本发明涉及兽用生物制品技术领域，具体涉及一种鸡包涵体肝炎卵黄抗体及其用于制备鸡包涵体肝炎治疗药物的应用。
背景技术：
鸡包涵体肝炎(IBH)是由禽腺病毒I群中某些血清型所引起的一种急性传染病。该病多发于3～6周龄的肉鸡，也可偶发于20周龄内的后备蛋鸡或种鸡，无性别差异，在更大龄的肉鸡也很少发生。各种品系肉鸡对本病都易感，其他禽类如火鸡、鹅、雉鸡等也有发病的报道。临床上以突发性死亡率增加，贫血和出血性包涵体肝炎为主要特征。本病的感染途径主要是呼吸道、消化道及眼结膜等，可经机械方式和被带毒粪便污染的器具而在鸡群间、鸡场间迅速传播。国内曾经在非SPF鸡胚传代的疫苗生产用毒种中检测到禽腺病毒的污染，如果污染的疫苗曾经推广使用，可能会引起此病的广泛传播。越来越多的研究表明，包涵体肝炎的发生与某些免疫抑制病有关，常与引起禽类呼吸道疾病的病原微生物混合感染，随着家禽养殖规模的逐渐扩大，该病的危害也更加严重，对该病的防控现已成为国际禽病研究的热点。
由于腺病毒的血清型众多，且各血清型的致病力不同，因此通过疫苗免疫难以保证安全性和有效性，至今尚无有效疫苗可供使用。近年来，在腺病毒所引发疾病的治疗中，卵黄抗体展现出了一定的技术优势。首先，由于分泌卵黄抗体的免疫应答反应发生于被治疗动物体体外，因此安全性较高；此外，卵黄抗体是在机体在抗原刺激下自然生成的混合抗体，因此免疫覆盖范围较大，可应对的抗原血清型相对广泛；另外其产生机理是当机体受到外来抗原刺激后B细胞分化成为浆细胞，分泌特异性抗体进入血液循环，当血液流经卵巢时，特异性抗体在卵细胞中逐渐蓄积，形成卵黄抗体，由于IgG移行进入卵细胞是受体作用的结果，因而IgG可在卵细胞中大量蓄积，浓度高于血液中的IgG，单个卵黄(约15ml)中卵黄抗体含量可高达200mg左右。
基于上述技术优势，鸡包涵体肝炎卵黄抗体的开发受到了广泛的重视，然而，由于鸡包涵体肝炎卵黄抗体的抗原——禽腺病毒I群具有众多血清型，且各血清型致病力不同，因此采用何种抗原执行免疫才能获得有效范围较广的卵黄抗体，成为根本性技术问题。而且，即便知晓了致病性抗原的物质基础，采用何种免疫模式、怎样的抗体收集时机以及具体抗体纯化方法，都会对抗体产量、免疫效力产生影响。
技术实现要素：
本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种鸡包涵体肝炎卵黄抗体，以解决现有技术中针对腺病毒所引起的鸡包涵体肝炎的卵黄抗体，其免疫效力较低的技术问题。
本发明要解决的另一技术问题是现有技术中针对腺病毒所引起的鸡包涵体肝炎的卵黄抗体，其所能应对的抗原血清型较为局限。
本发明要解决的再一技术问题是本发明所提供的制备方法中，所得卵黄抗体效价较低。
本发明同时提供了上述卵黄抗体用于制备鸡包涵体肝炎治疗药物的应用，以解决现有技术中卵黄抗体法治疗腺病毒所引起的鸡包涵体肝炎，其疗效不佳的技术问题。
为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
一种鸡包涵体肝炎卵黄抗体，是由以下方法制备的：
1)以腺病毒AV208株、AV209株、AV211株为抗原制备多价疫苗；
2)首免：取120日龄蛋鸡，每只胸部肌肉注射1.5～2.5ml步骤1)所得的多价疫苗；
3)二免：首免10日后，每只胸部肌肉注射1.5～2.5ml步骤1)所得的多价疫苗；
4)三免：二免10日后，每只胸部肌肉注射1.5～2.5ml步骤1)所得的多价疫苗；
5)三免7日后，收集所述蛋鸡所产的鸡卵，制备卵黄抗体。
作为优选，步骤5)所述鸡卵的抗体效价不低于1:256。
作为优选，步骤1)具体包括以下操作：
A)取7日龄SPF鸡胚，接种毒价为104.0ELD50的腺病毒AV208株病毒液0.2mL，取从接种开始48～120h范围内死亡的鸡胚，收集尿囊液灭活，即得到腺病毒AV208株灭活病毒液；
B)取7日龄SPF鸡胚，接种毒价为104.0ELD50的腺病毒AV209株病毒液0.2mL，取从接种开始48～120h范围内死亡的鸡胚，收集尿囊液灭活，即得到腺病毒AV208株灭活病毒液；
C)取7日龄SPF鸡胚，接种毒价为104.0ELD50的腺病毒AV211株病毒液0.2mL，取从接种开始48～120h范围内死亡的鸡胚，收集尿囊液灭活，即得到腺病毒AV208株灭活病毒液；
D)分别取所述腺病毒AV208株灭活病毒液、腺病毒AV208株灭活病毒液、腺病毒AV208株灭活病毒液以(0.8～1.2):(0.8～1.2):(0.8～1.2)的体积比混合，得到疫苗水相；
E)取白油灭菌，加入硫柳汞，得到疫苗油相，而后对所述疫苗油相在2000～3000r/min搅拌条件下加入步骤D)所得的疫苗水相，而后以8000～12000r/min的转速乳化12～18min，即得到所述多价疫苗；其中所述疫苗油相与疫苗水相的体积比为(0.8～1.2):(0.8～1.2)；硫柳汞的用量为所述多价疫苗中硫柳汞的含量为0.002～0.008％(w/w)。
作为优选，步骤A)中或步骤B)或步骤C)中收集尿囊液后，先浓缩8～12倍，再加入甲醛灭活。
作为优选，步骤5)所述的制备卵黄抗体，具体包括以下操作：
α)收集所述蛋鸡所产的鸡卵，取卵黄液加水稀释后于62～68℃加热25～35min，加入6倍体积的酸化水；
β)于1～4℃条件静置2～5h，而后固液分离取上清，加入正辛酸至终浓度为0.2～0.4％(v/v)，于室温条件静置5～12h，即得到粗产物；
γ)取步骤β)所得的粗产物，先后经澄清处理、过滤除菌、超滤浓缩，而后加入甲醛至终浓度为0.2％(w/v)，即得到所述鸡包涵体肝炎卵黄抗体。
作为优选，步骤β)所述的固液分离是以14000r/min的转速离心。
作为优选，步骤γ)所述的澄清处理是以0.45μm孔径的滤器过滤。
作为优选，步骤γ)所述超滤浓缩的截留分子量是100KD。
作为优选，步骤α)所述加水稀释，水的加入量与卵黄液等体积。
作为优选，步骤γ)所述过滤除菌的过滤孔径是0.22μm。
作为优选，所述鸡包涵体肝炎卵黄抗体的效价不低于1:32。
作为优选，步骤γ)加入甲醛后，室温放置24小时，期间振摇4～6次，即得到所述鸡包涵体肝炎卵黄抗体。
同时，本发明还提供了一种上述鸡包涵体肝炎卵黄抗体用于制备鸡包涵体肝炎治疗药物的应用。
作为优选，所述药物是胸肌注射药物，单次注射剂量为2mL。
在以上技术方案中，步骤5)中以鸡卵为原料制备卵黄抗体的具体方法，可以依照本领域的常规方法执行，也就是说，依照本领域中常规的卵黄抗体制备方法进行制备，即可达到本发明的技术效果。当然，采用本发明上述优选技术方案中所披露的卵黄抗体制备方法完成本发明，有助于提升抗体效价和产物收率，能够起到更优的技术效果。
本发明提供了一种鸡包涵体肝炎卵黄抗体及其用于制备鸡包涵体肝炎治疗药物的应用，该技术方案以扩大免疫治疗效果为目的优选了实施免疫刺激的抗原类别，创新性的采用AV208、AV209和AV211三株病毒作为抗原物质，先制备多价疫苗，利用其刺激抗体的产生。在此基础上，为了获得更好的抗体效价，本发明设计了特定的免疫方式和抗体收集时间，并采用了温和的抗体纯化手段，所得产物具有较高的抗体效价。疗效验证试验表明，本发明所得的卵黄抗体虽仅以3种血清型腺病毒毒株作为抗原，却对鸡包涵体肝炎具有普遍的防治效果，这不仅得益于高效的制备手段，更有赖于对鸡包涵体肝炎各抗原物质及其致病能力的分析研究。
在产品用途层面，本发明所制备的卵黄抗体可预防和治疗由腺病毒所引起的包涵体肝炎。其疗效确切，血清型有效范围广，同时优选的给药方式及给药剂量有助于提升防治效果。
具体实施方式
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
实施例1
一种鸡包涵体肝炎卵黄抗体，是由以下方法制备的：
1、水相的制备
用灭菌生理盐水10倍分别稀释AV208、AV209和AV211病毒液，分别取7日龄SPF鸡胚10枚，每胚接种0.2ml(104.0ELD50)，孵育7日，24小时以前死亡的鸡胚弃去不计，在48～120小时死亡的鸡胚随时取出，收获尿囊液。3个毒株的尿囊液分别浓缩10倍后，加入甲醛灭活。3个毒株的配比为1:1:1，制备成水相。
2、疫苗的制备
将白油10号高压灭菌后，水相与油相乳化比例为1:1(V/V)，加入终浓度硫柳汞0.005％，先将油相导入胶体磨，2500r/min搅拌，缓慢加入水相，加完后10000r/min乳化15分钟。充分振荡混匀。
3、免疫
1)首免：120日龄蛋鸡100只，每只胸部肌肉注射2ml；
2)二免：首免10日后进行二免，每只胸部肌肉注射2ml；
3)三免：二免后10日后进行三免，每只胸部肌肉注射2ml；
4、鸡蛋抗体检测
三免后7天，开始收集鸡蛋，当鸡蛋抗体效价达到1:256，开始制备卵黄抗体。
鸡蛋检测方法：每组鸡蛋中选择6～8枚，洗净后在1‰的新洁尔灭中消毒。于无菌条件下打开蛋壳，用蛋黄蛋清分离器使蛋清蛋黄分离，用无菌注射器吸取蛋黄液用于琼扩测定效价。
5、卵黄抗体的制备
卵黄抗体制备方法：将分离的蛋黄搅拌成均匀膏状，加入等体积注射用水，搅拌均匀后，65℃加热灭活30分钟。加入6倍量酸化水，重复3组。将各组降温至1～4℃。4℃静置2～5小时，14000转离心取上清。加入正辛酸终浓度为0.3％，室温放置5～12小时。卵黄液用孔径为0.45μm滤器过滤澄清，再用0.22μm滤器过滤除菌。经截留分子量为100KD超滤膜堆进行浓缩。加入终浓度为0.2％甲醛溶液，室温放置24小时，期间振摇4～6次。卵黄抗体效价达到1:32以上，为合格。
6、应用
1000只28日龄肉鸡发生包涵体肝炎疫情，使用上述方法制备的鸡包涵体肝炎卵黄抗体，胸肌注射，2ml/只。疫情得到控制，治愈率达到90％。
实施例2(实施例1所制备的卵黄抗体用于治疗包涵体肝炎的疗效实验)
1000只25日龄肉鸡发生包涵体肝炎疫情(有新城疫、大肠杆菌混合感染情况)，使用鸡包涵体肝炎卵黄抗体，胸肌注射，2ml/只。疫情得到有效控制，治愈率达到93％，直到出栏并未发生大肠杆菌病等继发症。
实施例3(实施例1所制备的卵黄抗体用于预防包涵体肝炎的疗效实验)
在包涵体肝炎发生的鸡场选取2群暂未发病的鸡群(共2000只，20日龄)进行紧急预防，胸肌注射，2ml/只。鸡场疫情得到控制后，此2000只肉鸡并未发生包涵体肝炎感染或是混合感染，预防保护率达到了100％。
实施例4
一种鸡包涵体肝炎卵黄抗体，是由以下方法制备的：
1)以腺病毒AV208株、AV209株、AV211株为抗原制备多价疫苗；
2)首免：取120日龄蛋鸡，每只胸部肌肉注射1.5ml步骤1)所得的多价疫苗；
3)二免：首免10日后，每只胸部肌肉注射1.5ml步骤1)所得的多价疫苗；
4)三免：二免10日后，每只胸部肌肉注射1.5ml步骤1)所得的多价疫苗；
5)三免7日后，收集所述蛋鸡所产的鸡卵，制备卵黄抗体。
在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
步骤5)所述鸡卵的抗体效价为1:256。
步骤1)具体包括以下操作：
A)取7日龄SPF鸡胚，接种毒价为104.0ELD50的腺病毒AV208株病毒液0.2mL，取从接种开始48h范围内死亡的鸡胚，收集尿囊液灭活，即得到腺病毒AV208株灭活病毒液；
B)取7日龄SPF鸡胚，接种毒价为104.0ELD50的腺病毒AV209株病毒液0.2mL，取从接种开始48h范围内死亡的鸡胚，收集尿囊液灭活，即得到腺病毒AV208株灭活病毒液；
C)取7日龄SPF鸡胚，接种毒价为104.0ELD50的腺病毒AV211株病毒液0.2mL，取从接种开始48h范围内死亡的鸡胚，收集尿囊液灭活，即得到腺病毒AV208株灭活病毒液；
D)分别取所述腺病毒AV208株灭活病毒液、腺病毒AV208株灭活病毒液、腺病毒AV208株灭活病毒液以2:3:2的体积比混合，得到疫苗水相；
E)取白油灭菌，加入硫柳汞，得到疫苗油相，而后对所述疫苗油相在2000r/min搅拌条件下加入步骤D)所得的疫苗水相，而后以8000r/min的转速乳化12min，即得到所述多价疫苗；其中所述疫苗油相与疫苗水相的体积比为2:3；硫柳汞的用量为所述多价疫苗中硫柳汞的含量为0.002％(w/w)。
步骤A)中或步骤B)或步骤C)中收集尿囊液后，先浓缩8倍，再加入甲醛灭活。
步骤5)所述的制备卵黄抗体，具体包括以下操作：
α)收集所述蛋鸡所产的鸡卵，取卵黄液加水稀释后于62℃加热25min，加入6倍体积的酸化水；
β)于1℃条件静置2h，而后固液分离取上清，加入正辛酸至终浓度为0.2％(v/v)，于室温条件静置5h，即得到粗产物；
γ)取步骤β)所得的粗产物，先后经澄清处理、过滤除菌、超滤浓缩，而后加入甲醛至终浓度为0.2％(w/v)，即得到所述鸡包涵体肝炎卵黄抗体。
步骤β)所述的固液分离是以14000r/min的转速离心。
步骤γ)所述的澄清处理是以0.45μm孔径的滤器过滤。
步骤γ)所述超滤浓缩的截留分子量是100KD。
实施例5
一种鸡包涵体肝炎卵黄抗体，是由以下方法制备的：
1)以腺病毒AV208株、AV209株、AV211株为抗原制备多价疫苗；
2)首免：取120日龄蛋鸡，每只胸部肌肉注射2.5ml步骤1)所得的多价疫苗；
3)二免：首免10日后，每只胸部肌肉注射2.5ml步骤1)所得的多价疫苗；
4)三免：二免10日后，每只胸部肌肉注射2.5ml步骤1)所得的多价疫苗；
5)三免7日后，收集所述蛋鸡所产的鸡卵，制备卵黄抗体。
在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
步骤1)具体包括以下操作：
A)取7日龄SPF鸡胚，接种毒价为104.0ELD50的腺病毒AV208株病毒液0.2mL，取从接种开始120h范围内死亡的鸡胚，收集尿囊液灭活，即得到腺病毒AV208株灭活病毒液；
B)取7日龄SPF鸡胚，接种毒价为104.0ELD50的腺病毒AV209株病毒液0.2mL，取从接种开始120h范围内死亡的鸡胚，收集尿囊液灭活，即得到腺病毒AV208株灭活病毒液；
C)取7日龄SPF鸡胚，接种毒价为104.0ELD50的腺病毒AV211株病毒液0.2mL，取从接种开始120h范围内死亡的鸡胚，收集尿囊液灭活，即得到腺病毒AV208株灭活病毒液；
D)分别取所述腺病毒AV208株灭活病毒液、腺病毒AV208株灭活病毒液、腺病毒AV208株灭活病毒液以3:2:3的体积比混合，得到疫苗水相；
E)取白油灭菌，加入硫柳汞，得到疫苗油相，而后对所述疫苗油相在3000r/min搅拌条件下加入步骤D)所得的疫苗水相，而后以12000r/min的转速乳化18min，即得到所述多价疫苗；其中所述疫苗油相与疫苗水相的体积比为3:2；硫柳汞的用量为所述多价疫苗中硫柳汞的含量为0.008％(w/w)。
步骤A)中或步骤B)或步骤C)中收集尿囊液后，先浓缩12倍，再加入甲醛灭活。
步骤5)所述的制备卵黄抗体，具体包括以下操作：
α)收集所述蛋鸡所产的鸡卵，取卵黄液加水稀释后于68℃加热35min，加入6倍体积的酸化水；
β)于4℃条件静置5h，而后固液分离取上清，加入正辛酸至终浓度为0.4％(v/v)，于室温条件静置12h，即得到粗产物；
γ)取步骤β)所得的粗产物，先后经澄清处理、过滤除菌、超滤浓缩，而后加入甲醛至终浓度为0.2％(w/v)，即得到所述鸡包涵体肝炎卵黄抗体。
实施例6
一种鸡包涵体肝炎卵黄抗体，是由以下方法制备的：
1)以腺病毒AV208株、AV209株、AV211株为抗原制备多价疫苗；
2)首免：取120日龄蛋鸡，每只胸部肌肉注射2ml步骤1)所得的多价疫苗；
3)二免：首免10日后，每只胸部肌肉注射2ml步骤1)所得的多价疫苗；
4)三免：二免10日后，每只胸部肌肉注射2ml步骤1)所得的多价疫苗；
5)三免7日后，收集所述蛋鸡所产的鸡卵，制备卵黄抗体。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。