本发明属于病毒抗体制备技术领域，尤其涉及一种水稻矮缩病毒抗体的制备方法。
背景技术：
南方水稻黑条矮缩病于2001年在广东省阳江市首次发现，随后几年间逐渐向邻近省份扩散。2009年，在中国南方9个省份大面积暴发，受灾面积约30万hm2，同年该病在越南北部19个省份普遍发生。2010年，中国南方13个省份超过130万hm2水稻受害，同期越南中部和北方29个省份约6万hm2水稻受害。2010年在日本九州也发现该病的发生。此外，该病不仅可以危害水稻，还可以危害玉米，2009年在山东、广东、广西和海南等省的玉米上也检测到该病害，给玉米造成植株矮缩和穗不育。因此，SRBSDV引起的水稻病害已成为我国南方稻区的重要病毒病之一。
水稻病毒病主要由介体昆虫传播，且一经发生即无药可治，因此对田间介体昆虫的防治及带毒情况监测至关重要。所以，急需建立SRBSDV的大批量快速检测方法用于田间白背飞虱带毒率的检测。
技术实现要素：
本发明就是针对上述问题，提供一种解决了大分子目的蛋白通常不易诱导问题的水稻矮缩病毒抗体的制备方法。
为实现上述目的，本发明包括以下步骤。
1）阳性菌株按1:100接种于两管含氨苄青霉素和氯霉素的LB液体培养基中，摇菌3-4h，诱导培养4-5h，另一试管中不添加IPTG作为对照；取菌液并收集菌体，经凝胶电泳分离后置于考马斯亮蓝染色液。
2）诱导100ml菌液，收集菌体，目的蛋白经凝胶电泳，电泳后的凝胶经KCL预冷处理得到乳白色蛋白条带，将目的蛋白条带用刀片切割回收，加入弗氏佐剂研磨至乳化状，保存备用。
3）提取SRBSDV侵染的水稻病株和健康水稻植株总蛋白，经凝胶电泳分离后转印到PVDF膜上，室温摇床上封闭1h后，用PBST洗三遍；将PVDF膜置于1:1000稀释的P6抗血清中孵育；再用PBST洗三遍后，放入1:30000稀释的抗体中孵育1h；将PVDF膜用PBST洗三遍后放入显色液中避光显色。
4）取无毒白背飞虱飞虱若虫在SRBSDV侵染的水稻病株上饲毒2d，随后转到健康水稻上饲养；以荧光抗体和染料孵育1h。
作为一种优选方案，本发明所述步骤1）阳性菌株按1:100接种于两管含氨苄青霉素和氯霉素的LB液体培养基中，置于37℃条件下230rpm摇菌3-4h，置于28℃条件下230rpm诱导培养4-5h，另一试管中不添加IPTG作为对照；取1mL菌液并收集菌体，经12%SDS-PAGE凝胶电泳分离后置于考马斯亮蓝染色液。
作为另一种优选方案，本发明所述步骤2）诱导100ml菌液，收集菌体，目的蛋白经12%SDS-PAGE凝胶电泳，电泳后的凝胶经0.1mol/L的KCL预冷处理3-4min得到乳白色蛋白条带，将目的蛋白条带用刀片切割回收，加入弗氏佐剂研磨至乳化状，-20℃保存备用。
另外，本发明所述步骤3）提取SRBSDV侵染的水稻病株和健康水稻植株总蛋白，经12%SDS-PAGE凝胶电泳分离后转印到PVDF膜上，3%BSA室温摇床上封闭1h后，用PBST洗三遍；将PVDF膜置于1:1000稀释的P6抗血清中37℃孵育1h；再用PBST洗三遍后，放入1:30000稀释的anti-rabbitIgG-AP抗体中37℃孵育1h；将PVDF膜用PBST洗三遍后放入BCIP/NBT显色液中避光显色。
4）取200头1-2龄的无毒白背飞虱飞虱若虫在SRBSDV侵染的水稻病株上饲毒2d，随后转到健康水稻上饲养；以荧光抗体P6-FITC、P9-1-rhodamine和Actin染料phalloidin–Alexa孵育1h。
本发明有益效果。
本发明针对SRBSDV侵染后复制过程中必需的P6蛋白，通过原核表达65P6蛋白N端部分氨基酸制备了P6的多克隆抗体，通过免疫荧光标记方法检测P6在白背飞虱体内的分布，建立了大批量快速准确检测介体白背飞虱带毒率的方法，为南方水稻黑条矮缩病的田间监测和预测预报奠定了基础。
本发明以原核表达P6蛋白N端氨基酸片段所制备的P6抗体，可用于Westernblot实验检测SRBSDV侵染水稻产生的P6蛋白以及免疫荧光标记检测昆虫体内的病毒蛋白，表明P6抗体可作为SRBSDV检测的特异性抗体，同时表明通过原核表达目的蛋白的小片段即可作为抗原用于制备蛋白的多克隆抗体，解决了大分子目的蛋白通常不易诱导表达的技术瓶颈。
具体实施方式
本发明包括以下步骤。
1）阳性菌株按1:100接种于两管含氨苄青霉素和氯霉素的LB液体培养基中，摇菌3-4h，诱导培养4-5h，另一试管中不添加IPTG作为对照；取菌液并收集菌体，经凝胶电泳分离后置于考马斯亮蓝染色液。
2）诱导100ml菌液，收集菌体，目的蛋白经凝胶电泳，电泳后的凝胶经KCL预冷处理得到乳白色蛋白条带，将目的蛋白条带用刀片切割回收，加入弗氏佐剂研磨至乳化状，保存备用。
3）提取SRBSDV侵染的水稻病株和健康水稻植株总蛋白，经凝胶电泳分离后转印到PVDF膜上，室温摇床上封闭1h后，用PBST洗三遍；将PVDF膜置于1:1000稀释的P6抗血清中孵育；再用PBST洗三遍后，放入1:30000稀释的抗体中孵育1h；将PVDF膜用PBST洗三遍后放入显色液中避光显色。
4）取无毒白背飞虱飞虱若虫在SRBSDV侵染的水稻病株上饲毒2d，随后转到健康水稻上饲养；以荧光抗体和染料孵育1h。
所述步骤1）阳性菌株按1:100接种于两管含氨苄青霉素和氯霉素的LB液体培养基中，置于37℃条件下230rpm摇菌3-4h，置于28℃条件下230rpm诱导培养4-5h，另一试管中不添加IPTG作为对照；取1mL菌液并收集菌体，经12%SDS-PAGE凝胶电泳分离后置于考马斯亮蓝染色液。
所述步骤2）诱导100ml菌液，收集菌体，目的蛋白经12%SDS-PAGE凝胶电泳，电泳后的凝胶经0.1mol/L的KCL预冷处理3-4min得到乳白色蛋白条带，将目的蛋白条带用刀片切割回收，加入弗氏佐剂研磨至乳化状，-20℃保存备用。
所述步骤3）提取SRBSDV侵染的水稻病株和健康水稻植株总蛋白，经12%SDS-PAGE凝胶电泳分离后转印到PVDF膜上，3%BSA室温摇床上封闭1h后，用PBST洗三遍；将PVDF膜置于1:1000稀释的P6抗血清中37℃孵育1h；再用PBST洗三遍后，放入1:30000稀释的anti-rabbitIgG-AP抗体中37℃孵育1h；将PVDF膜用PBST洗三遍后放入BCIP/NBT显色液中避光显色。
4）取200头1-2龄的无毒白背飞虱飞虱若虫在SRBSDV侵染的水稻病株上饲毒2d，随后转到健康水稻上饲养；以荧光抗体P6-FITC、P9-1-rhodamine和Actin染料phalloidin–Alexa孵育1h。
以提取的SRBSDV水稻病株总RNA为模板，经RT-PCR扩增获得SRBSDVP6基因开放阅读框N端bp片段。目的基因片段与pDONR221进行BP重组反应获得中间载体pDONR221-P6，中间载体再与pDEST17载体进行LR重组反应获得表达载体pDEST17-P6，经PCR和测序鉴定表明已获得P6蛋白的原核表达载体。
为了检测通过原核表达蛋白免疫注射兔子所获得多克隆抗体的特异性，以SRBSDV侵染的水稻和健康水稻总蛋白为样品，经12%的SDS-PAGE凝胶电泳后，用P6抗血清为一抗进行Westernblot检测。结果显示P6抗血清能特异性识别SRBSDV侵染水稻病株中的kDa蛋白，与预测的P6蛋白大小相符，而在健康水稻中未检测到对应条带。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明所提交的权利要求书确定的保护范围。