专利名称：一种高强度多孔壳聚糖微载体的制备方法
技术领域：
本发明属于多孔材料材料制备领域，特别涉及ー种可用于贴壁性細胞的悬浮培养的高強度多孔壳聚糖微载体的制备方法。
背景技术：
微波对材料的加热属干“体加热”，不同于一般的表面加热，从理论上来说，体加热使材料能够均勻受热。微波技术已成功用于交联羧甲基壳聚糖膜，使其能够应用于创伤治疗。采用微波技术烘干壳聚糖膜，其速度比传统的空气对流加热方式快6倍。天然高分子材料是人类最早使用的医用材料，具有良好的生物相容性，几乎都可降解且降解产物无毒。组织工程支架材料中，典型的天然高分子材料有胶原蛋白、壳聚糖以及明胶、海藻酸钠等。近年来在贴壁性細胞的悬浮培养研究領域，壳聚糖支架材料的研究非常广泛。然而，其制备方法往往仅限于常用的冷冻干燥法。传统的冷冻干燥法制备出的壳聚糖支架，由于水凝胶在冷冻过程中热传导速率不同，导致冷冻速率和冷冻温度对支架的影响较大，从而使得支架的孔径在制备过程中不易控制，而且由于壳聚糖微球的界面张カ 很大，使得冻干得到的壳聚糖微载体的表面易形成ー层膜，使微载体在孔隙率、微观结构以及机械性能均难以满足贴壁性細胞的悬浮培养研究領域的要求。因此本领域迫切需要提供 ー种微观结构均勻、易成型、孔隙率较高、机械性能高的多孔壳聚糖微载体。
发明内容
本发明的目的之ー为了克服冷冻干燥制备壳聚糖微载体时孔隙率低以壳聚糖为原料制备的多孔微载体机械性能差的缺点而提供一种高强度多孔壳聚糖微载体的制备方法。即先用硅胶制孔，增加微载体表面的孔隙率，还可以形成一定的通道，再进行冷冻干燥，可加速冻干，并可以形成ー些小孔，来增强孔与孔之间的连通性，以得到孔隙率高，连通性好的微载体，并在制备过程中采用微波辐射产生热效应，使壳聚糖支架发生交联反应， 形成体型网络状结构，从而提高三维壳聚糖微载体的力学性能。本发明的技术方案
一种高强度多孔壳聚糖微载体的制备方法，以壳聚糖为原料，先采用硅胶来制孔，即按照硅胶与壳聚糖的质量比，即硅胶壳聚糖为3:1，采用高压脉冲微胶囊成型仪，在高压静电的作用下制备含有硅胶的壳聚糖微球，将含有硅胶的壳聚糖微球在多聚磷酸钠溶液中沉积证后，用蒸馏水清洗2次，再将含有硅胶的微球放入80°C的氢氧化钠溶液中浸泡1. 8h， 溶解含有硅胶的微球中的硅胶来制孔，并用去离子水清洗后进行冻干，然后对进行微波辐射处理，即可得到高強度多孔壳聚糖微载体。上述的一种高强度多孔壳聚糖微载体的制备方法，具体包括如下步骤 (1)、溶液的配制
①、配制2. 5% (W/V)壳聚糖酸溶液先量取Iml醋酸加入IOOml的容量瓶中定容，制得1% (V/V)醋酸溶液，再称取2. 5g壳聚糖，加入1% (V/V)醋酸溶液中即可；
②、配制壳聚糖硅胶的混合液
按照硅胶与壳聚糖的质量比，即硅胶壳聚糖为3:1，称取7. 5g硅胶，加入到2. 5% (W/ V)壳聚糖酸溶液中搅拌均勻即可；
③、配制4.5% (W/V)多聚磷酸钠溶液
称取4. 5g多聚磷酸钠溶于IOOml的去离子水中即可；
④、配制5.0%(W/V)氢氧化钠溶液
称取5. Og氢氧化钠溶于IOOml的去离子水中即可；
(2)、高压脉冲成球
将步骤(1)中的2. 5% (W/V)壳聚糖酸溶液和4. 5% (W/V)多聚磷酸钠溶液用高压静电微胶囊成型仪制备含有硅胶的壳聚糖微球；
高压脉冲微胶囊成型仪的參数设定为电压39-50kv，推进速度为90mm/h，脉宽为5ms， 频率为90Hz，液面距为22mm ；
将含有硅胶的壳聚糖微球在4. 5% (W/V)多聚磷酸钠溶液中浸泡证后，用去离子水清洗微球直至溶液为中性，再将其放入80°C的5. 0% (W/V)氢氧化钠溶液中浸泡1.他，溶解含有硅胶的壳聚糖微球中的硅胶来制孔后，用去离子水清洗3次，得到壳聚糖微载体；
(3)、冷冻干燥
对步骤(2)中所得的壳聚糖微载体进行冷冻干燥，最终得到多孔壳聚糖微载体；
上述的冷冻干燥过程控制
预冻温度为_45°C，预冻时间为50min ；
一次干燥的隔板温度为-25°C，时间为9h ；
二次干燥的隔板温度为7°C，时间为1. 5-2h ；
(4)、微波辐射处理
采用微波炉对步骤(3)所得的壳聚糖多孔微载体进行微波辐射，最终得到一种高强度多孔壳聚糖微载体。上述所得的高強度多孔壳聚糖微载体的粒径为400-700 pm孔径为20-60 μπι,孔隙率为93%，可用于贴壁性細胞的悬浮培养。本发明的技术效果
本发明的一种高强度多孔壳聚糖微载体的制备方法，由于采用静电自组装技术和硅胶
致孔剂相结合来制备多孔微球，得到的微球性能较好、圆整度高，粒径为400-700 |_皿。由于以硅胶来制孔，更容易克服壳聚糖微球的界面张力，使微球表面形成许多孔， 从而来制备孔隙率较高的微载体。同时，硅胶制孔后还可以形成一定的通道，能够加速冻干达到节能的效果。由于制备过程中先采用在80°C的氢氧化钠溶液中溶解壳聚糖微球中的硅胶来制大孔，可增大微球的孔隙率，然后将该多孔微球进行冷冻干燥，使冰晶升华来制备小孔，从而增强微球的连通性；这样可以克服只单独采用冷冻干燥法对微球进行制孔时，孔隙率低， 连通性差的缺点。
另外，采用微波辐射对微球进行体加热，使壳聚糖微球发生交联反应，形成体型网络状结构，从而得到高強度多孔壳聚糖微载体。因此，本发明的一种高强度多孔壳聚糖微载体的制备方法具有操作简捷，成本低， 效果好的特点。
图1是本发明所得的高強度多孔壳聚糖微载体表面的扫描电镜图片。
具体实施例方式下面结合附图与实施例对本发明进ー步说明。本发明所用的硅胶，m (Si02)-n (H2O), 200-300目，中国医药集团化学试剂有限公司；其余所有试剂均为医药纯，均来自上海国药集团；
本发明所用的扫描电镜为Quanta x50系列扫描电子显微镜(美国FEI公司)
所用的微波炉型号为WG800CTL23 __ K6的Galanz微波炉；
本发明所用的高压静电微胶囊成型仪，推进速度为l_99mm/h，上海理工大学； 其他试剂均来自上海国药集団。实施例1
一种高强度多孔壳聚糖微载体的制备方法，包括如下步骤
(1)、溶液的配制
①、配制2.5% (W/V)壳聚糖酸溶液
先量取Iml醋酸加入IOOml的容量瓶中定容，制得1% (V/V)醋酸溶液，再称取2. 5g壳聚糖，加入1% (V/V)醋酸溶液中即可；
②、配制壳聚糖硅胶的混合液
按照硅胶与壳聚糖的质量比，即硅胶壳聚糖为3:1，称取7. 5g硅胶，加入到2. 5% (W/ V)壳聚糖酸溶液中搅拌均勻即可；
③、配制4.5% (W/V)多聚磷酸钠溶液
称取4. 5g多聚磷酸钠溶于IOOml的去离子水中即可；
④、配制5.0%(W/V)氢氧化钠溶液
称取5. Og氢氧化钠溶于IOOml的去离子水中即可；
(2)、高压脉冲成球
将步骤(1)中的2. 5% (W/V)壳聚糖酸溶液和4. 5% (W/V)多聚磷酸钠溶液用高压静电微胶囊成型仪制备含有硅胶的壳聚糖微球；
高压脉冲微胶囊成型仪的參数设定为电压39-50kv，推进速度为90mm/h，脉宽为5ms， 频率为90Hz，液面距为22mm ；
将含有硅胶的壳聚糖微球在4. 5% (W/V)多聚磷酸钠溶液中浸泡证后，用去离子水清洗含有硅胶的壳聚糖微球直至溶液为中性，再将其放入80°C的5. 0% (W/V)氢氧化钠溶液中浸泡1.他，溶解含有硅胶的壳聚糖微球中的硅胶来制孔后，用去离子水清洗微球3次得到壳聚糖微载体；(3)、冷冻干燥
对步骤(2)中经去离子水清洗后所得的壳聚糖微载体进行冷冻干燥得到多孔壳聚糖微载体；
上述冷冻干燥过程控制 预冻温度为_45°C，预冻时间为50min ； 一次干燥的隔板温度为-25°C，时间为9h ； 二次干燥的隔板温度为7°C，时间为1. 5-2h ；
(4)、微波辐射处理
采用微波炉对步骤(3)所得的多孔壳聚糖微载体进行微波辐射，最终得高強度多孔壳聚糖微载体；
上述的微波辐射过程控制功率为160W，时间1. 5min。上述所得的高強度多孔壳聚糖微载体经扫描电镜进行扫描，结果见图1，从图1中
可以看出高強度多孔壳聚糖微载体的粒径为600 μιι，表面的孔径为20-60 μιι，孔隙率为 93%，孔与孔之间的连通性好。上述内容仅为本发明构思下的基本说明，而依据本发明的技术方案所作的任何等效变换，均应属于本发明的保护范围。
权利要求
1.一种高强度多孔壳聚糖微载体的制备方法，其特征在于以壳聚糖为原料以硅胶为制孔剂，采用高压脉冲微胶囊成型仪，在高压静电的作用下制备含有硅胶的壳聚糖微球，将含有硅胶的壳聚糖微球在多聚磷酸钠溶液中沉积证后，用蒸馏水清洗，再将微球放入80°C的氢氧化钠溶液中浸泡，溶解含有硅胶的壳聚糖微球中的硅胶来制孔，并用去离子水清洗后进行冻干，然后进行微波辐射处理，最终得到多孔壳聚糖微载体。
2.如权利要求1所述的ー种高强度多孔壳聚糖微载体的制备方法，其特征在于具体包括如下步骤(1)、溶液的配制①、配制2.5% (W/V)壳聚糖酸溶液先量取Iml醋酸加入IOOml的容量瓶中定容，制得1% (V/V)醋酸溶液，再称取2. 5g壳聚糖，加入1% (V/V)醋酸溶液中即可；②、配制壳聚糖硅胶的混合液按照硅胶与壳聚糖的质量比，即硅胶壳聚糖为3:1，称取7. 5g硅胶，加入到2. 5% (W/ V)壳聚糖酸溶液中搅拌均勻即可；③、配制4.5% (W/V)多聚磷酸钠溶液称取4. 5g多聚磷酸钠溶于IOOml的去离子水中即可；④、配制5.0%(W/V)氢氧化钠溶液称取5. Og氢氧化钠溶于IOOml的去离子水中即可；(2)、高压脉冲成球将步骤(1)中的2. 5% (W/V)壳聚糖酸溶液和4. 5% (W/V)多聚磷酸钠溶液用高压静电微胶囊成型仪制备含有硅胶的壳聚糖微球；高压脉冲微胶囊成型仪的參数设定为电压39-50kv，推进速度为90mm/h，脉宽为5ms， 频率为90Hz，液面距为22mm ；将含有硅胶的壳聚糖微球在4. 5% (W/V)多聚磷酸钠溶液中浸泡证后，用去离子水清洗含有硅胶的壳聚糖微球直至溶液为中性，再将其放入80°C的5. 0% (W/V)氢氧化钠溶液中浸泡1.他，溶解含有硅胶的壳聚糖微球中的硅胶来制孔后，用去离子水清洗3次得到壳聚糖微载体；(3)、冷冻干燥对步骤(2)中所得的壳聚糖微载体进行冷冻干燥，最终得到多孔壳聚糖微载体；上述的冷冻干燥过程控制预冻温度为_45°C，预冻时间为50min ；一次干燥的隔板温度为-25°C，时间为9h ；二次干燥的隔板温度为7°C，时间为1. 5-2h ；(4)、微波辐射处理采用微波炉对步骤(3)所得的壳聚糖多孔微载体进行微波辐射，最终得到一种高强度多孔壳聚糖微载体。
3.如权利要求1或2所述的ー种高强度多孔壳聚糖微载体的制备方法，其特征在于所用的壳聚糖脱乙酰度为80-91%。
4.如权利要求3所述的ー种高强度多孔壳聚糖微载体的制备方法，其特征在于微波辐射的功率为160W，时间为1. 5min。
5.如权利要求4所述的ー种高强度多孔壳聚糖微载体的制备方法，其特征在于所得的高強度多孔壳聚糖微载体粒径为400-700 μ^π ,孔径为20-60 μη，孔隙率为93%。
6.如权利要求1或2所述的ー种高强度多孔壳聚糖微载体的制备方法所得的高強度多孔壳聚糖微载体用于贴壁性細胞的悬浮培养。
全文摘要
本发明公开一种高强度多孔壳聚糖微载体的制备方法，以壳聚糖为原料，先采用硅胶来制孔，即采用高压脉冲微胶囊成型仪，在高压静电的作用下制备含有硅胶的壳聚糖微球，将含有硅胶的壳聚糖微球在多聚磷酸钠溶液中沉积5h后，用蒸馏水清洗，再将含有硅胶的壳聚糖微球放入80℃的氢氧化钠溶液中浸泡，溶解含有硅胶的壳聚糖微球中的硅胶来并用去离子水清洗后进行冻干得到多孔壳聚糖微载体，进一步进行微波辐射处理，最终得高强度多孔壳聚糖微载体。本发明的这种高强度多孔壳聚糖微载体粒径为400-700μm，孔径为20-60μm，孔隙率为93%，可用于贴壁细胞的悬浮培养。且其制备方法具有操作简捷，成本低，效果好的特点。
文档编号C08J3/24GK102558601SQ20121000055
公开日2012年7月11日 申请日期2012年1月4日 优先权日2012年1月4日
发明者刘宝林, 刘连军, 李济宁, 李琳, 韩宝三 申请人:上海理工大学