一株木霉菌及其在合成金纳米颗粒中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一株木霉菌及其在合成金纳米颗粒中的应用，属于微生物技术领域。
技术背景
[0002]金纳米颗粒由于具有高度的稳定性和独特的光、电、光热等性能，在生物技术、电气、医学和农业等领域具有广泛的应用前景。传统物理合成方法能耗高、设备复杂，化学合成方法使用的封端剂和有机溶剂对环境造成负面的影响。生物法合成的金纳米颗粒绿色无毒、环境友好，且微生物资源广泛，日渐成为纳米生物技术领域的关注热点。
[0003]目前已有关于细菌、放线菌、真菌及酵母菌合成金纳米颗粒的报道，早在1980年，Beveridge等人就利用subtil is 168在细胞壁上合成金纳米颗粒；Ahmad等人利用放线菌Thermomonospora sp.合成平均粒径在8 nm左右的金纳米颗粒；同时有研宄发现真菌crassa能够还原Au 3+，在细胞内外形成尺寸外形较为均一的金纳米颗粒；酵母菌Candida讲i77ier?o/?￡/ii能够合成分散性良好的近球状金纳米颗粒。
[0004]在微生物合成金纳米颗粒的报道中，真菌因能耐受更高浓度的金属离子，并且可以分泌大量与合成纳米颗粒相关的胞外酶、多肽类物质及次级代谢产物，可以将可溶性金属离子还原成纳米颗粒，合成的纳米颗粒产量高且易与真菌分离。此外，真菌菌体表面有大量的阳离子吸附位点，因此对金属离子有很好的吸附还原作用。相比于其它微生物，真菌合成的金纳米颗粒产量大、尺寸较为均一、分散性好、易于分离，奠定了其在金纳米颗粒合成及应用方面的基础。
[0005]与其他真菌相比，Trichoderma^以分泌多种胞外酶和代谢物，如纤维素酶，葡糖苷酶，β葡糖苷酶，β_1，3-葡糖苷酶和蛋白质等，并且其产量更大，因此常被用于工业生产。目前已有较多研宄报道rricAoiferaa具有胞外合成纳米颗粒的能力。美国的一项专利保护了 Trichodenm reesei胞外合成纳米颗粒的能力，其生成的纳米颗粒粒径为5_50nm。Mukherjee等人利用Trichoderma應胞外合成粒径为13_18nm的银纳米颗粒。同时，Mohammed-Fayaz等人也发现Trichoderma Kir1fe可以胞外合成粒径为2_4nm的银纳米颗粒和银胶质。目前报道的多为合成银纳米颗粒，仅有一篇文献报道了可以合成金纳米颗粒，Aradhana Mishra 等人利用 Trichoderma viride的无细胞提取物作用氯金酸，在30°C下，仅1min就合成了金纳米颗粒。本研宄中，菌株Trichoderma sp.WL-Go的发现将为真菌合成金纳米颗粒领域提供一株性能优良的微生物资源。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一株菌资源及其在合成金纳米颗粒方面的应用，该菌株可以催化氯金酸合成不同形态的金纳米颗粒，在绿色合成纳米金领域具有重要的应用价值。
[0007]本发明所涉及一株木霉菌株(拉丁文分类命名为sp.)，所述菌株的登记入册编号为CGMCC N0.10456，保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏日期为2015年Ol月28日。
[0008]该菌株WL-Go属于真菌，菌丝形态为管状细丝，分枝丰茂，孢子形态呈两端钝圆形。经26S rRNA基因序列测定，其与Trichodenm实有100%的相似性，因此该菌分类命名为 Trichoderma sp.。其 26S rRNA 基因序列的 GenBank 登录号为 KP676894。
[0009]该菌株分离于本实验室反应器中的活性污泥样品，所述菌株的液体培养基为加入0.05 8/1四环素和0.05 g/L 土霉素的改良马丁培养基，所述改良马丁培养基的组成为:葡萄糖 10 g/L, (NH4)2SO4 I g/L,MgSO4 0.5 g/L,K2HPO4 I g/L,pH 6~7 ;该菌株的固体培养基为对应的液体培养基中加入2%琼脂，液体培养基或固体培养基在115°C湿热灭菌20 min后使用，菌株在30°C，150 rpm条件下培养2~3天。
[0010]所述菌株可催化氯金酸合成球形、多边形、三角形等不同形态的金纳米颗粒。在一定范围内，合成的金纳米颗粒的量随菌体浓度以及氯金酸浓度的增大而增加。
[0011]本发明的有益效果是:一株从本实验室反应器的活性污泥样品中分离得到的木霉菌株WL-Go，具有较好的合成金纳米颗粒的能力。该菌株可催化氯金酸合成球形、多边形、三角形等不同形态的金纳米颗粒。且在一定范围内，合成的金纳米颗粒的量随菌体浓度以及氯金酸浓度的增大而增加。说明该菌在微生物合成金纳米颗粒领域具有一定的应用价值，该菌株为绿色合成金纳米颗粒提供了一株性能优良的菌资源。
【附图说明】
[0012]图1菌株WL-Go扫描电镜图片。
[0013]图2菌株WL-Go的系统发育树。
[0014]图3菌株WL-Go在改良马丁培养基中的生长曲线。
[0015]图4不同氯金酸浓度下菌株WL-Go合成金纳米颗粒紫外全波扫描图。
[0016]图5不同氯金酸浓度下菌株WL-Go合成金纳米颗粒的透射电镜表征。
[0017]图6不同菌体浓度下菌株WL-Go合成金纳米颗粒紫外全波扫描图。
[0018]图7不同菌体浓度下菌株WL-Go合成金纳米颗粒的透射电镜表征。
【具体实施方式】
[0019]实施例1:菌株的获得
木霉菌WL-Go于2014年将本实验室反应器中的污泥样品在加入四环素0.05 g/L、土霉素 0.05 g/L 的改良马丁培养基(葡萄糖 10 g/L、(NH4)2SO4 I g/L,K2HPO4 I g/L、MgSO4.7H20 0.5 g/L,pH 6-7)的平板上进行反复的稀释涂布，并利用上述加入四环素0.05 g/L、土霉素0.05 g/L的改良马丁培养基于30°C，150 rpm条件下培养菌液，最终获得纯菌，命名为WL-Go。对菌株进行扫描电镜观察，方法是:(I)从WL-Go菌液中取菌球2个，将球体搅碎，用0.1 mol/L的PBS缓冲液(pH 7.0)漂洗2次，4°C，8000 rpm离心10 min，弃上清，收集菌体。(2)用5%戊二醛溶液将菌液悬起，4°C过夜固定。然后4°C，8000 rpm离心10min，弃上清，收集菌体。(3)用30、50、70、90、95、100%乙醇对样品进行梯度脱水，每个梯度15min。(4)自然干燥后，在扫描电子显微镜下观察样品。菌株WL-Go的菌丝形态为管状细丝，分枝丰茂，如图1中左侧图片所示，孢子形态呈两端钝圆形，大小为I ym左右，如图1中右侧图片所示。
[0020]该菌株于2015年01月28日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研宄所，100101)，其保藏号为:CGMCC N0.10456。
[0021]实施例2:菌株的26S rRNA分子鉴定
提取菌株WL-Go的基因组DNA，通过PCR扩增26S rRNA基因序列，利用BLAST程序对序列进行同源对比，得到与其最相近的菌种为木霉菌iTrichodermd)，26S rRNA基因序列相似性为100%，因此判定菌株WL-Go为木霉菌。图2为菌株WL-Go的26S rRNA基因的系统发育树，菌株WL-Go的26S rRNA基因序列如