专利名称：可递送内皮抑制激素的胶原基复合角膜替代物的制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于组织工程领域，更加具体地说，涉及一种可递送内皮抑制激素的胶原分子与甲基丙烯酸甘油酯化精氨酸(Glycidyl Methacrylated Arginine, GMAA)聚合物网络复合的半互穿网络凝胶的制备方法，此多功能凝胶将组织工程与基因转染用于治疗眼科相关疾病，可作为潜在的角膜替代物。
背景技术：
全球约一千万人承受由角膜损伤导致的失明所带来的痛苦。角膜损伤一般由角膜疾病或者外界的物理、化学伤害引起，已成为世界范围内仅次于白内障的第二大致盲因素。目前，由角膜捐献者所提供的同种异体角膜移植手术是针对不可恢复性角膜损伤的一种比 较被广泛接受的治疗手段。尽管其手术成功率较高，但是大多数国家尤其是发展中国家的每年的角膜供体数量难以满足移植需要，而且对于角膜感染和角膜新生血管化严重的患者来说，角膜移植手术后的愈合情况较差，移植失败率高。鉴于此，开发能够替代同种异体角膜移植的方法，研制新型的角膜替代物显得刻不容缓。自1859年将一片玻璃植入病人眼内首次提出了人工角膜的概念至今，多种由合成材料制成的人工角膜面世并成功应用于临床试验，但人工角膜移植引发的一些晚期并发症等严重制约了其临床应用，仅适用于常规角膜移植失败的双眼角膜混浊性失明患者。时至今日，人工角膜材料仍然不能完全替代角膜组织。随着组织工程技术的兴起和材料科学的发展，国内外众多研究者开始致力于组织工程角膜的研究。其特点是生物相容性良好，可在生物体内降解，促进细胞的生长分化从而实现角膜组织的再生和自我修复。其类型主要包括①在体外构建类似于角膜组织结构的材料并移植；②将负载种子细胞的支架材料移植，支架材料在动物体内的降解过程中完成角膜组织修复；③移植可促进组织再生修复的无细胞材料三种。无论以何种方式来构建角膜替代物，其首要原则就是尽量多地复制天然生物体角膜的特性。同时，针对角膜移植手术后复杂的眼部病理环境，如何构建出一种集促进角膜组织再生修复和治疗于一身的多功能角膜替代物已成为研究工作的重点。骨髓间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells, MSCs)来源于骨髓基质，具有多向分化潜能，可以在特定的诱导条件下向成骨、神经和心肌等多种细胞分化。MSCs应用于角膜组织工程的研究日渐增多，将MSCs接种到羊膜支架材料上，体外培养后移植到角膜基质并诱导其向角膜上皮细胞分化，最终可检测到角膜上皮细胞标志物的表达。另有研究表明MSCs作为组织工程角膜种子细胞移植后，除了具有重建受损角膜组织的功能外，还有抑制炎症和角膜新生血管的功效，这使其在角膜组织工程中的应用前景十分良好。目前已有研究和报道的用于构建组织工程角膜的生物材料有羊膜、细胞外基质材料(主要包括胶原、异种脱细胞角膜基质、纤维蛋白、蚕丝蛋白等)和天然高分子材料(主要包括壳聚糖、透明质酸、海藻酸盐等)。这些材料的生物相容性良好，利于细胞的粘附和繁殖，降解产物能被机体吸收，但降解速率不可控，强度和加工性能较差。Griffith等成功制备出了一系列的胶原基聚合物互穿网络(IPN)角膜替代物，向胶原中引入的网络包括聚两性电解质、温敏性聚合物、聚乙二醇和多糖等。其中胶原/磷酸胆碱聚合物角膜替代物(Collagen/MPC)对小型猪进行了深度角膜板层移植，术后一年显示了上皮细胞的重建，伴随基质细胞的长入，且观察到角膜神经的再生。在Collagen/MPC角膜替代物用于碱烧伤后的兔子角膜移植中，此材料不仅支持角膜细胞的生长繁殖以及组织重建，还显示了其抑制角膜新生血管化的能力。正常角膜透明无血管，角膜新生血管形成是角膜化学烧伤、角膜炎、角膜移植排斥反应等疾病带来的一个难题。尽管角膜新生血管的生长有利于病原微生物的清除和组织修复，但严重影响角膜的透明性，是造成角膜移植失败的原因之一。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可递送内皮抑制激素的胶原基复合角膜替代物的制备方法和应用。该角膜替代物具备良好的力学性能、光学性能，在胶原酶中降解缓慢，且与 人眼组织有良好的生物相容性。通过在凝胶表面接种骨髓间充质干细胞(MSCs)并转染内皮抑制素基因，可将组织工程与基因转染用于眼科，制备方法简单，可以长期保存和运输。本发明的目的通过下述技术方案予以实现本发明提供一种胶原基复合角膜替代物，以胶原、GMAA为原料，以水为溶剂，以碳二亚胺(EDC)为交联剂对胶原进行交联，以光引发剂引发GMAA进行聚合反应，同时GMAA分子结构上的官能基团还可与胶原分子发生交联反应，由此将反应产物经过浇注成膜制备成胶原/GMAA半互穿聚合物网络角膜替代物。其中EDC与胶原(以胶原分子上氨基数目计，表示为Coll-NH2)的摩尔比为1:(I一 1.2) ;EDC与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的摩尔比为1:1 ;光引发剂与GMAA的摩尔比为(O. 02—0. 03) 1 ;胶原(以胶原分子上氨基数目计，表示为Coll-NH2)与GMAA的质量比为I (0. 5—1)。所述光引发剂选用I 一 [4 一(2—轻乙氧基)一亚苯基]一 2 —轻基一 2' , 2' 一二甲基乙酮(Irgacure 2959),也可选用甲基乙烯基酮、安息香。所述胶原可选用猪I型胶原，所述GMAA为甲基丙烯酸甘油化的精氨酸单体，将精氨酸分子和甲基丙烯酸甘油酯化制备而成(参考文献Jianshu Li, ZhizhangGuo, Jianyu Xin, Guanglei Zhao, Huining Xiao. 21-Arm star polymers with differentcationic groups based oncyclodextrin core for DNA delivery. CarbohydratePolymers, 2010，79，277-283.)，结构如下
权利要求
1.一种胶原基复合角膜替代物，其特征在于，以胶原、GMAA为原料，以水为溶剂，以碳二亚胺(EDC)为交联剂对胶原进行交联，以光引发剂引发GMAA进行聚合反应，同时GMAA分子结构上的官能基团还可与胶原分子发生交联反应，由此将反应产物经过浇注成膜制备成胶原/GMAA半互穿聚合物网络角膜替代物 其中EDC与胶原(以胶原分子上氨基数目计，表示为Coll-NH2)的摩尔比为1:(1一1.2) ;EDC与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的摩尔比为1:1 ;光引发剂与GMAA的摩尔比为(O. 02—0. 03) 1 ;胶原(以胶原分子上氨基数目计，表示为Coll-NH2)与GMAA的质量比为I (0. 5—1)。
2.根据权利要求1所述的一种胶原基复合角膜替代物，其特征在于，所述光引发剂选用I — [4 — (2 —轻乙氧基)一亚苯基]—2 —轻基一2' , 2' -二甲基乙丽(Irgacure2959)、甲基乙烯基酮或者安息香中的一种。
3.根据权利要求1所述的一种胶原基复合角膜替代物，其特征在于，所述胶原可选用猪I型胶原，所述GMAA为甲基丙烯酸甘油化的精氨酸单体，将精氨酸分子和甲基丙烯酸甘油酯化制备而成，结构如下
4.一种胶原基复合角膜替代物的制备方法，其特征在于，先将胶原、甲基丙烯酸甘油化的精氨酸单体、碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、光引发剂按照计量在溶剂水中混合均匀，然后调整体系PH值为5-6，将混合反应溶液浇注到模具内，再放入夹具中夹紧固定，于紫外固化箱中固化30-40min，取出后保持湿度100%的条件下，室温20-25摄氏度反应至少12h，再移入37°C的烘箱内熟化至少5h，经清洗即可得到胶原基复合角膜替代物。
5.根据权利要求4所述的一种胶原基复合角膜替代物的制备方法，其特征在于，其中碳二亚胺与胶原(以胶原分子上氨基数目计，表示为Coll-NH2)的摩尔比为1:(1 一1. 2);碳二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:1 ;光引发剂与甲基丙烯酸甘油化的精氨酸单体的摩尔比为(O. 02 — O. 03):1;胶原(以胶原分子上氨基数目计，表示为Coll-NH2)与甲基丙烯酸甘油化的精氨酸单体的质量比为1:(0. 5— I)。
6.根据权利要求4所述的一种胶原基复合角膜替代物的制备方法，其特征在于，优选调整体系pH值为5. 5。
7.根据权利要求4所述的一种胶原基复合角膜替代物的制备方法，其特征在于，待从紫外固化箱中取出后，保持湿度100%的条件下，室温20— 25摄氏度反应优选12 — 16h，再移入37°C的烘箱内熟化至少5h，然后去除夹具，打开模具取出角膜样品放入pH = 7. 4的磷酸盐缓冲液(PBS)中浸泡，每隔12h更换新鲜的PBS，清洗7天后，将样品放入含有1被％氯仿的PH = 7.4的PBS中，于4°C下保存备用。
8.可得到可递送内皮抑制激素的胶原基复合角膜替代物的制备方法，其特征在于，利用如权利要求1所述的胶原基复合角膜替代物，将其作为细胞培养基板向其表面接种骨髓间充质干细胞MSCs，待其融合率到达90%后进行由商业化转染试剂Polyjet 介导的内皮抑制素基因转染后，即可得到可递送内皮抑制激素的胶原基复合角膜替代物。
9.如权利要求1所述的胶原基复合角膜替代物在制造治疗眼科相关疾病的药物中的应用，可实现延缓替代物的降解和特定治疗因子的原位释放。
全文摘要
本发明公开一种可递送内皮抑制激素的胶原基复合角膜替代物的制备方法和应用。它由向接种在胶原/GMAA聚合物半互穿网络角膜替代物表面的MSCs转染内皮抑制素基因制备而成。此胶原基角膜替代物具有良好的生物相容性，可诱导和促进角膜再生，并随角膜再生而生物降解；该角膜替代物具备良好的力学和光学性能，且与人眼组织有良好的生物相容性，聚合物网络的引入提高角膜替代物在胶原酶中的稳定性及力学强度。通过在角膜替代物表面接种骨髓间充质干细胞(MSCs)并转染内皮抑制素基因，可在两周内持续检测到培养基中的内皮抑制素蛋白。该角膜替代物将基因转染与组织工程有效结合并用于眼科，制作方法简单，易于加工处理和长期保存及运输。
文档编号C08J3/24GK102989038SQ20121043589
公开日2013年3月27日 申请日期2012年11月5日 优先权日2012年11月5日
发明者刘文广, 刘源, 杨建海, 王宏博 申请人:天津大学