专利名称：：一种以硫代磺酸酯为端基的聚烷基醚聚合物及合成和用途的制作方法
技术领域：
：本发明属于蛋白质化学领域，涉及一种蛋白质药物修饰剂及合成方法和用途，更具体的涉及巯基定点的蛋白质药物修饰剂及其合成方法和用途。
背景技术：
：随着生物工程技术的发展，很多天然蛋白、重组蛋白以及抗体(或其片段)陆续进入药用领域。但是蛋白质作为药物使用时却具有很多不利的缺陷，如免疫源性，易遭受蛋白水解酶的降解以及水溶性差等。在过去的几十年中，生物制药界在提高蛋白质药物的性能方面付出了很大的努力，其中一个重要的方面便是将蛋白质药物与天然或合成的高分子共价连接。已有数种聚合物修饰的蛋白质药物被FDA批准进入市场，此外还有多种聚合物修饰的蛋白类药物处于临床研究阶段。应用聚合物修饰的主要目的是改变目标蛋白的血液半衰期和稳定性，降低潜在的免疫源性和抗原性，以及改善蛋白药物的水溶性和可操作性。在可用于蛋白质药物修饰的天然或合成聚合物中，聚烷基醚类聚合物聚乙二醇(PEG)是应用最广泛的聚合物修饰剂之一。它具有一系列优点低毒性、良好的水溶性和油溶性以及极低的免疫源性和抗原性。PEG还表现出优良的药代动力学和生物分布行为，当注入动物体内时，PEG表现出高的血液相容性和在肝、脾内低的累积。PEG成为蛋白质药物领域最重要修饰剂的另外一个原因是PEG链排斥周围环境中的蛋白质和其它大分子，可以有效地保护所修饰的蛋白药物。为了避免蛋白修饰过程产生不必要的偶联，在蛋白质药物修饰领域中应用较多的是一端封闭的单甲氧基聚乙二醇(mPEG)。然而，由于修饰过程的随机性，蛋白质药物的聚合物修饰在提高其性能的同时也带来了一些副作用，例如降低药物的活性，影响药物制备过程的重复性和可控性。因此，可以对蛋白质药物进行定点修饰的试剂便显得非常重要。巯基是蛋白质中用于定点修饰的重要基团，由于其强亲核性，针对巯基反应的修饰试剂具有良好的专一性。虽然自由巯基在蛋白中很少见，但是可以采用化学或基因工程的方法在蛋白质中引入巯基。对于合成多肽，可以在合成的时候引入半胱氨酸，从而引入自由巯基。对于自由巯基包埋于蛋白内部的情形，也可以采用可逆变性或者PEG杂交技术来对巯基进行修饰，后者是先偶联短链PEG，然后再偶联所需分子量的聚乙二醇。当前主要使用的PEG巯基修饰试剂包括马来酰亚胺(PEG-MAL)、乙烯基砜(PEG-VS)、碘代乙酰胺(PEG-IA)和二硫基异吡啶(PEG-0PSS)。这些修饰试剂各有优缺点。PEG-MAL在弱酸性条件下与巯基反应，但是修饰剂本身会发生开环或双键与水加成的副反应。PEG-VS在弱碱条件下与巯基反应，随pH升高反应速度加快，虽然PEG-VS在水溶液中稳定，但是在高pH下与赖氨酸反应。PEG-IA与自由巯基缓慢反应，形成稳定的硫醚键，但修饰反应需在避光条件下进行，以避免产生自由碘而与其它残基反应。PEG-0PSS可以在碱性和酸性条件下与巯基选择性反应，形成稳定的二硫键，但是修饰过程需PEG-0PSS大大过量，并且PEG-0PSS合成过程较复杂。本发明提供了一类新型的PEG巯基修饰试剂——聚乙二醇硫代磺酸酯。该类修饰剂合成过程简单，对巯基的反应活性与选择性高，修饰过程可以在多种缓冲体系下进行，并且不受其它反应基团的影响。
发明内容本发明发现，具有IA和IB结构——以硫代磺酸酯为端基的聚烷基醚类聚合物——以巯基定点的方式对蛋白质进行修饰，得到以二硫键联结的修饰蛋白质。oR,O——PAG+CH2~)~X+CH2~}~S——S——RoIA其中&为氢或l-7个碳原子的直链或支链烷基，X为选自-(C=0)NH-、-0(C=0)NH-、-NH-成-0-中的一种，PAG为去除两端羟基的聚烷基醚链，其分子量范围为lk到100k，m为1到4的整数，w为2到4的整数。R为选自甲基、乙基、丙基、苯基或对甲基苯基中的一种。、0—PAGr"^CH2")-X，~("CH2)oR20—PAG2+CH2^-X2—CH——X3-^CH2")~S—S—Rq/w||3IB其中12为氢或l-7个碳原子的直链或支链烷基，&、^和^为选自-(C=0)NH-、-O(C=O)NH-、-NH-或-0-中的一种，PAG工和PAG2为去除两端羟基的聚烷基醚链，其分子量可以相同也可以不同，其分子量的范围为lk到100k，p、q和z为1到4的整数，其中Ri、w与R与上述相同。本发明还发现具有IC结构的聚烷基醚类聚合物可以用于蛋白质的巯基定点标记、定点偶联或蛋白质的固定化。,wSIC其中所述的Z可以为本发明所述的硫代磺酸酯基，或为选自羟基、氨基、羧基、马来酰亚氨基、碘代乙酰基、乙烯基砜、醛基、异氰酸酯、N-羟基琥珀酰亚胺酯、二硫联异吡啶基、迭氮基、炔基、生物素和荧光素中的一种。本发明所述的IA、IB和IC中的聚烷基醚聚合物是指聚低链烷基醚聚合物，其中所述的低链烷基是指含2到7个碳原子的直链或支链烷基。在本发明的一个优选实施例中，IA、IB和IC中的PAG指去除两端羟基的聚乙二醇链，其分子量为100到100000，对于IA和IB优选10000到50000，对于IC其中聚乙二醇链分子量优选100到5000。本发明所述的硫代磺酸试剂可以以巯基定点的方式与蛋白质偶联，从而避免了随机偶联而产生的混合物。位点异构的蛋白质偶联物分离困难，由于是混合物也无法直接作为药物使用。本发明所述的蛋白质可以为任何药用蛋白质和多肽，如干扰素、粒细胞集落剌激6因子(G-CSF)、血红蛋白、白介素以及促红细胞生成素(EPO)，还包括免疫球蛋白及其片段。对于不含自由巯基的蛋白质，可以通过基因工程或化学方法加入一个或多个巯基。本发明所述的IA和IB结构中具有硫代磺酸酯官能团，其中所述硫代磺酸酯官能团包括硫代烷基磺酸酯和硫代芳香磺酸酯，其中所述的硫代烷基磺酸酯包括硫代甲基磺酸酯和硫代乙基磺酸酯和硫代丙基磺酸酯，其中所述的硫代芳香磺酸酯包括硫代苯磺酸酯和硫代对甲苯磺酸酯。硫代磺酸酯基团可以在温和的条件下和巯基发生特异性反应，形成二硫键。本发明所述的IA和IB可以与蛋白质中半胱氨酸上的巯基发生特异性反应，形成二硫键。该反应可以在非常温和条件下进行，耐受多种缓冲体系和宽的PH范围。反应速率快，特异性高。IA与蛋白反应后形成具有如下结构R,0—PAG寸CH2^"X+CH2—S—S—ProteinwIIA其中的Protein代表上述的蛋白质药物，其中PAG、&、m、w与R与上述相同。IB与蛋白质巯基反应后具有如下结构R,O—PAG，十CH2")~X，~^~CH2R20—PAG叶CH2^~~X2——CH—X3~^CH2^~S—S—Protein其中Protein、PAG"PAG2、R、R"R2、PAG!、PAG2、X"X2p、q、z与w与上述相同'本发明所述的IC与蛋白质巯基定点反应后，形成如下结构Z-PAG~f~CH2—X+CH24~S—S——Protein、乂m\w其中的m，w与Protein与前述相同，当Z为活性基团，如活性酯或胺基时，IIC可以与其它分子或表面偶联，当Z为标记分子，如荧光素或生物素时，可以形成定点标记的蛋白。当本发明所述的IA中PAG为聚乙二醇，m为2，X为0，且w为2时，IA的结构为0RiO十CH2CH20")^CH2CH2—S—S—ROIA-i其中n为聚乙二醇的聚合度，其数值决定于所选聚乙二醇的分子量，例如分子量为5k的聚乙二醇，n约为460，IA-i中聚乙二醇片段的分子量范围为2000-50000。本发明所述的IA-i可按如下方式合成7<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>在合成IA-i的第一步，聚烷基醚II的羟基被转化为易离去基团L，本发明对活化羟基的方式没有任何限制，如L可以为选自氯、溴、甲基磺酸酯、苯基磺酸酯以及对甲基苯磺酸酯中的一种。羟基活化的聚烷基醚III与硫代烷基磺酸钠C反应，发生S-烷基化反应，得到结构IA-i，反应可以在极性质子溶剂甲醇、乙醇中进行，也可以在极性非质子溶剂如甲苯、二氧六环与乙腈等进行，优选在反应体系中，加入相转移催化剂。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>其中所述的R与前述相同。当本发明所述的IA中PAG为聚乙二醇，m为l，X为(C=0)NH，且w为2时，IA的结构为<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>其中所述的n、I^与R与前述相同，IA-ii中聚乙二醇片段的分子量范围为2000-50000。本发明所述的IA-ii可按以下流程合成，但该发明并不限制于该流程中。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>端基为羧基的聚烷基醚IV可以任何方法将其羧基活化，然后与氨基乙醇反应得到V，例如N，N'-二环己基碳酰亚胺(DCC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)法。在合成IA-ii的第二步，聚烷基醚V的羟基被转化为易离去基团L，本发明对活化羟基的方式没有任何限制，如L可以为选自氯、溴、甲基磺酸酯、苯基磺酸酯以及对甲基苯磺酸酯中的一种。羟基活化的聚烷基醚VI与硫代烷基磺酸钠C反应，得到结构IA-ii，反应可以在极性质子溶剂甲醇、乙醇中进行，也可以在极性非质子溶剂如甲苯、二氧六环与乙腈等进行，优选在反应体系中，加入相转移催化剂。当本发明所述的IB中PAG!和PAG2为聚乙二醇，p禾Pq为1，X"X2和X3为-(C=O)NH，W为2，z为4时，IB的结构为<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>分子i其中nl与n2为聚乙二醇片段的分子量，其数值决定于所选聚乙二醇片段的IB-i中两聚乙二醇片段的分子量可以相同也可以不同，其分子量范围分别为2000-50000。本发明所述的IB-可按如下方式合成<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>端基为羧基的分枝型聚烷基醚VI可以任何方法将其羧基活化，然后与氨基乙醇反应得到VIII，例如N，N'-二环己基碳酰亚胺(DCC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)法。在合成IB-i的第二步，聚烷基醚VIII的羟基被转化为易离去基团L，本发明对活化羟基的方式没有任何限制，如L可以为选自氯、溴、甲基磺酸酯、苯基磺酸酯以及对甲基苯磺酸酯中的一种。羟基活化的聚烷基醚IX与硫代烷基磺酸钠C反应，发生S-烷基化反应，得到结构IB-i，反应可以在极性质子溶剂甲醇、乙醇中进行，也可以在极性非质子溶剂如甲苯、二氧六环与乙腈等进行，优选在反应体系中加入相转移催化剂。当本发明所述的IC中PAG为聚乙二醇，m为2，X为0，且w为2时，IC的结构为<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>其中Z、R与上述相同，其中n为聚乙二醇的聚合度，其数值决定于所选聚乙二醇的分子量，例如分子量为5k的聚乙二醇，n约为460，IC-i中聚乙二醇的分子量为100-10000。IC-i可以使用一端为羟基，另一端为Z(或受保护的Z)的聚乙二醇原料来合成。当Z在羟基活化和S-烷基化过程中保持惰性时，可以直接以Z为端基的聚乙二醇来进行IC-i的合成，例如当Z为羧基时，则可以a-羟基-"-羧基-聚乙二醇为原料，按IA-i相同的合成步骤来合成。而当Z此衍生过程中无法保持惰性，则必须采取保护或其它措施，本发明的一个实施例中，阐述了Z为胺基时的合成过程。图1:实施例10中使用聚乙二醇5k硫代甲磺酸酯(mPEG5k-MTS)和聚乙二醇5k硫代苯磺酸酯(mPEG5k-PTS)修饰的木瓜蛋白酶，以及修饰产品的还原泳道1:低分子量marker泳道2:天然木瓜蛋白酶泳道3:使用mPEG5k-MTS修饰的木瓜蛋白酶泳道4:使用mPEG5k-PTS修饰的木瓜蛋白酶泳道5和泳道6:泳道3和泳道4相同样品，电泳前用DTT还原。图2:实施例11中使用mPEG5k-MTS和mPEG5k-PTS修饰的G-CSF。实施例实施例一mPEG5k-MTS的合成a)硫代甲基磺酸钠的合成操作向lg硫代甲亚磺酸钠和0.032g硫中加入40ml甲醇，回流反应至硫完全溶解，蒸干甲醇得到白色粉末。IR(KBr):1320cm—、1220cm—、and1100cm—1NMR(D20):S3.24(s，SCH3)。b)mPEG5k-Br的合成操作5gmPEG5k甲苯溶于50mL甲苯，共沸除水，体系降至室温后，加入lOOiiL三溴化磷和50iiL三乙胺，6(TC反应过夜。反应完毕后，加入湿的碳酸氢钠搅拌，蒸干甲苯，残余物中加入50mL二氯甲烷溶解后过滤，二氯甲烷溶液旋蒸浓縮至10mL，倾入lOOmL冷乙醚中得到白色沉淀，过滤得产品。c)mPEG5k-MTS的合成操作将5gmPEG5K-Br溶于无水乙醇，加入20mg(2mmo1)硫代甲磺酸钠，回流反应12h，反应完毕后蒸干乙醇，加入盐水溶解，然后以二氯甲烷萃取，二氯甲烷溶液使用无水硫酸钠干燥，真空下浓縮至10mL，倾入100mL冷乙醚中得到白色沉淀，过滤得产品(96%)。NMR(DMS0-d6)，S(卯m):3.24(CH30_，3H)，3.51(PEGmainchain,490H)，2.93(CH3S02S-，3H)。实施例二mPEG20k-MTSa)mPEG20k-Br的合成操作10gmPEG20k甲苯溶于50mL甲苯，共沸除水，体系降至室温后，加入50iiL三溴化磷和25iiL三乙胺，6(TC反应过夜。反应完毕后，加入湿的碳酸氢钠搅拌，蒸干甲苯，残余物中加入二氯甲烷溶解过滤，二氯甲烷溶液使用无水硫酸钠干燥，真空下浓縮至10mL，倾入lOOmL冷乙醚中得到白色沉淀，过滤得产品。b)mPEG20k-MTS的合成操作将10gmPEG20k-Br溶于无水乙醇，加入lOmg(lmmol)硫代甲磺酸钠，回流反应12h，反应完毕后蒸干乙醇，加入盐水溶解，然后以二氯甲烷萃取，二氯甲烷溶液使用无水硫酸钠干燥，真空下浓縮至10mL，倾入100mL冷乙醚中得到白色沉淀，过滤得产品。收率97X，111NMR(DMS0-d6)，S(ppm):3.24(CH30_，3H)，3.51(PEGmainchain，1930H)，2.93(CH3S02S_，3H).实施例三MPEG-PTS11a)硫代苯磺酸钠(PTSNa)的合成操作向1.5g硫代苯亚磺酸钠和0.032g硫中加入40ml甲醇，回流反应至硫完全溶解，蒸干甲醇得到白色粉末。^NMR(D20):7.28-7.76(5H，m，Ar_H)IR(KBr):1223cm—、1190cm—1,1120cm—1,1066cm—、b)mPEG5k-Br的合成操作5gmPEG5k甲苯溶于50mL甲苯，共沸除水，体系降至室温后，加入lOOiiL三溴化磷和50iiL三乙胺，60。C反应过夜。反应完毕后，加入湿的碳酸氢钠搅拌，蒸干甲苯，残余物中加入适量二氯甲烷过滤，二氯甲烷溶液使用无水硫酸钠干燥，真空下浓縮至lOmL，倾入lOOmL冷乙醚中得到白色沉淀，过滤得产品。c)mPEG5k-PTS的合成操作将5gmPEG5k_Br溶于50mL无水二氧六环，加入30mg(2mmo1)硫代苯磺酸钠，回流反应12h，反应完毕后蒸干二氧六环，加入盐水溶解，然后以二氯甲烷萃取，萃取液干燥后乙醚沉淀得到白色固体(98X)HNMR(匿SO-de)，S(ppm):3.24(CH30-，3H)，3.51(PEGmainchain,488H)，7.53—7.93(5H，Ar_H)。实施例四mPEG20k-PTSa)mPEG20k-Br的合成操作20gmPEG20k溶于50ml甲苯，共沸除水，体系降至室温后，加入lOOiiL三溴化磷和50iiL三乙胺，6(TC反应过夜。反应完毕后，加入湿的碳酸氢钠搅拌，蒸干甲苯，残余物中加入二氯甲烷过滤，乙醚沉淀。b)mPEG20k-PTS的合成操作将10gmPEG20k-Br溶于无水乙醇，加入15mg(lmmo1)硫代苯磺酸钠，回流反应12h，反应完毕后蒸干乙醇，加入盐水溶解，然后以二氯甲烷萃取，萃取液干燥后乙醚沉淀得到白色固体。收率93X，111NMR(DMS0-d6)，S(卯m):3.24,-，3H)，3.5(PEGmainchain,1922H)，7.53—7.93(5H，Ar_H)。实施例五mPEG5k-(CONH)_CH2CH2_MTS合成合成流程如下CH30+CH2CH20^~CH2COOHOCH30+CH2CH2C>tCH2C—N——CH2CH2—OHVAO丄l11HCH30+CH2CH20)~~CH2C—N——CH2CH2—Br、"50VBOCH30+CH2CH20")~CH2C—N_vc-CH2CH2——S-具体操作为OII-S——CH3IIo12a)5gmPEG5k羧酸溶于50mL甲苯，共沸除水后，蒸干甲苯，溶于无水二氯甲烷，在溶液中加入1.5倍摩尔量的DCC和2-羟基乙胺反应过夜，过滤后乙醚沉淀，得到白色固体VA。b)5gVA溶于50ml甲苯，共沸除水，体系降至室温后，加入100iiL三溴化磷和50iiL三乙胺，6(TC反应过夜。反应完毕后，加入湿的碳酸氢钠搅拌，蒸干甲苯，残余物中加入二氯甲烷溶解后过滤，浓縮至10ml，乙醚沉淀得VB。c)5gVB溶于50mL无水二氧六环，加入10mg(2mmo1)硫代甲磺酸钠，回流反应12h，反应完毕后蒸干二氧六环，加入盐水溶解，然后以二氯甲烷萃取，萃取液干燥后乙醚沉淀得到白色固体VC收率97%，丄HNMR(DMS0-d6)，S(卯m):3.24(CH30_，3H)，3.51(PEGmainchain,476H)，2.93(CH3S02S_，3H)，4.19(-C&CONH-，2H)。实施例六mPEG5k-(CONH)_CH2CH2CH2_MTS合成流程如下CH30+CH2CH20^~CH2COOH0丄x_IIHC+CH2CH2CH~CH2C——N——CH2CH2CH2—OH、Z450VIA,、IIHCH30+CH2CH20)~CH2C——N——CH2CH2CH2-BrJ、7450VIBCH,0+CH2CH20^~CH2C—N——CH2CH2CH2—S—S——CH3oVIC具体操作为a)5gmPEG5k羧酸溶于50mL甲苯，共沸除水后，蒸干甲苯，溶于无水二氯甲烷，在溶液中加入1.5倍摩尔量的DCC和3-羟基丙胺反应过夜，过滤后乙醚沉淀，得到白色固体VIA。b)5gVIA甲苯共沸除水，体系降至室温后，加入100iiL三溴化磷和50iiL三乙胺，6(TC反应过夜。反应完毕后，加入湿的碳酸氢钠搅拌，蒸干甲苯，残余物中加入二氯甲烷溶解后过滤，乙醚沉淀得VIB。c)5gVIB溶于50mL无水二氧六环，加入10mg(2mmo1)硫代甲磺酸钠，回流反应12h，反应完毕后蒸干二氧六环，加入盐水溶解，然后以二氯甲烷萃取，萃取液干燥后乙醚沉淀得到白色固体VIC收率93^,HNMR(DMS0-d6)，S(卯m):3.24(CH30_，3H)，3.51(PEGmainchain,482H)，2.93(CH3S02S_，3H)，4.15(-C&CONH-，2H)。实施例七分支型mPEG10K-MTS合成流程如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>合成操作为lOg分支型mPEGlOk羧酸溶于50mL甲苯，共沸除水后，蒸干甲苯，溶于无水二氯甲烷，在溶液中加入1.5倍摩尔量的DCC和2-羟基乙胺反应过夜，过滤后乙醚沉淀，得到9.8g白色固体。所得白色固体甲苯共沸除水，体系降至室温后，加入100i!L三溴化磷和50iiL三乙胺，6(TC反应过夜。反应完毕后，加入湿的碳酸氢钠搅拌，蒸干甲苯，残余物中加入二氯甲烷过滤，乙醚沉淀得溴代分支型mPEG10k。10g溴代分支型mPEG10k溶于50mL无水二氧六环，共沸除水后，加入10mg(2mmo1)硫代甲磺酸钠，回流反应12h，反应完毕后蒸干二氧六环，加入盐水溶解，然后以二氯甲烷萃取，萃取液干燥后乙醚沉淀得到白色固体VC收率97X，111NMR0)MSO-d6)，S(卯m):3.24(CH30-，6H)，3.51(PEGmainchain,1012H)，2.93(CH3S02S_，3H)。实施例八<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>2ga-羧基-"-羟基-聚乙二醇(2k)甲苯共沸除水，体系降至室温后，加入lOOiiL三溴化磷和50iiL三乙胺，6(TC反应过夜。反应完毕后，加入湿的碳酸氢钠搅拌，蒸干甲苯，残余物中加入二氯甲烷过滤，乙醚沉淀得到a-羧基-"-溴-聚乙二醇(2k)。2ga-羧基-"-溴-聚乙二醇(2k)溶于无水乙醇，加入20mg(2mmo1)硫代甲磺酸钠，回流反应12h，反应完毕后蒸干乙醇，加入盐水溶解，然后以二氯甲烷萃取，萃取液干燥后乙醚沉淀得到白色固体IC-ii，收率95%ZHNMR(DMS0-d6)，S(卯m):3.51(PEGmainchain,198H)，2.93(CH3S02S_，3H)，4.15(-C&C00H，2H)。实施例九OH2N-(~CH2CH20")^~CH2CH2—S—S—ROIC陽iii使用a-迭氮基羟基_聚乙二醇(2k)为原料进行合成2ga-迭氮基-"-羟基-聚乙二醇(2k)甲苯共沸除水，体系降至室温后，加入100iiL三溴化磷和50iiL三乙胺，6(TC反应过夜。反应完毕后，加入湿的碳酸氢钠搅拌，蒸干甲苯，残余物中加入二氯甲烷过滤，乙醚沉淀得到a-迭氮基-"-溴-聚乙二醇(2k)。2ga-迭氮基-"-溴-聚乙二醇(2k)溶于无水乙醇，加入20mg(2mmo1)硫代甲磺酸钠，回流反应12h，反应完毕后蒸干乙醇，加入盐水溶解，然后以二氯甲烷萃取，萃取液合并、干燥后乙醚沉淀得到IC-a白色固体。oN3-f"CH2CH20")"^CH2CH2—S—S——RnIIOIC-aIC-a溶于干燥的四氢呋喃(20%1120)，加入对应摩尔量的三苯基磷，反应12h后，蒸干四氢呋喃，加水溶解，过滤后以二氯甲烷萃取，并以乙醚沉淀，得到白色固体产品IC-iii。收率90^HNMR(DMS0-d6)，S(ppm):3.51(PEGmainchain,184H)，2.94(CH3S02S-，3H)，2.85(-C^NH^2H)。实施例十使用mPEG5k-MTS修饰木瓜蛋白酶将木瓜蛋白酶溶于2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)缓冲液(5mg/mL)，蛋白溶液置于密封管中，然后分别加入1.2倍摩尔量的mPEG5k硫代甲磺酸酯和mPEG5k硫代苯磺酸酯，置于垂直混合仪上(20rpm)旋转反应。修饰结果见说明书附图l，在非还原泳道中，修饰产物为单条带，在还原泳道中，修饰产物消失，证实蛋白修饰过程为二硫键联结的巯基定点修饰实施例i^一使用mPEG5k-MTS修饰G-CSF取300iiL溶于醋酸缓冲液的G-CSF(1.5mg/mL)置于密封管内，1.5倍摩尔量的mPEG5k硫代甲磺酸酯溶于MES缓冲液，溶解后与蛋白混合，混合液中加入500mg盐酸胍，置于垂直混合仪上旋转反应。修饰结果见说明书附图2，蛋白经修饰后在原蛋白前出现单一峰，经还原后修饰峰消失，原料蛋白的峰重新出现，证明蛋白修饰过程为二硫键联结的巯基定点修饰。1权利要求一种具有IA、IB或IC结构以硫代磺酸酯为端基的聚烷基醚类聚合物其中R1为氢或1-7个碳原子的直链或支链烷基，X为选自-(C＝O)NH-、-O(C＝O)NH-、-NH-或-O-中的一种，PAG为去除两端羟基的聚烷基醚链，其分子量范围为100到100000，m为1到4的整数，w为2到4的整数。R为选自甲基、乙基、丙基、苯基或对甲基苯基中的一种；其中R1与R2为氢或1-7个碳原子的直链或支链烷基，X1、X2和X3为选自-(C＝O)NH-、-O(C＝O)NH-、-NH-或-O-中的一种，PAG1和PAG2为去除两端羟基的聚烷基醚链，其分子量范围为100到100000，w为2到4的整数，p、q和z为1到4的整数，R为选自甲基、乙基、丙基、苯基或对甲基苯基中的一种；其中所述的Z为本发明所述的硫代磺酸酯基，或为选自羟基、氨基、羧基、马来酰亚氨基、碘代乙酰基、乙烯基砜、醛基、异氰酸酯、N-羟基琥珀酰亚胺酯、二硫联异吡啶基、迭氮基、炔基、生物素和荧光素。m为1到4的整数，w为2到4的整数。R为选自甲基、乙基、丙基、苯基或对甲基苯基中的一种。F2008102246335C0000011.tif,F2008102246335C0000012.tif,F2008102246335C0000013.tif2.—种按权利要求1所述的以硫代烷基磺酸酯为端基的聚烷基醚类聚合物，其中所述的聚烷基醚类聚合物是指聚低链烷基醚聚合物，其中所述的低链烷基是指含2到7个碳原子的直链或支链烷基。3.—种按权利要求1所述的以硫代磺酸酯为端基的聚烷基醚类聚合物，其中所述的聚烷基醚类聚合物，优选为选自聚乙二醇、聚环氧丙烷或聚四氢呋喃中的一种。4.按权利要求3所述的聚烷基醚类聚合物为聚乙二醇。5.—种按权利要求l所述的以硫代磺酸酯为端基的聚烷基醚类聚合物，其中IA的结构优选为<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>其中&为氢或1-7个碳原子的直链或支链烷基，R为选自甲基、乙基、丙基、苯基或对甲基苯基中的一种，n为聚乙二醇的聚合度，其数值决定于所选聚乙二醇的分子量，IA-i中聚乙二醇的分子量范围为2000-50000。6.—种按权利要求l所述的以硫代磺酸酯为端基的聚烷基醚类聚合物，其中IA的结构优选为<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>其中&为氢或1-7个碳原子的直链或支链烷基，R为选自甲基、乙基、丙基、苯基或对甲基苯基中的一种，w为2到4的整数，n为聚乙二醇的聚合度，其数值决定于所选聚乙二醇的分子量，IA-ii中聚乙二醇的分子量范围为2000-50000。7.—种按权利要求l所述的以硫代磺酸酯为端基的聚烷基醚类聚合物，其中IB的结构优选为<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>其中IVR2为氢或1-7个碳原子的直链或支链烷基，R为选自甲基、乙基、丙基、苯基或对甲基苯基中的一种，w为2到5的整数，ni与n2为聚乙二醇的聚合度，其数值决定于所选聚乙二醇的分子量，IB-i中两个聚乙二醇片段分子量可以相同或不同，其分子量范围分别为2000-50000。8.—种按权利要求l所述的以硫代磺酸酯为端基的聚烷基醚类聚合物，其中IC的结构优选为<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>其中R为选自甲基、乙基、丙基、苯基或对甲基苯基中的一种，Z为本发明所述的硫代磺酸酯基，或为选自羟基、氨基、羧基、马来酰亚氨基、碘代乙酰基、乙烯基砜、醛基、异氰酸酯、N-羟基琥珀酰亚胺酯、二硫联异吡啶基、迭氮基、炔基、生物素和荧光素的一种，w为2到5的整数，n为聚乙二醇的聚合度，其数值决定于所选聚乙二醇的分子量，IC-i中聚乙二醇的分子量为100-10000。9.一种合成以硫代磺酸酯为端基的聚烷基醚类聚合物的方法，包括i)将聚烷基醚聚合物的端羟基转化为离去基团L，ii)具有离去基团L的聚烷基醚类聚合物与对应的硫代磺酸钠C反应，其中L可以为选自氯、溴、甲基磺酸酉旨、苯基磺酸酯以及对甲基苯磺酸酯中的一种，C的结构为<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>其中的R为选自甲基、乙基、丙基、苯基或对甲苯基中的一种。10.按权利要求9所述的合成方法，其中第二步反应在有机溶剂中进行。11.权利要求10所述的有机溶剂为选自甲苯、二氧六环、四氢呋喃、二甲基亚砜、N，二甲基甲酰胺、甲醇和乙醇中的一种。12.按权利要求9所述的合成方法，其中第二步反应的温度为60°C120°C。13.按权利要求9所述的合成方法，其中第二步反应优选加入相转移催化剂。14.具有IA和IB结构的以硫代磺酸酯为端基的聚烷基醚类聚合物的用途为对含有巯基的多肽和蛋白质进行修饰，得到以二硫键联结的聚烷基醚修饰蛋白质，其特征为修饰过程具有巯基特异性，得到二硫键联结的均一修饰物，其中所述含有巯基的多肽和蛋白质至少含有一个自由巯基。15.具有IC结构的以硫代磺酸酯为端基的聚烷基醚类聚合物的用途为对含有巯基的多肽和蛋白进行定点标记或将其与聚合物或表面偶联，其特征为标记或偶联过程具有巯基特异性，得到二硫键联结的均一偶联物，其中所述含有巯基的多肽和蛋白质至少含有一个自由巯基。全文摘要本发明提供了一种以硫代磺酸酯为端基的聚烷基醚类聚合物，尤其是以硫代磺酸酯为端基的聚乙二醇，以及该类聚合物的合成方法和用途。该类聚合物可以和蛋白质的自由巯基在温和条件下发生反应，反应特异性强，速度快，反应使聚合物与蛋白形成二硫键联结。该类聚合物可以用于蛋白质类药物的定点修饰，形成高转化率的均一修饰物，也可以用于蛋白质的定点标记或固定化。文档编号C08G65/48GK101724142SQ20081022463公开日2010年6月9日申请日期2008年10月22日优先权日2008年10月22日发明者张磊,翟艳琴,苏志国,赵永江,马光辉申请人:中国科学院过程工程研究所