一种微流控芯片、使用其合成功能纳米颗粒的方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种微流控芯片、使用其合成功能纳米颗粒的方法及应用。所述微流控芯片按流体的流向包括第一通道、第二通道、第三通道、第四通道、第五通道、第六通道、第七通道和第八通道；所述第一通道和第二通道分别分布于所述第三通道两侧并与所述第三通道交叉于第一交叉点；所述第四通道起始于所述第一交叉点，并分叉成第五通道和第六通道；所述第五通道和第六通道分别分布于所述第七通道两侧并与所述第七通道交叉于第二交叉点；所述第八通道起始于第二交叉点，具有对流体的混合功能。本发明的微流控芯片具有集成化高、操控简便、易于控制及传质传热迅速的优点，可用于功能纳米颗粒的合成。
【专利说明】一种微流控芯片、使用其合成功能纳米颗粒的方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及微流控【技术领域】，尤其涉及一种微流控芯片、使用其合成功能纳米颗粒的方法及应用。
【背景技术】
[0002]功能纳米颗粒可以持续传递药物到特定细胞，也可作为纳米级显像剂辅助成像，具有比表面积大、生物相容性好、生物利用度高以及药物可控释放等性质，利于提高疾病治疗疗效、降低药物毒性、增强疾病检测和预后能力，在疾病诊断、治疗和预后判断等方面应用广泛。
[0003]目前常用的制备两亲性分子包裹聚合物型功能纳米颗粒的方法主要有两种:一是两步法，即通过纳米共沉淀或分子自组装分别制备核心纳米颗粒和两亲性分子组成的空泡纳米颗粒，随后通过挤出、超声、静电组装等处理产生双层两亲性分子包裹聚合物的纳米颗粒；二是一步法，即两亲性分子和聚合物分子混合，通过与水混合、震荡，使纳米共沉淀和分子自组装同时完成，形成单层两亲性分子包裹聚合物的纳米颗粒。
[0004]上述常规制备方法通常具有复杂的合成步骤和程序，从而增加了对实验条件控制的难度，因而易导致所合成的颗粒粒径不均一以及批间重复性差等问题。此外，常规合成方法需要搅拌、超声、匀质等多种仪器以及离心、过滤、层析等多种后处理步骤。总之，目前常用的几种纳米颗粒合成方法存在着不同的缺点，如步骤繁琐、反应条件不易控制、需要多种仪器以及传热传质不均匀等。
[0005]为了提升实验条件的可控性以及提高实验装置的集成性，研究人员开始使用微流控平台进行纳米颗粒的快速合成。微流控芯片可以精确操控微通道内的流体和反应条件，因此越来越多的被应用于制备结构均一、性质稳定的纳米颗粒。但是目前尚未见能够完全克服上述问题的结构合理的微流控芯片报道。
【发明内容】
[0006]针对现有技术的不足，本发明提供一种微流控芯片、使用其合成功能纳米颗粒的方法及应用。所述微流控芯片具有集成化高、操控简便、易于控制及传质传热迅速的优点；使用其合成功能纳米颗粒的方法具有条件精确可控、合成的功能纳米颗粒形貌均一、结构稳定的优点；且可通过简单地改变进样顺序、液体流速来调控功能纳米颗粒的结构和粒径。
[0007]在第一方面，本发明提供一种微流控芯片，所述微流控芯片按流体的流向包括第一通道、第二通道、第三通道、第四通道、第五通道、第六通道、第七通道和第八通道；所述第一通道和第二通道分别分布于所述第三通道两侧并与所述第三通道交叉于第一交叉点；所述第四通道起始于所述第一交叉点，并分叉成第五通道和第六通道；所述第五通道和第六通道分别分布于所述第七通道两侧并与所述第七通道交叉于第二交叉点；所述第八通道起始于第二交叉点，具有对流体的混合功能。
[0008]优选地，所述第一通道和第二通道分别有独立的入口。[0009]优选地，所述第一通道和第二通道有共同的入口。
[0010]优选地，所述第八通道呈双螺旋状、矩形波状或菱形串珠状。
[0011]优选地，所述第八通道呈“ S ”状或“ Z ”状。
[0012]优选地，所述第三通道和第七通道分别有独立的入口。
[0013]优选地，所述第八通道有唯一的独立出口。
[0014]在第二方面，本发明提供一种使用第一方面所述的微流控芯片合成功能纳米颗粒的方法，包括以下步骤:按流体的流向，向所述第一通道和第二通道通入水性液体，向所述第三通道通入高分子聚合物有机溶液，向所述第七通道通入两亲性分子有机溶液。
[0015]在第二方面，本发明还提供一种使用第一方面所述的微流控芯片合成功能纳米颗粒的方法，包括以下步骤:按流体的流向，向所述第一通道和第二通道通入水性液体，向所述第三通道通入两亲性分子有机溶液，向所述第七通道通入高分子聚合物有机溶液。
[0016]在第三方面，本发明提供一种第一方面所述的微流控芯片在合成功能纳米颗粒中的应用。
[0017]本发明的有益效果为:本发明的微流控芯片具有两级混合结构，首先第一通道、第二通道和第三通道交叉于第一交叉点，流体在此混合，其中的高分子聚合物析出形成纳米颗粒或者其中的两亲性分子自组装形成空泡；然后第五通道、第六通道和第七通道交叉于第二交叉点，流体在此混合，高分子聚合物纳米颗粒与两亲性分子相遇或者两亲性分子空泡与析出的高分子聚合物纳米颗粒相遇；最后通过具有对流体的混合功能的第八通道自组装形成核壳型纳米颗粒。所述微流控芯片具有集成化高、操控简便、易于控制及传质传热迅速的优点；使用其合成功能纳米颗粒的方法具有条件精确可控、合成的功能纳米颗粒形貌均一、结构稳定的优点；且可通过简单地改变进样顺序、液体流速来调控功能纳米颗粒的结构和粒径。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1为本发明实施例1的微流控芯片的结构示意图。
[0019]图2为本发明实施例2的微流控芯片的结构示意图。
[0020]图3为本发明实施例3的微流控芯片的结构示意图。
[0021]图4为本发明实施例4的微流控芯片的结构示意图。
[0022]图5为本发明实施例5的微流控芯片的结构示意图。
[0023]图6为本发明实施例6的微流控芯片的结构示意图。
[0024]图7为本发明试验例I制得的单层磷脂包裹的高分子聚合物纳米颗粒的透射电镜图。
[0025]图8为本发明试验例2制得的双层磷脂包裹的高分子聚合物纳米颗粒的透射电镜图。
[0026]图9为本发明试验例3制得的磷脂-AIE纳米颗粒的透射电镜图。
[0027]图10为本发明试验例4中的纳米颗粒在磷酸盐缓冲液中的颗粒粒径随时间的变
化结果。
[0028]图11本发明试验例4中的纳米颗粒在磷酸盐缓冲液中的颗粒多分散系数(PDI)随时间的变化结果。[0029]图12为本发明试验例5中纳米颗粒的粒径随溶液流速的变化结果。
[0030]图13为本发明试验例6中载药纳米颗粒对Hela细胞(左)和HUVEC细胞(右)的杀伤作用结果。
[0031]图14为本发明试验例7中荧光纳米颗粒用于细胞成像的荧光图片。
【具体实施方式】
[0032]下面通过【具体实施方式】详细描述本发明的技术方案。
[0033]微流控芯片的制作工艺是目前比较成熟的技术，本领域的技术人员可以根据其具有的专业知识选择合适的工艺实现，比如可以通过模具在基质材料上制作出有微流控通道的片层，然后将所述片层的有微流控通道的一面与底部封接基片紧密贴合即形成所述微流控芯片；或者通过刻蚀工艺在基质材料上制作出有微流控通道的片层，然后将所述片层的有微流控通道的一面与底部封接基片紧密贴合即形成所述微流控芯片；根据需要可以在合适的位置打孔，使微流控通道与外界连通即可。其中，基质材料可使用聚二甲基硅氧烷(polydimethylsi loxane, PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(polymethylmethacrylate, PMMA)或聚碳酸酯(Polycarbonate，PC)等；底部封接基片可使用玻璃、PMMA、PDMS、PC或硅片等。所述微流控芯片上的通道可通过塑料管等与注射器相连，液体流速由与注射器连接的注射泵控制。
[0034]下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，以下实施例仅为本发明的优选实施例，以便于更好地理解本发明，因而不应视为限定本发明的范围。
[0035]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂厂商购买得到的。
[0036]实施例1
[0037]如图1所示，本实施例的微流控芯片，按流体的流向包括第一通道1、第二通道2、第三通道3、第四通道4、第五通道5、第六通道6、第七通道7和第八通道8 ;所述第一通道I和第二通道2分别分布于所述第三通道3两侧并与所述第三通道3交叉于第一交叉点；所述第四通道4起始于所述第一交叉点，并分叉成第五通道5和第六通道6 ;所述第五通道5和第六通道6分别分布于所述第七通道7两侧并与所述第七通道7交叉于第二交叉点；所述第八通道8起始于第二交叉点，具有对流体的混合功能。本实施例的第一通道I和第二通道2分别有独立的入口(图中圆柱状结构)，第三通道3和第七通道7分别有独立的入口(图中圆柱状结构)，第八通道8呈双螺旋状，有唯一的独立出口(图中圆柱状结构)。
[0038]本实施例的微流控芯片可通过以下两种进样方式实现功能纳米颗粒的合成。
[0039]第一种方式:分别从第一通道I和第二通道2的入口通入水性液体，从第三通道3的入口通入高分子聚合物有机溶液，在第一通道1、第二通道2和第三通道3的交汇处，高分子聚合物析出形成纳米颗粒；从第七通道7的入口通入两亲性分子有机溶液，在第五通道
5、第六通道6和第七通道7的交汇处，高分子聚合物纳米颗粒与两亲性分子相遇，经过双螺旋状的第八通道8的均匀混合，两亲性分子自组装到高分子聚合物纳米颗粒表面，形成以高分子聚合物纳米颗粒为核心、两亲性分子层为外层的核壳型纳米颗粒。
[0040]第二种方式:分别从第一通道I和第二通道2的入口通入水性液体，从第三通道3的入口通入两亲性分子有机溶液，在第一通道1、第二通道2和第三通道3的交汇处，两亲性分子自组装形成空泡；从第七通道7的入口通入高分子聚合物有机溶液，在第五通道5、第六通道6和第七通道7的交汇处，两亲性分子空泡与析出的高分子聚合物纳米颗粒相遇，经过双螺旋通道的均匀混合，形成以高分子聚合物纳米颗粒为核心、双层两亲性分子为外层的核壳型纳米颗粒。
[0041]其中，所述水性液体比如可以是二次水、三次水、去离子水和蒸馏水等，优选三次水；所述高分子聚合物例如聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚己内酯(PCL)、聚丙烯腈(PAN)和聚羟基烷酸酯(PHA)等；所述两亲性分子包括常用的磷脂分子和表面活性剂，例如氢化大豆磷脂(HSPC)、蛋黄卵磷脂(PC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)U-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰胆碱(P0PC)、二油酰基磷脂酰胆碱(D0PC)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、二芥酰磷脂酰甘油(DEPG)、1，2-棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二芥酰基磷脂酰乙醇胺(DEPE)、二棕榈酰基磷脂酰丝氨酸(DPPS)、二油酰基磷脂酰丝氨酸(D0PS)、二肉豆蘧酰磷脂酸(DMPA)、二硬脂酰磷脂酸(DSPA)、硬脂酰溶血卵磷脂(S-LysoPC)、十八胺、吐温等，以及聚乙二醇(PEG)、生物素或荧光素等修饰的磷脂分子；所述有机溶液中的有机溶剂可以是能与水以任意比例混溶的有机溶剂，例如，甲醇、乙醇、丙酮、三氟乙醇、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、羟基丙酸、乙二醇或甘油等。
[0042]本实施例的微流控芯片可用于载药纳米颗粒的制备，将需要运载的药物与高分子聚合物溶液混合，并按照上述两种方式进行纳米颗粒的制备，从而获得核心装载药物的纳米颗粒；或者将药物与两亲性分子溶液混合，并按照上述两种方式进行纳米颗粒的制备，从而获得壳层装载药物的纳米颗粒；也可通过将不同药物分别与高分子聚合物溶液和两亲性分子溶液混合，并按照上述两种方式进行纳米颗粒的制备，从而获得同时装载不同药物的多种纳米颗粒。
[0043]其中，所述药物包括可用纳米颗粒装载的常用药物，例如阿霉素、紫杉醇、喜树碱、康普立停、长春新碱和甲氨蝶呤等。
[0044]本实施例的微流控芯片可用于成像用纳米颗粒的制备，将所需荧光分子或其它成像相关颗粒与高分子聚合物溶液或两亲性分子溶液混合，或者直接使用与荧光分子共价连接的高分子聚合物分子或两亲性分子，并按照上述两种方式进行纳米颗粒的制备，从而获得具有荧光的纳米颗粒。
[0045]其中，所述荧光分子包括常用荧光分子，例如罗丹明、DiD、DiO、DAP1、Cy3、Cy5、刚果红、尼罗红、苯并噻唑或钙黄绿素；所述成像相关颗粒包括量子点和金属纳米颗粒等用于成像的常用颗粒。
[0046]实施例2
[0047]如图2所示，本实施例的微流控芯片与实施例1的微流控芯片的差别仅在于所述第八通道8呈矩形波状，其它技术特征与实施例1的微流控芯片相同。
[0048]实施例3
[0049]如图3所示，本实施例的微流控芯片与实施例1的微流控芯片的差别仅在于所述第八通道8呈“S”状，其它技术特征与实施例1的微流控芯片相同。
[0050]实施例4[0051]如图4所示，本实施例的微流控芯片与实施例1的微流控芯片的差别仅在于所述第八通道8呈菱形串珠状，其它技术特征与实施例1的微流控芯片相同。
[0052]实施例5
[0053]如图5所示，本实施例的微流控芯片与实施例1的微流控芯片的差别仅在于所述第八通道8呈“Z”状，其它技术特征与实施例1的微流控芯片相同。
[0054]实施例6
[0055]如图6所示，本实施例的微流控芯片与实施例1的微流控芯片的差别仅在于所述第一通道I和第二通道2有共同的入口，所述第八通道8呈矩形波状，其它技术特征与实施例I的微流控芯片相同。
[0056]试验例1:单层磷脂包裹的高分子聚合物纳米颗粒的合成及表征
[0057]取45.5mg DPPC和4.8mg高纯胆固醇溶于IOmL乙醇中，振荡30min使其混匀，得磷脂溶液。取IOOmg PLGA溶于6.5mL 二甲基甲酰胺和3.5mL三氟乙醇的混合物中，振荡过夜使其混匀，得PLGA溶液。在实施例1的微流控芯片的第一通道I和第二通道2的入口处接装三次水的注射器，在第三通道3的入口处接装PLGA溶液的注射器，在第七通道7的入口处接装磷脂溶液的注射器，在第八通道8的出口处接装收集管。使用注射泵控制三次水的流速20mL/h，磷脂溶液和PLGA溶液的流速0.5mL/h，待微流控芯片中液流稳定后从第八通道8的出口收集纳米颗粒。
[0058]取10 μ L上述纳米颗粒悬浮液,滴于碳膜铜网上,静置5min后用滤纸从侧面吸去多余液体。使用2%磷钨酸染色lOmin，用滤纸吸去多余液体，干燥后使用透射电子显微镜进行观察，可见颗粒形态完好、粒径均一(图7)。
[0059]试验例2:双层磷脂包裹的高分子聚合物纳米颗粒的合成及表征
[0060]取46.4mg DSPE和8.5mg DSPE-PEG溶于IOmL甲醇中，振荡30min使其混匀，得磷脂溶液。200mg PLA溶于IOmL氯仿中，振荡过夜使其混匀，得PLA溶液。
[0061]在实施例1的微流控芯片的第一通道I和第二通道2的入口处接装三次水的注射器，在第三通道3的入口处接装磷脂溶液的注射器，在第七通道7的入口处接装PLA溶液的注射器，在第八通道8的出口处接装收集管。使用注射泵控制三次水的流速10mL/h，磷脂溶液和PLA溶液的流速0.5mL/h，待微流控芯片中液流稳定后从第八通道8的出口收集纳米颗粒。透射电镜观察，可见颗粒形态完好、粒径均一(图8)。
[0062]试验例3:磷脂-AIE纳米颗粒的合成
[0063]取38.9mg 二月桂酰磷脂酰甘油DLPG和4.8mg高纯胆固醇溶于IOmL乙醇中，振荡30min使其混匀，得到磷脂溶液。取IOOmg AIE分子(TPE-1ndo)溶于IOmL DMSO中，振荡过夜使混匀，得到TPE-1ndo溶液。
[0064]在实施例6的微流控芯片的第一通道I和第二通道2的共同入口处接装三次水的注射器，在第三通道3的入口处接装磷脂溶液的注射器，在第七通道7的入口处接装TPE-1ndo溶液的注射器，在第八通道8的出口处接装收集管。使用注射泵控制三次水的流速50mL/h，磷脂溶液和TPE-1ndo溶液的流速lmL/h，待微流控芯片中液流稳定后从第八通道8的出口收集磷脂-AIE纳米颗粒。透射电镜观察，可见颗粒形态完好、粒径均一(图9)。
[0065]试验例4:颗粒稳定性表征
[0066]取900 μ L纳米颗粒悬浮液(试验例1)，加入IOOyL的IOXPBS (配方:NaC180g/L，KC12g/L，Na2HPO4H.4g/L，KH2P042.4g/L)，使用激光粒度仪监测颗粒的粒径变化(图10)和多分散性变化(图11)。由结果可知，利用本发明所述方法制备的纳米颗粒在13天内粒径和多分散系数(PDI)均稳定；而单独由两亲性分子或高分子聚合物组成的纳米颗粒则发生了明显的聚集，粒径和多分散系数均明显增大。
[0067]试验例5:颗粒粒径调控
[0068]在实施例1的微流控芯片的第一通道I和第二通道2的入口处接装三次水的注射器，在第三通道3的入口处接装PLGA溶液的注射器，在第七通道7的入口处接装DPPC溶液的注射器，在第八通道8的出口处接装收集管。利用注射泵控制各液体的流速，使三次水的流速固定为20mL/h，PLGA溶液和DPPC溶液的流速在0.125mL/h?2mL/h范围内变化。收集不同流速下制备的纳米颗粒，利用激光粒度仪进行检测，可知随着PLGA溶液和DPPC溶液流速的增大，制备所得纳米颗粒的粒径增大(图12)。因此，可通过简单地调节溶液流速来获得粒径不同的纳米颗粒。
[0069]试验例6:载药纳米颗粒的合成
[0070]取45.5mg DPPC、4.8mg高纯胆固醇和2mg康普立停溶于IOmL乙醇中，振荡30min使其混匀，得到磷脂与药物的混合溶液。IOOmg PLGA和0.65mg阿霉素溶于6.5mL 二甲基甲酰胺和3.5mL三氟乙醇的混合物中，振荡过夜使其混匀，得到PLGA与药物的混合溶液。
[0071]在实施例2的微流控芯片的第一通道I和第二通道2的入口处接装三次水的注射器，在第三通道3的入口处接装磷脂与药物的混合溶液的注射器，在第七通道7的入口处接装PLGA与药物的混合溶液的注射器，在第八通道8的出口处接装收集管。使用注射泵控制三次水的流速20mL/h，磷脂与药物的混合溶液以及PLGA与药物的混合溶液的流速lmL/h，待微流控芯片中液流稳定后从第八通道8的出口收集纳米颗粒。
[0072]Hela细胞和HUVEC细胞与制备好的载药纳米颗粒共孵育，分别在孵育0h、3h和20h后利用激光共聚焦扫描显微镜观察细胞(图13)。由结果可知，所制备的纳米颗粒对两种细胞均有明显杀伤作用，说明本方法所制备的纳米颗粒成功包裹了康普立停和阿霉素两种药物。
[0073]试验例7:荧光纳米颗粒的合成
[0074]取46.4mg DSPE,8.5mg DSPE-PEG 和 19.2mg DiD 溶于 IOmL 甲醇中，振荡 30min 使混匀，得磷脂溶液。取200mg PLA和20mg罗丹明溶于IOmL氯仿中，振荡过夜使其混匀，得PLA溶液。
[0075]在实施例3的微流控芯片的第一通道I和第二通道2的入口处接装三次水的注射器，在第三通道3的入口处接装PLA溶液的注射器，在第七通道7的入口处接装磷脂溶液的注射器，在第八通道8的出口处接装收集管。使用注射泵控制三次水的流速25mL/h，磷脂溶液和PLA溶液的流速0.6mL/h，待微流控芯片中液流稳定后从第八通道8的出口收集荧光纳米颗粒。
[0076]制备所得荧光纳米颗粒可用于细胞的荧光标记。将上述制备所得荧光纳米颗粒与Hela细胞共孵育lh，图14显示蓝色荧光来自Hoechst33342染色的细胞核(图中A处箭头指示)，绿色荧光来自包裹在PLA核心的罗丹明(图中B处箭头指示)，红色荧光来自包裹在外层磷脂分子层中的DiD (图中C处箭头指示)。图中橙黄色荧光为绿色荧光和红色荧光重叠所得，证明本方法可实现两种荧光分子的同时包裹。[0077] 申请人:声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细特征以及详细方法，但本发明并不局限于上述详细特征以及详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细特征以及详细方法才能实施。所属【技术领域】的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明选用组分的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
【权利要求】
1.一种微流控芯片，按流体的流向包括第一通道、第二通道、第三通道、第四通道、第五通道、第六通道、第七通道和第八通道；所述第一通道和第二通道分别分布于所述第三通道两侧并与所述第三通道交叉于第一交叉点；所述第四通道起始于所述第一交叉点，并分叉成第五通道和第六通道；所述第五通道和第六通道分别分布于所述第七通道两侧并与所述第七通道交叉于第二交叉点；所述第八通道起始于第二交叉点，具有对流体的混合功能。
2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述第一通道和第二通道分别有独立的入口。
3.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述第一通道和第二通道有共同的入口。
4.根据权利要求1-3任一项所述的微流控芯片，其特征在于，所述第八通道呈双螺旋状、矩形波状或菱形串珠状。
5.根据权利要求1-3任一项所述的微流控芯片，其特征在于，所述第八通道呈“S”状或
6.根据权利要求1-5任一项所述的微流控芯片，其特征在于，所述第三通道和第七通道分别有独立的入口。
7.根据权利要求1-6任一项所述的微流控芯片，其特征在于，所述第八通道有唯一的独立出口。
8.一种使用权利要求1-7任一项所述的微流控芯片合成功能纳米颗粒的方法，包括以下步骤:按流体的流向，向所述第一通道和第二通道通入水性液体，向所述第三通道通入高分子聚合物有机溶液，向所述第七通道通入两亲性分子有机溶液。
9.一种使用权利要求1-7任一项所述的微流控芯片合成功能纳米颗粒的方法，包括以下步骤:按流体的流向，向所述第一通道和第二通道通入水性液体，向所述第三通道通入两亲性分子有机溶液，向所述第七通道通入高分子聚合物有机溶液。
10.权利要求1-7任一项所述的微流控芯片在合成功能纳米颗粒中的应用。
【文档编号】C08L67/04GK103878039SQ201410114187
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年3月25日 优先权日:2014年3月25日
【发明者】蒋兴宇, 张璐, 孙佳姝 申请人:国家纳米科学中心