专利名称：制备嵌段共聚物－药物复合物的方法
技术领域：
本发明涉及制备嵌段共聚物-药物复合物的方法，制得在聚合物胶束中包含药物的嵌段共聚物-药物复合物无需透析和超滤方法，所述聚合物胶束用由亲水聚合物结构部分和疏水聚氨基酸结构部分组成的嵌段共聚物制得。
背景技术：
在JP-A No.7-69900等中说明了大分子嵌段共聚物-药物复合物，它通过将阿霉素包含在聚合物胶束中来制得，所述聚合物胶束用由聚乙二醇结构部分和聚天冬氨酸衍生物部分组成的嵌段共聚物制得，并提到相比游离的阿霉素，它具有更高的抗癌效果，且毒性低。这种嵌段共聚物-药物复合物通过将嵌段共聚物和药物溶解在水和二甲基甲酰胺(DMF沸点153℃(101.3kPa))的混合溶剂中，然后，通过透析操作用水代替有机溶剂二甲基甲酰胺，并通过透析和超滤操作纯化所述混合物。但是，当进行透析和超滤操作时，一部分所含的药物(例如，阿霉素)也会被除去(Drug Delivery System，16，No.5，401-408(2001))，因此，所述药物不能有效利用，嵌段共聚物中的药物含量不能提高，并且所述含量连续变化，因此，也难以使药物含量恒定。此外，透析和超滤操作均是实验室用简便方法，但是，工业制造则需要专门的设备，对于实际制造，这些方法需要长时间，并且这些并不是工业可行性高的实际制造方法。
JP-A No.2001-226294说明了一种制造大分子嵌段共聚物-药物复合物的方法，该方法包括如下步骤通过机械搅拌、超声波照射等方式乳化嵌段共聚物和水溶性差的药物的氯仿溶液，并通过蒸发除去氯仿，但是，在工业上使用氯仿等受到限制，即由于包括使用和水不混溶的卤代烃等原因，这并不是工业实用的方法。
发明内容
目前还未知不使用透析和超滤操作并且不使用卤代烃制备嵌段共聚物-药物复合物的工业切实可行方法，也没有找到了提高嵌段共聚物中药物含量的可行方法，因此，需要一种制备嵌段共聚物-药物复合物的可行的新方法。
为了解决上述问题，本发明人已经作了深入细致的研究，并完成了本发明。
即，本发明涉及(1)一种制备嵌段共聚物-药物复合物的方法，包括如下步骤将由亲水聚合物结构部分和疏水聚氨基酸结构部分组成的AB型嵌段共聚物和药物溶解在水或水与能和水混溶的低沸点有机溶剂的混合溶剂中，并浓缩所得的溶液；(2)(1)中所述的制备嵌段共聚物-药物复合物的方法，在制备方法中不使用透析和超滤方法；(3)(1)或(2)中所述的制备嵌段共聚物-药物复合物的方法，其中，所述AB型嵌段共聚物中的亲水聚合物结构部分是聚环氧乙烷衍生物，所述AB型嵌段共聚物中的疏水聚氨基酸结构部分是聚天冬氨酸，它包含具有通过蒽环霉素(anthracycline)-基抗癌剂连接的侧链羧基的天冬氨酸；(4)(1)或(2)中所述的制备嵌段共聚物-药物复合物的方法，其中，所述AB型嵌段共聚物中的亲水聚合物结构部分是聚环氧乙烷衍生物，所述AB型嵌段共聚物中的疏水聚氨基酸结构部分是聚谷氨酸，它包含具有通过蒽环霉素-基抗癌剂连接的侧链羧基的谷氨酸；(5)(3)或(4)中所述的制备嵌段共聚物-药物复合物的方法，其中，和所述疏水聚氨基酸结构部分上的侧链羧基连接的蒽环霉素-基抗癌剂是阿霉素；(6)(1)-(5)中任一项所述的制备嵌段共聚物-药物复合物的方法，其中，所述药物是蒽环霉素-基抗癌剂；(7)(6)中所述的制备嵌段共聚物-药物复合物的方法，其中，所述蒽环霉素-基抗癌剂是阿霉素或其盐；(8)一种制备包含嵌段共聚物-药物复合物的冻干制剂的方法，所述方法包括如下步骤将由亲水聚合物结构部分和疏水聚氨基酸结构部分组成的AB型嵌段共聚物和药物溶解在水或水与能和水混溶的低沸点有机溶剂的混合溶剂中，浓缩所得的溶液，再将其冻干。
具体实施例方式
本发明的制备嵌段共聚物-药物复合物的方法包括如下步骤将由亲水聚合物结构部分和疏水聚氨基酸结构部分组成的AB型嵌段共聚物和药物溶解在水或水与能和水混溶的低沸点有机溶剂的混合溶剂中，并浓缩所得的溶液；尤其无需进行透析和超滤操作。
在本发明中，透析是使用半渗透膜通过基于浓度差的扩散来除去低分子量组分(包括有机溶剂和盐)的操作。超滤是使用超滤膜(分级分子量5000-50000)除去嵌段共聚物-药物复合物中低分子量组分并浓缩溶液的操作。
对本发明所用的药物没有特别限制，由于本发明复合物基于血管渗透性的肿瘤积聚性质优良，较好是抗癌剂，并提到了各种临床使用的抗癌剂，尤其较好是蒽环霉素-基抗癌剂。蒽环霉素-基抗癌剂的例子包括红比霉素、阿霉素、吡喃阿霉素、acrarubicin、表柔比星、依达比星等，尤其较好是阿霉素。
在所述由亲水聚合物结构部分和疏水聚氨基酸结构部分组成的嵌段共聚物中，所述亲水聚合物结构部分包括所有通常已知的具有亲水性的聚合物，其具体的例子包括聚环氧乙烷、多糖、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇等，及其衍生物，尤其较好是聚环氧乙烷衍生物。至于所述聚环氧乙烷衍生物，例如，具体提到了通式I中所述的亲水聚合物结构部分。
本发明中疏水聚氨基酸结构部分没有特殊限制，只要它选自α-氨基酸、β-氨基酸等，或其衍生物等，较好是包含氨基酸的聚氨基酸，上述氨基酸具有通过蒽环霉素-基抗癌剂连接的侧链羧基。所述聚氨基酸的具体例子包括聚天冬氨酸、聚谷氨酸等。至于连接到侧链羧基上的蒽环霉素-基抗癌剂残基，作为本发明所用药物的蒽环霉素-基抗癌剂的残基如上所述，尤其较好作为疏水聚氨基酸的是聚天冬氨酸，它包含通过阿霉素连接的天冬氨酸。一个分子嵌段共聚物中，蒽环霉素-基抗癌剂在疏水聚氨基酸结构部分中的重量比较好为20％-70％，更好25％-60％。
本发明所用的由亲水聚合物结构部分和疏水聚氨基酸结构部分组成的AB型嵌段共聚物可以是按照JP-A Nos.7-69900，5-955等中所述方法制造的。即，使一端为甲氧基，一端为氨基丙基的聚乙二醇和β-苄基-L-天冬氨酸酯-N-羧酸酐或γ-苄基-L-谷氨酸酯-N-羧酸酐反应，将所得嵌段共聚物的氨端基酰化，并用碱水解侧链苄酯，使用缩合剂和反应辅剂缩合所得侧链游离羧酸和蒽环霉素-基抗癌剂。估计该公报中所述方法制得的嵌段共聚物具有例如以下通式(I)所示的结构 通式(I)所示聚氨基酸结构部分中，构成部分的连接顺序没有特殊限制，可以是无规的或有规律的。在通式中，R较好表示羟基或蒽环霉素-基抗癌剂残基，R1较好表示氢原子或低级烷基，更好低级烷基；R2较好表示低级亚烷基；R3较好表示亚甲基或亚乙基；R4较好表示氢原子或低级丙烯酰基，更好低级酰基。n较好表示5-1000的整数，m较好表示2-300的整数，x+y较好表示0-300的整数，更好的是，n＝80-300，m＝20-50，x+y＝0-50，但是，x+y不大于m。x和y可以是包括0的任意值，只要能满足上述条件。
在R所示的蒽环霉素-基抗癌剂残基中，蒽环霉素-基抗癌剂和上述用作本发明药物的蒽环霉素-基抗癌剂相同，所述较好的蒽环霉素-基抗癌剂也是阿霉素，如上所述。
R1所示的低级烷基较好包括具有1-4碳原子的直链或支链烷基，其具体的例子包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基等，更好是甲基。
R2所示的低级亚烷基较好包括具有1-4碳原子的直链或支链亚烷基，其具体的例子包括亚甲基、亚乙基、三亚甲基、2-甲基三亚甲基、四亚甲基等，更好是三亚甲基。
R3较好表示亚甲基或亚乙基，更好是亚甲基。
R4所示的低级酰基较好包括具有1-4碳原子的酰基，其具体的例子包括甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基等，更好是乙酰基。
通式(I)中，蒽环霉素-基抗癌剂残基和聚氨基酸侧链的连接方式并没有特殊限制，较好是蒽环霉素-基抗癌剂的氨基或羟基和聚氨基酸的侧链羧酸形成的酰胺键或酯键，尤其较好是蒽环霉素-基抗癌剂的氨基糖部分的伯氨基和聚氨基酸的羧酸侧链形成的酰胺键。
通式(I)所示由亲水聚合物结构部分和疏水聚氨基酸结构部分组成的嵌段共聚物中，尤其较好是其中R1是甲基，R2是三亚甲基，R3是亚甲基，R4是乙酰基，n＝80-300，m＝20-50，x+y＝0-50(但不大于m)的嵌段共聚物。
接着，说明本发明的制造方法。将由亲水聚合物结构部分和疏水聚氨基酸结构部分组成的AB型嵌段共聚物溶解在水或水与能和水混溶的低沸点有机溶剂的混合溶剂中。至于本发明所述的低沸点有机溶剂，提到了沸点为100℃(101.3kPa)或以下的有机溶剂，较好是沸点为50℃-100℃(101.3kPa)的有机溶剂，和水混溶的低沸点有机溶剂的具体例子包括甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮等，尤其较好是能以高浓度溶解嵌段共聚物的乙醇。混合溶剂中有机溶剂和水的比率没有特殊限制，只要溶解嵌段共聚物即可，其比率较好为1∶9到9∶1，更好是1∶3到3∶1。加热所述溶剂，以促进溶解。加热的温度可以在嵌段共聚物不会分解且保持稳定性的范围内，较好是30℃-100℃，更好是30℃-60℃。
在本发明的制造方法中，嵌段共聚物在水或水与能和水混溶的低沸点有机溶剂的混合溶剂中的浓度没有特殊限制，只要溶解共聚物即可，通常浓度较好是2％-10％。
之后，当把药物，例如盐酸阿霉素加入所得嵌段共聚物溶液中时，使之溶解制得均匀的溶液。并且，根据稳定性及其它要求控制这种溶液的pH。这种情况下，所述pH范围没有特殊限制，只要药物不会分解，在药物为盐酸阿霉素的情况下，pH较好为4-7。
若溶液中包含有机溶剂，则当所得复合物溶液浓缩时，蒸馏这种有机溶剂如乙醇，制得嵌段共聚物-药物复合物，其中，药物包含在嵌段共聚物制成的聚合物胶束的内核中。因此，无需进行如透析和超滤的常用方法的操作。在由此制得的嵌段共聚物-药物复合物中，通过激光散射证实粒度为数十nm，并确定形成了聚合物胶束，而且通过使用凝胶过滤柱量化包于胶囊内的药物，证实本发明所用的80％或以上的药物包于胶囊内。
而且在本发明中，所得嵌段共聚物-药物复合物可以进一步冻干，制得冻干制剂。在冻干时，可以加入具有缓冲作用的盐，例如，磷酸钠、乙酸钠等，使pH恒定。
若这种冻干制剂例如再次溶解在注射溶剂、生理盐水和具有缓冲作用的生理盐水中，可以制得嵌段共聚物-药物复合物溶液。
在本制造方法中，加入的药物不会如用常用的制造方法那样在制造过程中损失，因此，药物不会浪费，此外，可以提高嵌段共聚物中包于胶囊中的药物的比率。例如，按照JP-A No.7-69900的实施例中所述的制造方法，制造过程中所用阿霉素的利用率和药物含量比率如表1所示，然而，在按照以下所述本发明的制造方法的实施例中，药物利用率和药物含量比率明显提高，如表1所示。
嵌段共聚物-药物复合物的特征在于药物包含于嵌段共聚物制得的胶束中，并相比游离的药物，它具有高的抗癌效果，且毒性低；药物胶囊化比率提高可以相对降低所需嵌段共聚物的量；因此，从经济的角度来看，本发明的复合物实际上也是优良的。
以下实施例说明了本发明，但决不是用于限制本发明的范围。
实施例1往20.00g上述通式(I)所示的嵌段共聚物(R1＝甲基，R2＝三亚甲基，R3＝亚甲基，R4＝乙酰基，R＝羟基或阿霉素残基(阿霉素连接的平均比率45％)，聚乙二醇的平均分子量＝5287，天冬氨酸的平均单元数＝28.1)中加入100mL注射溶剂，在35℃下加热所述混合物，形成悬浮液。往其中加入6.0mL 0.5N氢氧化钠溶液并搅拌，然后加入100mL无水乙醇。确定嵌段共聚物溶解之后，加入3.906g盐酸阿霉素，并溶解。加入5.9mL 0.5N氢氧化钠，将pH控制到6，并加入188mL注射溶剂。1小时之后，通过膜过滤器(Millipore；GV型0.22μm)过滤所述溶液，然后，在减压条件下蒸馏除去溶剂，制得嵌段共聚物-药物复合物溶液，再将其冻干制得22.96g嵌段共聚物-药物复合物的冻干物质。这种复合物的药物含量为16.31％。
试验例1将实施例1制得的冻干物质溶解在磷酸盐缓冲的生理盐水(pH 7.4)中，制得1mg/mL的溶液。将这种样品溶液静置在5℃下过夜，然后用于分析。在玻璃柱中充满约2mL用水溶胀的Sephadex G-25(Farmacia制造；级别细)。往该柱中加入200μL所述样品溶液。通过用水展开，取出一部分包含药物的胶束，然后用等量的二甲基甲酰胺(DMF)稀释，然后加入水-DMF(1∶1)溶液(溶液1)至5mL。另外，将200μL所述样品溶液置于5mL的量瓶中，并加入水-DMF(1∶1)溶液(溶液2)至5mL。通过分解胶束结构的反相HPLC分析溶液1和2，计算所得图谱中阿霉素的峰面积比率(溶液1中游离阿霉素的量/溶液2中游离阿霉素的量)。实施例1所得嵌段共聚物-药物复合物的药物含量比率为94.9％。这一结果表明嵌段共聚物-药物复合物中的药物包含于嵌段共聚物所得胶束的内核中。
柱Waters Symmetry C84.6×250mm柱温40℃洗提液(A)0.05％MS-3+0.01％ TFA(MS-3是GL Science制得的离子对试剂，TFA是三氟乙酸)(B)CH3CN梯度时间(min) 0 20 25 35 50 51 60B(％) 20 40 40 90 90 20 20检测器UV(485nm)流速 0.8mL/min注射量20μL应用例1将结肠26腺癌细胞皮下移植到各CDF1雌性小鼠的腋下区域中。当肿瘤体积达到约100mm3时，静脉注射实施例1所得的嵌段共聚物-药物复合物或盐酸阿霉素。所述已经冻干并储存在阴冷处的嵌段共聚物-药物复合物溶解在用磷酸作缓冲的生理盐水(pH 7.4)中，根据复合物中的药物量确定这种情况下的剂量。从移植60天之后肿瘤消失(治愈)的小鼠数以及注射14天之后肿瘤增殖抑制比率来判断药物的抗癌效果。结果列于表2中。
小鼠结肠癌Colon 26的效果
a)注射14天之后和对照组相比肿瘤的体积比b)观察60天之后治愈的小鼠数/一组中的数量c)中毒死亡的小鼠数/一组中的数量相比注射盐酸阿霉素本身的情况，当注射本发明嵌段共聚物-药物复合物时，在所有服药组中显示了更强的减小肿瘤效果。当观察期(60天)结束时治愈的小鼠数比注射盐酸阿霉素本身的情况多，并证实，相比游离的药物，所述嵌段共聚物-药物复合物在较低的毒性范围内显示了更高的抗癌效果。
发明效果根据本发明制造胶束型嵌段共聚物-药物复合物的方法，由于不使用透析操作和超滤操作，其操作性显著提高，并且药物的利用率优良，药物含量可以提高并成功地重现，相比常用的制造方法，可以在更短的时间内制造所述复合物。由于并不需要专门的设备，无需使用大量的水，这种制造方法容易进行，且可以成功地工业化。根据本发明，可以经济且简单地提供在较低毒性范围内具有更高抗癌效果的嵌段共聚物-药物复合物。
权利要求
1.一种制备嵌段共聚物-药物复合物的方法，所述方法包括如下步骤将包含亲水聚合物结构部分和疏水聚氨基酸结构部分的AB型嵌段共聚物和药物溶解在水或水与能和水混溶的低沸点有机溶剂的混合溶剂中，并浓缩所得的溶液。
2.权利要求1所述的制备嵌段共聚物-药物复合物的方法，其特征在于，在制备方法中不使用透析和超滤方法。
3.权利要求1或2所述的制备嵌段共聚物-药物复合物的方法，其特征在于，所述AB型嵌段共聚物中的亲水聚合物结构部分是聚环氧乙烷衍生物，所述AB型嵌段共聚物中的疏水聚氨基酸结构部分是聚天冬氨酸，它包含具有通过蒽环霉素-基抗癌剂连接的侧链羧基的天冬氨酸。
4.权利要求1或2所述的制备嵌段共聚物-药物复合物的方法，其特征在于，所述AB型嵌段共聚物中的亲水聚合物结构部分是聚环氧乙烷衍生物，所述AB型嵌段共聚物中的疏水聚氨基酸结构部分是聚谷氨酸，它包含具有通过蒽环霉素-基抗癌剂连接的侧链羧基的谷氨酸。
5.权利要求3或4所述的制备嵌段共聚物-药物复合物的方法，其特征在于，和所述疏水聚氨基酸结构部分上的侧链羧基连接的蒽环霉素-基抗癌剂是阿霉素。
6.权利要求1-5中任一项所述的制备嵌段共聚物-药物复合物的方法，其特征在于，所述药物是蒽环霉素-基抗癌剂。
7.权利要求6所述的制备嵌段共聚物-药物复合物的方法，其特征在于，所述蒽环霉素-基抗癌剂是阿霉素或其盐。
8.一种制备包含嵌段共聚物-药物复合物的冻干制剂的方法，所述方法包括如下步骤将包含亲水聚合物结构部分和疏水聚氨基酸结构部分的AB型嵌段共聚物和药物溶解在水或水与能和水混溶的低沸点有机溶剂的混合溶剂中，浓缩所得的溶液，再将其冻干。
全文摘要
一种制备嵌段共聚物－药物复合物的工业化方法，它无需进行透析和超滤，也不使用卤代烃。制备嵌段共聚物－药物复合物的方法的特征在于包括如下步骤将由亲水聚合物结构部分和疏水聚氨基酸结构部分组成的AB型嵌段共聚物和药物溶解在水或水与能和水混溶的低沸点有机溶剂的混合溶剂中，并浓缩所得的溶液。
文档编号C08G73/10GK1662259SQ0381424
公开日2005年8月31日 申请日期2003年6月18日 优先权日2002年6月19日
发明者中西健, 清水和久 申请人:日本化药株式会社, 独立行政法人科学技术振兴机构, 樱井靖久