本发明涉及农业生物
技术领域：
，具体地，涉及一种地衣芽孢杆菌、一种微生物菌剂和它们在发酵床养殖中的应用。
背景技术：
：近年来，我国禽畜养殖业发展迅猛，并逐渐趋于规模化、集约化，但由于国内畜禽养殖场的排污设施和粪尿处理措施从技术和规模上都远远落后于发达国家，从养殖场排出的废水、废气、垃圾等对周边地区的空气、土壤及水体都造成了严重的污染，其中尤以禽畜养殖场恶臭气体对禽畜和周围人群的感官和健康影响最为显著。畜禽养殖场恶臭气体成分复杂，传统处理恶臭气体的方法是勤打扫，多通风，用水冲，这种方法浪费了大量的水资源，同时使养殖场内湿度增大，易导致禽畜患病。采用发酵床养殖技术是解决禽畜养殖粪便污染的新方法。发酵床养殖技术的原理是利用微生物菌剂，按一定比例与锯末、秸秆、稻壳等垫料混合，微生物以禽畜粪便为营养进行繁殖，使禽畜粪便中的有机物得到充分的分解和转化，从而使臭味消失，而微生物的生长和繁殖同时给禽畜提供了菌体蛋白等营养物质，从而形成一个无污染、无排放、无臭气的养殖系统。目前国内发酵床养殖模式已经在猪等养殖生产中推广应用，但是现有发酵床菌种还存在分解粪便效率低，菌种工作寿命短、易死亡等问题，对于养殖场恶臭气体中主要的氨气和硫化氢气体的分解去除效果较差，除臭效果不明显。技术实现要素：为了克服现有发酵床菌种所存在的分解粪便效率低等缺陷，本发明提供了一种分解粪便效率更高的地衣芽孢杆菌。本发明的发明人分离了一株地衣芽孢杆菌，发现其可以高效地将铵态氮转化为亚硝态氮从而减少氨氮的产生，同时还具有优异的产酸性能，可以维持菌种自身生长环境的酸性条件，由此得到了本发明。本发明提供一种地衣芽孢杆菌，该地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)的保藏编号为CGMCCNo.11235。本发明还提供了一种微生物菌剂，该微生物菌剂含有菌体和培养基，所述菌体含有保藏编号为CGMCCNo.11235的地衣芽孢杆菌。本发明还提供了如上所述的地衣芽孢杆菌和如上所述的微生物菌剂在发酵床养殖中的应用。通过上述技术方案，本发明可以维持菌种生长的低pH环境，延长菌种的工作寿命，同时更加高效地降解禽畜粪便中的氨氮，从而减轻养殖场臭气。本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。生物材料保藏本发明的地衣芽孢杆菌是本发明的发明人从北京延庆采集的牛粪鸡粪堆肥产物样品中分离的纯培养物，其保藏编号为CGMCCNo.11235，保藏日期为2015年8月13日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)。具体实施方式以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。本发明提供了一种地衣芽孢杆菌，该地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)的保藏编号为CGMCCNo.11235。本发明还提供了一种微生物菌剂，该微生物菌剂含有菌体和培养基，所述菌体含有保藏编号为CGMCCNo.11235的地衣芽孢杆菌。其中，微生物菌剂中含有的菌体的量可以在很大范围内改变，例如每克微生物菌剂中，保藏编号为CGMCCNo.11235的地衣芽孢杆菌的活菌数可以为108-1011cfu，优选情况下，每克微生物菌剂中，保藏编号为CGMCCNo.11235的地衣芽孢杆菌的活菌数可以为109-1010cfu。根据本发明，所述培养基的种类可以在很大范围内改变，可以为各种能够用于培养地衣芽孢杆菌的培养基，例如，可以为牛肉膏蛋白胨培养基、营养肉汤培养基、LB培养基等常用培养基作上述培养基能够商购得到或者根据“微生物培养基手册”(MicrobiologyCultureMediaManual)的记载制备得到。例如，培养基可以为牛肉膏蛋白胨培养基，其含有1-5g/L的牛肉膏、5-20g/L的蛋白胨和3-8g/L的氯化钠。其中，上述各种培养基可以按照常规的灭菌方法进行灭菌后备用，例如在115-125℃和1.5-2个标准大气压的条件下灭菌10-30分钟。其中，所述微生物菌剂的制备方法可以包括：将保藏编号为CGMCCNo.11235的地衣芽胞杆菌接种于培养基中进行培养。优选情况下，通过培养使得到的每克所述微生物菌剂中，保藏编号为CGMCCNo.11235的地衣芽胞杆菌的活菌数可以为107-1011cfu，更优选为109-1010cfu。在培养的过程中，可以通过常规的方法，例如血球板计数法或OD值观察法得到活菌的浓度。培养后的菌液可以直接作为微生物菌剂使用，优选情况下，菌液通过包括无菌过滤、冷冻干燥等步骤进一步加工为更方便贮藏的剂型的微生物菌剂使用。其中，菌种的培养条件没有特别的限制，可以为地衣芽孢杆菌培养过程中常用条件，例如采用摇床震荡培养，培养温度可以为28-37℃，培养时间可以为1-3天。本发明还提供了如上所述的地衣芽孢杆菌和如上所述的微生物菌剂在发酵床养殖中应用于垫料预发酵。根据本发明，地衣芽孢杆菌和微生物菌剂在发酵床养殖技术中的应用方法没有特别的要求，可以为发酵床养殖中菌剂的一般应用方法，例如，将垫料与菌剂按比例混合均匀，调整水分后将搅拌均匀的垫料堆积发酵。根据本发明，发酵床含有垫料与微生物菌剂，其中，垫料与微生物菌剂的重量比可以在很大范围内变化，优选情况下，微生物菌剂与垫料的重量可以比为1：(900-1200)。根据本发明，垫料与菌剂的混合方式没有特别的要求，可以将垫料按比例堆积好，再将菌剂均匀地撒在垫料上，充分混合直至完全混匀。垫料调整水分的方式也没有特别的要求，例如，可以在垫料与菌剂混匀的过程中加水，同时充分混合均匀。根据本发明，垫料的含水率没有特别的要求，可以为常规发酵床养殖技术中垫料的含水率。优选情况下，垫料的含水量可以为40-50重量％，含水量在此范围内的垫料的测试方法可以为手抓垫料可成团，松手即散，手上有水的感觉但指缝无水渗出。根据本发明，垫料种类没有特别的要求，可以为发酵床养殖技术中常用的垫料种类，优选情况下，垫料可以为选自锯末、稻壳和麸皮中的一种或几种。其中，作为本发明的一种优选实施方式，垫料可以为锯末，稻壳和麸皮的混合物，相对于100重量份的锯末，稻壳的用量可以为60-70重量份，麸皮的用量可以为5-10重量份。如上所述微生物菌剂可以先与麸皮混合均匀，二者混合物再与锯末和稻壳的混合物充分混匀，同时加水调整垫料含水量至40-50重量％。在该优选方式中，一方面能够让地衣芽孢杆菌在发酵过程中快速生长，另一方面获得的发酵床垫料用于养殖禽畜可以更有效地去除养殖臭味。根据本发明，垫料混合均匀并调节含水量后可以堆积发酵，其中，垫料堆的大小没有特别的要求，只要满足其内部温度可以使微生物菌剂正常发酵即可，优选情况下，垫料堆体积可以在10m3以上，垫料堆高1.5m以上。为了增加垫料堆发酵过程中的保温效果，可以在垫料堆上覆盖草垫或编织袋。根据本发明，上述发酵床养殖可以包括发酵床养猪、发酵床养鸡、发酵床养鸭和发酵床养羊中的至少一种。以下结合实施例进一步详细说明本发明：实施例1本实施例用于说明本发明的地衣芽孢杆菌的培养及微生物菌剂的制备。将保藏编号为CGMCCNo.11235的地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)接种到LB培养基(含10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母提取物和10g/L的NaCl)中，在30℃和200转/分振荡下培养。所得的菌液即为本实施例的微生物菌剂，每克该微生物菌剂中，活菌数为109cfu。实施例2本实施例用于说明本发明的地衣芽孢杆菌的培养及微生物菌剂的制备。将保藏编号为CGMCCNo.11235的地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)接种到牛肉膏蛋白胨培养基(含20g/L的蛋白胨、5g/L的牛肉膏和5g/L的NaCl)中，在37℃和180转/分振荡下培养得到菌液。所得的菌液经无菌过滤，冷冻干燥后即得到本实施例的微生物菌剂，每克该微生物菌剂中，活菌数为1010cfu。实施例3本实施例用于说明本发明的地衣芽孢杆菌的培养及微生物菌剂的制备。将保藏编号为CGMCCNo.11235的地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)接种到营养肉汤培养基(含10g/L的蛋白胨、3g/L的牛肉膏粉和5g/L的NaCl)中，在35℃和160转/分振荡下培养得到菌液。所得的菌液经无菌过滤，冷冻干燥后即得到本实施例的微生物菌剂，每克该微生物菌剂中，活菌数为6×109cfu。对比例1将购自ATCC的商品号为14580TM的地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)接种到LB培养基(含10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母提取物和10g/L的NaCl)中，在35℃和120转/分振荡下培养得到菌液。所得的菌液经无菌过滤，冷冻干燥后即得到本实施例的微生物菌剂，每克该微生物菌剂中，活菌数为5×109cfu。对比例2本对比例用于说明与本发明不同的微生物菌剂及其制备方法。(1)在100重量份的营养肉汁培养基(蛋白胨的含量为0.8重量％、NaCl的含量为0.4重量％、牛肉膏的含量为0.45重量％、余量为无菌水，pH为7.0)中接种4重量份的地衣芽孢杆菌的菌株(ACCC10146，购自中国农业微生物菌种保藏中心)，37℃发酵培养，在发酵过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至地衣芽孢杆菌的活菌数为0.8×1010个/克；(2)在100重量份的营养肉汁培养基中接种2重量份的枯草芽孢杆菌的菌株(ACCC10629，购自中国农业微生物菌种保藏中心)，37℃发酵培养，在发酵过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至枯草芽孢杆菌的活菌数为0.8×1010个/克的培养基，其中，所述肉汁培养基中，蛋白胨的含量为1重量％、NaCl的含量为0.25重量％、牛肉膏的含量为0.45重量％、余量为无菌水，pH为7.0。(3)在100重量份的营养肉汁培养基中接种3重量份的短小芽孢杆菌的菌株(ACCC10113，购自中国农业微生物菌种保藏中心)，37℃发酵培养，在发酵过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至短小芽孢杆菌的活菌数为0.8×1010个/克，其中，所述肉汁培养基中，蛋白胨的含量为0.5重量％、NaCl的含量为0.5重量％、牛肉膏的含量为0.3重量％、余量为无菌水，pH为7.0。(4)在100重量份的YPG培养基中接种4重量份的凝结芽孢杆菌的菌株(ACCC10229，购自中国农业微生物菌种保藏中心)，37℃发酵培养，在发酵过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至凝结芽孢杆菌的活菌数为0.8×1010个/克，其中，所述YPG培养基中，蛋白胨的含量为0.8重量％、葡萄糖的含量为0.3重量％、酵母膏的含量为0.8重量％、余量为无菌水，该培养基的pH为7.2。(5)在100重量份的麦芽汁培养基(上海晶纯试剂有限公司)中接种3重量份的酿酒酵母菌株(ACCC20237，购自中国农业微生物菌种保藏中心)，30℃发酵培养，在发酵过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至酿酒酵母的活菌数为0.8×1010个/克的培养基。(6)在100重量份的高氏合成一号培养基中接种4重量份的泾阳链霉菌的菌株(ACCC40126，购自中国农业微生物菌种保藏中心)，30℃发酵，在发酵过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至泾阳链霉菌的活菌数为0.8×1010个/克，其中，所述高氏一号培养基中，以该培养基的总重量为基准，可溶性淀粉的含量为2重量％、KNO3的含量为0.2重量％、K2HPO4的含量为0.7重量％、NaCl的含量为0.03重量％、余量为无菌水，该培养基的pH为7.2。(7)将步骤(1)至(6)中得到的地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、酿酒酵母和泾阳链霉菌按照比例进行混合，使得到的微生物菌剂中，以得到的微生物菌剂的总活菌数为基准，地衣芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的15重量％、枯草芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的15％、短小芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的20％、凝结芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的20％、酿酒酵母的活菌数为总活菌数的15％、泾阳链霉菌的活菌数为总活菌数的15％。实施例4本实施例用于说明本发明所述的微生物菌剂用于发酵床养殖中垫料预发酵的方法。本实施例使用与实施例3相同的微生物菌剂。取100重量份的松木锯末和66重量份的稻壳，洒入20重量份水，混合均匀并堆好，将6重量份的麸皮和0.17重量份的菌剂混合均匀后，均匀撒在堆积好的锯末和稻壳上，将所有原料充分混合至完全均匀，同时调整水分至垫料含水量为45％，混好的垫料按每堆10m3,高1.5m堆积，垫料上覆盖草垫保温发酵，当垫料温度＞55℃，摊开后即可使用。实施例5本实施例用于说明本发明所述的微生物菌剂用于发酵床养殖中垫料预发酵的方法。本实施例使用与实施例2相同的微生物菌剂。取100重量份的松木锯末和60重量份的稻壳，洒入20重量份水，混合均匀并堆好，将10重量份的麸皮和0.14重量份的菌剂混合均匀后，均匀撒在堆积好的锯末和稻壳上，将所有原料充分混合至完全均匀，同时调整水分至垫料含水量为40％，混好的垫料按每堆10m3,高1.5m堆积，垫料上覆盖草垫保温发酵，当垫料温度＞55℃，摊开后即可使用。实施例6本实施例用于说明本发明所述的微生物菌剂用于发酵床养殖中垫料预发酵的方法。本实施例使用与实施例1相同的微生物菌剂。取100重量份的松木锯末和70重量份的稻壳，洒入20重量份水，混合均匀并堆好，将0.21重量份的菌剂混合均匀后，均匀撒在堆积好的锯末和稻壳上，将所有原料充分混合至完全均匀，同时调整水分至垫料含水量为50％，混好的垫料按每堆10m3,高1.5m堆积，垫料上覆盖草垫保温发酵，当垫料温度＞55℃，摊开后即可使用。对比例3采用实施例4中的垫料预发酵方法，所不同的是，使用与对比例1相同的微生物菌剂。对比例4本对比例用于说明与本发明不同的垫料发酵方法，使用与对比例2相同的微生物菌剂。(1)按照下述重量比例制备垫料：稻秆的用量为20重量％，稻壳的用量为30重量％，木屑的用量为40重量％，米糠的用量为10重量％。(2)使用对比例2制得的微生物菌剂对所述垫料进行接种，相对于100重量份的基料，微生物菌剂的接种量为3重量份。(3)对接种后的垫料进行发酵，发酵温度为50℃，发酵时间为2天。(4)将发酵后的垫料在猪舍内进行堆料，堆料的高度为55公分，堆料中温度维持在35-60℃，该垫料的使用时间为150天，猪舍的温度维持在15-35℃。测试实施例1本测试实施例测定实施例1-3和对比例1-2的微生物菌剂的降解氨氮的能力。分别配制无菌牛肉膏蛋白胨培养基，250mL的锥形瓶中装入100mL培养基，分别加入实施例1-3和对比例1的微生物菌剂0.05g，置于37℃培养24h。配制氨氧化菌培养基((NH4)2SO42g/L，NaCl0.3g/L，FeSO4·7H2O0.03g/L，MgSO4·7H2O0.03g/L，K2HPO41g/L，NaHCO31.6g/L，琼脂粉18g/L，使用1N氢氧化钠溶液调整pH至7.2)，每瓶100mL，接入1mL上述各菌液。培养4天后，检测培养基中氨氮的浓度，结果列于表1。表1根据表1的数据可见，本发明的保藏编号为CGMCCNo.11235的地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)及其菌剂相对于其他微生物及菌剂具有突出的降解氨氮的能力。测试实施例2本测试实施例测定实施例1-3和对比例1-2的微生物菌剂的产酸能力。分别配制无菌牛肉膏蛋白胨培养基，250mL的锥形瓶中装入100mL培养基，分别加入实施例1-3和对比例1的微生物菌剂0.05g，置于37℃培养24h。配制产酸菌培养基(葡萄糖6g/L，酵母膏1g/L，蛋白胨1g/L,MgSO40.05g/L，CaCO31g/L,溴甲酚紫0.04g/L)，将产酸菌培养基8mL置于玻璃试管(18mm*180mm)中，灭菌好备用。接入1mL上述各菌液，置于37℃、170r/min震荡培养。培养24h后观察是否使溴甲酚紫变色，并测量每个样品试管中的pH值，结果列于表2。表2菌剂是否变色pH实施例1是5.12实施例2是5.01实施例3是4.93对比例1否7.09对比例2否6.83根据表2的数据可见，本发明的保藏编号为CGMCCNo.11235的地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)及其菌剂相对于其他微生物及菌剂具有较强的产酸能力，可以维持微生物生长所需的酸性环境。测试实施例3本测试实施例测定实施例4-6和对比例3-4垫料预发酵方法中发酵床的性能。测试垫料的pH值、温度和细菌总数，结果分别列于表3，表4和表5中。pH值的测试方法为：取相当于2g鲜样的风干样品，加50mL蒸馏水，在摇床振荡混匀20min，静置2h，测定上清液的pH值；温度的测定方法为在料堆距离地面1米高处，从斜坡表面向料堆中心垂直插入温度计，在深度为30cm、60cm和90cm处用长柄金属温度计测定温度，取平均值；细菌总数的测定方法为稀释涂布平板法。表3根据表3的数据可见，本发明的菌剂可以缓冲调节发酵垫料的pH值，使其维持在相对中性的条件，这有利于益生菌的繁殖生长，在畜禽舍内使用时有利于畜禽粪便的快速消解。表4根据表4的数据可以看出，本发明的菌剂添加到发酵床垫料中，发酵升温速度快，发酵第三天即可进入高温期，这说明该菌剂发酵速度快，效率高。从实施例4-5与实施例6的数据对比可以看出，优选的发酵床垫料为锯末、稻壳和麸皮共同使用制备发酵床的情况下，菌剂的发酵速度更快。表5根据表5的数据可见，与对比例3-4相比，实施例4-6所使用的微生物菌剂中可培养细菌总数较高，而且其中菌剂中含有的保藏编号为CGMCCNo.11235的地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)的数量占优势，而且菌剂中的地衣芽孢杆菌的增长速度很快，垫料中的杂菌逐渐变少。这是由于在＞55℃时大部分的霉菌类被杀灭，另外有不少细菌杂菌也不耐高温，但菌剂中的地衣芽孢杆菌在高温条件下可休眠，当高温期过后，便成为垫料中的主要菌种。从实施例4-5与实施例6的数据对比可以看出，优选的发酵床垫料为锯末、稻壳和麸皮共同使用制备发酵床的情况下，垫料中的菌剂菌数量更多，增长速度也更快。测试实施例4本测试实施例测定实施例4-6和对比例3-4的垫料预发酵方法用于发酵床养殖技术的效果。选择相同日龄，体重相近(约10kg)的杜×长×大三元杂交猪仔100头，根据体重及性别比例相近的原则平均分为5组，分别采用与实施例4-6和对比例3-4相同的微生物菌剂和垫料预发酵方法制备发酵床。上述5组猪仔饲喂70天，测试并统计猪舍环境状况和猪的生长性能，结果如表6所示。表6组别圈舍状况猪生长情况实施例4无明显臭味毛色光亮，猪体洁净实施例5无明显臭味毛色光亮，猪体洁净实施例6无明显臭味毛色光亮，猪体洁净对比例3恶臭毛色暗淡，猪体较脏对比例4有臭味毛色暗淡，猪体较脏根据表6的数据可以看出，实施例4-6的圈舍环境明显比对比例3-4好，说明应用本发明的微生物菌剂可以高效地消除养殖恶臭，改善养殖圈舍的环境，降低臭味向环境排放。表7组别初重量/kg末重量/kg日增重/kg料肉比实施例410.56±1.4552.47±5.090.60±0.032.34实施例510.37±1.5351.67±4.150.59±0.042.38实施例610.41±1.4851.01±4.150.58±0.042.41对比例310.44±1.2244.57±4.230.49±0.042.88对比例410.48±1.2247.70±4.230.53±0.042.64根据表7的数据可以看出，实施例4-6中养殖猪的日增重和料肉比等各方面生长性能明显优于对比例3-4中的养殖猪，这是由于本发明的微生物菌剂应用于发酵床养殖后，消除了养殖圈舍臭气，使养殖猪的生长环境大为改善，促进了养殖猪的生长，提高了养殖的效益。从实施例4-5与实施例6的数据对比可以看出，优选的发酵床垫料为锯末、稻壳和麸皮共同使用制备发酵床的情况下，养殖猪的生长性能更为优异。以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。当前第1页1 2 3