨基酸序列，其抗原部分，或对应于所述的序列并且包含在所述序列中至少一个氨基酸的保守氨基酸取代的序列组成。
10.根据权利要求7所述的方法，其中所述的片段基本上由SEQID NO6的氨基酸序列，其抗原部分，或对应于所述的序列并且包含在所述序列中至少一个氨基酸的保守氨基酸取代的序列组成。
11.根据权利要求7所述的方法，其中所述的片段基本上由SEQID NO7的氨基酸序列，其抗原部分，或对应于所述的序列并且包含在所述序列中至少一个氨基酸的保守氨基酸取代的序列组成。
12.根据权利要求7所述的方法，其中所述的片段基本上由SEQID NO8的氨基酸序列，其抗原部分，或对应于所述的序列并且包含在所述序列中至少一个氨基酸的保守氨基酸取代的序列组成。
13.根据权利要求7所述的方法，其中所述的片段基本上由SEQID NO9的氨基酸序列，其抗原部分，或对应于所述的序列并且包含在所述序列中至少一个氨基酸的保守氨基酸取代的序列组成。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述的片段用可检测的标记物进行标记。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述的标记物包括荧光化合物，放射性元素，能够产生与可检测化合物反应的酶或金。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述的样品已经与可检测的标记物接触，该标记物与样品中存在的抗肠炎沙门氏菌抗体结合。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述的标记物包括荧光化合物，放射性元素，能够产生与可检测化合物反应的酶或金。
18.分离的沙门氏菌伞毛蛋白的片段，该片段基本上由SEQ IDNO3的氨基酸序列，其抗原部分，或对应于所述的序列并且包含在所述序列中至少一个氨基酸的保守氨基酸取代的序列组成。
19.分离的沙门氏菌鞭毛蛋白的片段，该片段基本上由SEQ IDNO6的氨基酸序列，其抗原部分，或对应于所述的序列并且包含在所述序列中至少一个氨基酸的保守氨基酸取代的序列组成。
20.分离的沙门氏菌鞭毛蛋白的片段，该片段基本上由SEQ IDNO7的氨基酸序列，其抗原部分，或对应于所述的序列并且包含在所述序列中至少一个氨基酸的保守氨基酸取代的序列组成。
21.分离的沙门氏菌鞭毛蛋白的片段，该片段基本上由SEQ IDNO8的氨基酸序列，其抗原部分，或对应于所述的序列并且包含在所述序列中至少一个氨基酸的保守氨基酸取代的序列组成。
22.分离的沙门氏菌鞭毛蛋白的片段，该片段基本上由SEQ IDNO9的氨基酸序列，其抗原部分，或对应于所述的序列并且包含在所述序列中至少一个氨基酸的保守氨基酸取代的序列组成。
23.一种试剂盒，包括肠炎沙门氏菌的伞毛蛋白或鞭毛蛋白的片段，所述片段特异性地识别在怀疑感染了肠炎沙门氏菌的家禽获得的生物学样品中的肠炎沙门氏菌抗体并且将肠炎沙门氏菌抗体与其他沙门氏菌抗体区分开。
24.一种试剂盒，包括肠炎沙门氏菌伞毛蛋白片段和肠炎沙门氏菌的鞭毛蛋白的片段，每个片段均特异性地识别在怀疑感染了肠炎沙门氏菌的家禽获得的生物学样品中的肠炎沙门氏菌抗体并且将肠炎沙门氏菌抗体与其他沙门氏菌抗体区分开。
25.根据权利要求24所述的试剂盒，进一步包括可检测的标记物。
26.在从家禽获得的生物学样品中检测肠炎沙门氏菌的方法，该方法包括在足于使存在于所述的样品中的肠炎沙门氏菌抗体与所述的片段之一或者两者之间形成免疫复合物的条件下，将所述的生物学样品与肠炎沙门氏菌的伞毛蛋白的抗原性片段和肠炎沙门氏菌的鞭毛蛋白的抗原性片段接触，和检测这样的一个或多个复合物的形成；其中每个所述的片段特异性地识别存在于样品中的肠炎沙门氏菌抗体并且将肠炎沙门氏菌与其他沙门氏菌区分开。
27.在从家禽获得的生物学样品中检测肠炎沙门氏菌的方法，该方法包括在足于使存在于所述的样品中的肠炎沙门氏菌抗体与所述的片段之间形成免疫复合物的条件下，将所述的生物学样品的第一部分与肠炎沙门氏菌的伞毛蛋白的抗原性片段接触，和检测这样的一个复合物的形成；其中所述的片段特异性地识别存在于样品中的肠炎沙门氏菌抗体并且将肠炎沙门氏菌与其他沙门氏菌区分开；和在足于使存在于所述的样品中的肠炎沙门氏菌抗体与所述的片段之间形成免疫复合物的条件下，将所述的生物学样品的第二部分与肠炎沙门氏菌的鞭毛蛋白的抗原性片段接触，和检测这样的一个复合物的形成；其中所述的片段特异性地识别存在于样品中的肠炎沙门氏菌抗体并且将肠炎沙门氏菌与其他沙门氏菌区分开。
28.根据权利要求26或27所述的方法，其中所述的样品包括血清或蛋黄。
29.根据权利要求26或27所述的方法，其中所述的片段是以融合多肽而提供，其中将另一个多肽融合到所述的片段。
30.根据权利要求26或27所述的方法，其中所述的肠炎沙门氏菌的伞毛蛋白片段基本上由SEQ ID NO2的121-165位氨基酸亚片段，其抗原部分，或对应于所述的序列并且包含在所述序列中至少一个氨基酸的保守氨基酸取代的序列组成。
31.根据权利要求26或27所述的方法，其中所述的肠炎沙门氏菌的伞毛蛋白的片段基本上由SEQ ID NO3的氨基酸序列，其抗原片段，或对应于所述的序列并且包含在所述序列中至少一个氨基酸的保守氨基酸取代的序列组成。
32.根据权利要求26或27所述的方法，其中所述的肠炎沙门氏菌的鞭毛蛋白的片段基本上由SEQ ID NO5的氨基酸序列，其抗原片段，或对应于所述的序列并且包含在所述序列中至少一个氨基酸的保守氨基酸取代的序列组成。
33.根据权利要求26或27所述的方法，其中所述的片段用可检测的标记物进行标记。
34.根据权利要求26或27所述的方法，其中所述的标记物包括荧光化合物，放射性元素，能够产生与可检测化合物反应的酶或金。
全文摘要
在家禽和其蛋中检测肠炎沙门氏菌的方法,包括将从怀疑含有肠炎沙门氏菌的家禽获得的生物学样品与肠炎沙门氏菌的伞毛蛋白的片段或肠炎沙门氏菌的鞭毛蛋白的片段接触,所述的片段特异性地识别存在于样品中的肠炎沙门氏菌抗体并且将肠炎沙门氏菌与其他沙门氏菌区分开。
文档编号C07K14/255GK1361828SQ99816757
公开日2002年7月31日 申请日期1999年6月22日 优先权日1999年6月22日
发明者况慧星, 刘伟, 淑淼·沙伦·刘, 群映·希尔达·罗 申请人:分子农业生物学院