特异性结合微管相关蛋白TAU的抗体和抗原结合片段的制作方法

发明领域

本发明涉及医学。本发明具体涉及特异性结合微管相关蛋白tau的抗体和抗原结合片段。本发明还涉及使用抗tau抗体的诊断、预防以及治疗方法。

发明背景

痴呆是一种可以由许多进行性障碍引起的综合征，这些进行性障碍影响记忆、思维、行为和执行日常活动的能力。当今，世界上约有3600万人患有痴呆。到2030年患有痴呆的人数预计将增加一倍，而到2050年将增加三倍以上，达到1.154亿人。阿尔茨海默病是最常见类型的痴呆。目前，65岁及以上的人中有1/9的人(11％)，85岁以上的人中有将近一半人患有阿尔茨海默病。根据阿尔茨海默病国际协会，目前护理这些患者的全球成本每年超过6000亿美元。这些成本甚至可能比疾病的流行率上升更快，特别是在发展中国家，随着更正规的社会保障制度的出现，而且收入增加导致更高的机会成本(温布拉德(winblad)，b和琼森(jonsson)，l，2010年世界阿尔茨海默症报告(worldalzheimerreport2010))。

ad患者的脑具有丰富的两种异常结构，即淀粉样蛋白斑和神经原纤维缠结。这在大脑的某些区域中尤其如此，这些区域对于是记忆重要的。在大脑皮层和某些皮层下区域中还存在神经元和突触的显著损失。神经原纤维缠结和神经元损失都与疾病的持续时间和严重程度并行增加(戈麦斯·易斯拉(gomez-isla)，t.等人，神经学年鉴(annneurol)1997；41:17-24)，并且神经原纤维负荷已经显示与认知降低相关。(布拉克(braak)，h.和布拉克，e，衰老神经生物学(neurobiolaging.)1997年7月至8月；18(4):351-7。)

神经原纤维缠结是由微管相关蛋白tau的过度磷酸化和不溶性积累组成的神经元内损伤。这些积累是许多神经变性疾病的组织病理学特征，其统称为tau蛋白病变。tau蛋白病变包括，例如，阿尔茨海默病(ad)、皮克氏病(pid)、进行性核上性麻痹(psp)、皮质基底节变性(cbd)、以及额颞叶变性(ftld)。在人类tau蛋白病变中，病变以疾病特异性模式从一个脑区域进展到另一个脑区域(布拉克，h.和布拉克，e，衰老神经生物学，1997年7月至8月；18(4):351-7；raj等人，神经元(neuron)2012；73:1204-1215；西利(seeley)等人，神经元2009；62:42-52；以及周(zhou)等人，神经元2012；73:1216-1227)，其基本机制尚不清楚。

tau病理学涉及其中并且可以是许多tau蛋白病变的起因。在其正常形式中，tau是结合并促进微管组装(德雷克泽尔(drechsel)等人，细胞分子生物学(molbiolcell)1992；3:1141-1154)的高度可溶性微管相关蛋白(杰加纳丹(jeganathan)等人，生物化学(biochemistry)2008；47:10526-10539)。然而，在tau蛋白病变中，tau变得高度磷酸化，导致从微管脱离，并且最终作为神经原纤维缠结而积累，这些神经原纤维缠结在营养不良的神经突和细胞体内是可视化的(mandelkow和mandelkow，冷泉港医学专辑(coldspringharborperspectmed)2,2012:a006247)。tau病理学的量与进行性神经元功能障碍、突触损失以及人类和转基因小鼠模型中的功能下降相关(阿里亚加达(arriagada)等人，神经学(neurology.)1992年3月；42(3pt1):631-9；班凯尔(bancher)等人，神经科学通讯(neuroscilett)1993；162:179-182；polydoro等人，神经科学杂志(j.neoroscience)2009；29:10741-10749；以及斯莫尔(small)和达夫(duff)，神经元(neuron)2008年11月26日；60(4):534-42)。虽然在阿尔茨海默病中没有观察到tau突变，但是tau基因中的突变似乎引起一些形式的额颞痴呆(凯恩斯(cairns)等人，美国病理学杂志(amjpathol)，2007；171:227-40)，这呈现为tau阳性内含物并标志着tau功能障碍足以引起神经变性。此外，病理性tau似乎是细胞培养和转基因动物模型中aβ诱导的神经毒性的组成部分(拉波波特(rapoport)，m，美国科学院院刊(pnas)，2002；99:9,6364-6369；罗伯逊(roberson)ed等人，科学(science)，2007；316:750-754；尼科尔森(nicholson)am和费雷拉(ferreira)a，神经科学杂志(jneurosci)2009；29:4640-4651；奥克利(oakley)h，神经科学杂志2006；26(40):10129-10140)。

使用若干种不同的小鼠模型，在小鼠中分析了针对tau的被动和主动免疫，包括用于主动免疫的不同磷酸tau肽和用于被动免疫治疗的抗tau抗体(阿苏尼(asuni)aa等人，神经科学杂志2007；27(34):9115-9129；西古德松(sigurdsson)em，当今阿尔茨海默研究(curralzheimerres.)2009；6(5):446-450；boutajangouta等人，神经科学杂志2010；30(49):16559-16566；罗森曼(rosenmann)h等人，神经学档案(archneurol.)2006；63(10):1459-1467；boimelm等人，神经学实验(expneurol.)2010；224(2):472-485)。在描述了用30个氨基酸磷酸化的tau肽免疫的第一个报告中，显示了对可溶性和不溶性tau的比例的影响、免疫小鼠中缠结形成的减少以及在这些小鼠的行为测试中观察到的功能益处(boutajangouta等人，神经科学杂志(j.neuroscience)，2010；30:16559-16566)。用良好表征的抗tau抗体进行的被动免疫证实了在主动免疫研究中看到的结果，该抗tau抗体与tau上的早期病理构象表位处的过度磷酸化tau蛋白的磷酸化ser396和ser404进行反应。用这些抗体处理的小鼠显示了tau病变的显著减少(通过生物化学方法和组织学进行测量)，以及在行为测试中评估的运动功能下降的显著延迟。(boutajangouta等人，神经化学杂志(jneurochem.)2011；118(4):658-667；翟(chai)x等人，生物化学杂志(jbiolchem.)2011；286(39):34457-34467。)

迄今为止，仅在小鼠模型中分析了基于tau的疗法。但是一般鉴于tau蛋白病变的严重性，并且特别地鉴于对阿尔茨海默病的社会成本，仍然需要有效手段来诊断、监测、预防并治疗tau蛋白病变。

发明概述

本发明提供了包括抗原结合可变区的抗体，该抗原结合可变区与tau特异性结合。本发明具体提供了抗tau抗体及其抗原结合片段，它们检测正常人类脑组织中的tau，或检测人类阿尔茨海默病(ad)和进行性核上性麻痹(psp)脑组织中的tau沉积物。在某些实施例中，这些抗tau抗体及其抗原结合片段通过western测定与重组tau和/或phf-tau结合。

本发明进一步提供了嵌合抗体，这些嵌合抗体包含来自天然存在的人类抗体的抗原结合可变区、以及人类igg1的重组恒定区，该抗原结合可变区特异性结合tau，其中该嵌合抗体的恒定区不同于天然存在的抗体。在某些实施例中，本发明提供了嵌合抗tau抗体及其抗原结合片段，它们检测正常人类脑组织中的tau，但不检测人类阿尔茨海默病(ad)和进行性核上性麻痹(psp)脑组织中的tau沉积物。

在某些实施例中，这些(嵌合)抗tau抗体及其抗原结合片段通过western测定与重组tau和/或phf-tau结合。在某些实施例中，这些抗tau抗体及其抗原结合片段不在elisa中结合重组tau和/或phf-tau。这些抗体和抗原结合片段能够优先地特异性结合tau肽。在一些实施例中，这些抗体和抗原结合片段能够优先地特异性结合tau磷酸肽，但不结合未被磷酸化的肽。在某些实施例中，这些抗tau抗体不是天然存在的。优选地，这些抗体是人类的。

本发明的这些抗体和抗原结合片段单独和与其他诊断、预防和/或治疗剂组合可用作诊断、预防和/或治疗剂。

在一方面中，本发明涉及一种抗tau抗体，该抗tau抗体包含以下各项的抗原结合位点：seqidno:163的重链cdr1区、seqidno:164的重链cdr2区、以及seqidno:165的重链cdr3区、seqidno:166的轻链cdr1区、seqidno:167的轻链cdr2区、以及seqidno:168的轻链cdr3区。

本发明的另一个实施例涉及一种抗tau抗体，该抗tau抗体包含以下各项的抗原结合位点：seqidno:169的重链cdr1区、seqidno:170的重链cdr2区、以及seqidno:171的重链cdr3区、seqidno:172的轻链cdr1区、seqidno:173的轻链cdr2区、以及seqidno:174的轻链cdr3区。

在一方面中，本发明涉及一种抗tau抗体，该抗tau抗体包含以下各项的抗原结合位点：seqidno:175的重链cdr1区、seqidno:176的重链cdr2区、以及seqidno:177的重链cdr3区、seqidno:178的轻链cdr1区、seqidno:179的轻链cdr2区、以及seqidno:180的轻链cdr3区。

本发明的另一个实施例涉及一种抗tau抗体，该抗tau抗体包含以下各项的抗原结合位点：seqidno:181的重链cdr1区、seqidno:182的重链cdr2区、以及seqidno:183的重链cdr3区、seqidno:172的轻链cdr1区、seqidno:173的轻链cdr2区、以及seqidno:184的轻链cdr3区。

本发明的另一个实施例涉及一种抗tau抗体，该抗tau抗体包含以下各项的抗原结合位点：seqidno:185的重链cdr1区、seqidno:186的重链cdr2区、以及seqidno:187的重链cdr3区、seqidno:188的轻链cdr1区、seqidno:173的轻链cdr2区、以及seqidno:189的轻链cdr3区。

本发明的又另一个实施例涉及一种抗tau抗体，该抗tau抗体包含以下各项的抗原结合位点：seqidno:190的重链cdr1区、seqidno:191的重链cdr2区、以及seqidno:192的重链cdr3区、seqidno:193的轻链cdr1区、seqidno:194的轻链cdr2区、以及seqidno:195的轻链cdr3区。

本发明的又另一个实施例涉及一种抗tau抗体，该抗tau抗体包含以下各项的抗原结合位点：seqidno:196的重链cdr1区、seqidno:197的重链cdr2区、以及seqidno:198的重链cdr3区、seqidno:199的轻链cdr1区、seqidno:173的轻链cdr2区、以及seqidno:200的轻链cdr3区。

本发明的又另一个实施例涉及一种抗tau抗体，该抗tau抗体包含以下各项的抗原结合位点：seqidno:213的重链cdr1区、seqidno:214的重链cdr2区、以及seqidno:215的重链cdr3区、seqidno:216的轻链cdr1区、seqidno:173的轻链cdr2区、以及seqidno:217的轻链cdr3区。

本发明的另一方面涉及一种抗tau抗体，该抗tau抗体包含以下各项的抗原结合位点：seqidno:213的重链cdr1区、seqidno:214的重链cdr2区、以及seqidno:215的重链cdr3区、seqidno:218的轻链cdr1区、seqidno:174的轻链cdr2区、以及seqidno:217的轻链cdr3区。

本发明的另一方面涉及一种抗tau抗体，该抗tau抗体包含以下各项的抗原结合位点：seqidno:219的重链cdr1区、seqidno:220的重链cdr2区、以及seqidno:221的重链cdr3区、seqidno:218的轻链cdr1区、seqidno:173的轻链cdr2区、以及seqidno:217的轻链cdr3区。

本发明进一步涉及以上抗体的抗原结合片段。

在另一方面中，本发明涉及一种抗tau抗体并且涉及其抗原结合片段，该抗tau抗体包含seqidno:87、91、95、99、103、107、111、123、127或131的重链可变区(vh)的抗原结合位点，和seqidno:88、92、96、100、104、108、112、124、128或132的轻链可变区(vl)的抗原结合位点。

在另一方面中，本发明涉及一种抗tau抗体并且涉及其抗原结合片段，该抗tau抗体包含含有seqidno:87的氨基酸序列的重链可变区和含有seqidno:88的氨基酸序列的轻链可变区。在另一方面中，本发明涉及一种抗tau抗体并且涉及其抗原结合片段，该抗tau抗体包含含有seqidno:91的氨基酸序列的重链可变区和含有seqidno:92的氨基酸序列的轻链可变区。在另一方面中，本发明涉及一种抗tau抗体并且涉及其抗原结合片段，该抗tau抗体包含含有seqidno:95的氨基酸序列的重链可变区和含有seqidno:96的氨基酸序列的轻链可变区。在另一方面中，本发明涉及一种抗tau抗体并且涉及其抗原结合片段，该抗tau抗体包含含有seqidno:99的氨基酸序列的重链可变区和含有seqidno:100的氨基酸序列的轻链可变区。在另一方面中，本发明涉及一种抗tau抗体并且涉及其抗原结合片段，该抗tau抗体包含含有seqidno:103的氨基酸序列的重链可变区和含有seqidno:104的氨基酸序列的轻链可变区。在另一方面中，本发明涉及一种抗tau抗体并且涉及其抗原结合片段，该抗tau抗体包含含有seqidno:107的氨基酸序列的重链可变区和含有seqidno:108的氨基酸序列的轻链可变区。在另一方面中，本发明涉及一种抗tau抗体并且涉及其抗原结合片段，该抗tau抗体包含含有seqidno:111的氨基酸序列的重链可变区和含有seqidno:112的氨基酸序列的轻链可变区。在另一方面中，本发明涉及一种抗tau抗体并且涉及其抗原结合片段，该抗tau抗体包含含有seqidno:123的氨基酸序列的重链可变区和含有seqidno:124的氨基酸序列的轻链可变区。在另一方面中，本发明涉及一种抗tau抗体并且涉及其抗原结合片段，该抗tau抗体包含含有seqidno:127的氨基酸序列的重链可变区和含有seqidno:128的氨基酸序列的轻链可变区。在另一方面中，本发明涉及一种抗tau抗体并且涉及其抗原结合片段，该抗tau抗体包含含有seqidno:131的氨基酸序列的重链可变区和含有seqidno:132的氨基酸序列的轻链可变区。

在一个实施例中，该igg1重链恒定区由seqidno:83的氨基酸序列组成。在另一个实施例中，该igg1轻链恒定区由seqidno:84的氨基酸序列组成。

本发明还提供了编码这些抗体或其抗原结合片段的核酸分子。本发明的另一个方面是包含本发明的核酸分子的载体。本发明的另一个特征是包含本发明的载体的宿主细胞。

本发明还提供了一种产生抗tau抗体的方法，该方法包括培养本发明的宿主细胞并回收由宿主细胞产生的抗体。

本发明进一步提供了这些抗体的功能变体、和免疫偶联物，这些免疫偶联物包括该抗体和/或其抗原结合片段。

本发明进一步提供了组合物和试剂盒，这些组合物和试剂盒包含一种或多种本发明的抗体和/或其抗原结合片段。另外，本发明提供了使用这些抗tau抗体的诊断、预防以及治疗方法。预防和治疗方法包括向人类受试者给予这些抗tau抗体和/或其抗原结合片段，用于预防或治疗tau蛋白病变和/或tau介导的疾病或病症，和/或改善tau蛋白病变的一种或多种症状。多种不同抗tau抗体和/或其抗原结合片段和/或与其他抗tau抗体的组合可以用于组合疗法。还提供了包含这些抗tau抗体和/或其抗原结合片段与其他预防或治疗剂组合的组合物。

在一些实施例中，本发明的这些抗体是独特的，因为这些可变区从来自健康个体的抗tau特异性记忆b细胞中恢复并检测人类阿尔茨海默脑中的tau沉积物，但不检测正常人类脑中的tau，并且是磷酸依赖性的并且结合tau肽ptau194-212(seqidno:315)或ptau200-217(seqidno:319)或ptau59-78(seqidno:323)或ptau406-429(seqidno:326)。在其他实施例中，这些抗体是独特的，因为这些可变区从来自健康个体的抗tau特异性记忆b细胞中恢复并检测人类阿尔茨海默脑中的tau沉积物并且检测正常(即，健康)人类脑中的tau，并且主要是磷酸独立性的并且结合tau肽tau204-221(seqidno:318)或tau221-253(seqidno:367)。在又其他实施例中，本发明的这些抗体是独特的，因为这些可变区从来自患有阿尔茨海默病个体的抗tau特异性记忆b细胞中恢复，并且是磷酸依赖性的并且结合磷酸化tau肽ptau406-429(seqidno:326)，并且不结合未磷酸化的tau肽tau389-441(seqidno:327)。

附图简要说明

图1a-t显示了cbtau-7.1、8.1、16.1、18.1、20.1、22.1、24.1、27.1、28.1、41.1、41.2、42.1、43.1、44.1、45.1、46.1、47.1、47.2、以及49.1对相应的同源肽和非同源肽的反应性。

图2a-j通过elisa显示了cbtau-7.1、8.1、16.1、18.1、20.1、22.1、24.1、27.1以及28.1对重组tau(rtau)、富集的免疫纯化的成对螺旋丝(ephf)和免疫纯化的成对螺旋纤丝(iphf)的反应性。抗taumab、at8被用作阳性对照。

图3通过蛋白印迹分析显示了cbtau-7.1、18.1、22.1、24.1、27.1、以及28.1对rtau、ephf、和iphf的免疫反应性。

图4a-g显示了使用重叠肽的cbtau-27.1、28.1、43.1、46.1、47.1、47.2和49.1的表位作图，这些重叠肽对应于人类tau441上的区域42-103和299-369。

图5a-d显示了关于本申请中详述的cbtaumab的免疫组织化学结果。图5a-b显示了cbtau-7.1、8.1、16.1、18.1、20.1、22.1、24.1、27.1和28.1分别在非ad与ad海马组织切片和皮层组织切片上的免疫染色。图c显示了cbtau-7.1、8.1、16.1、18.1、20.1、22.1、和24.1在非psp和psp皮层组织切片上的免疫染色。图5d显示了cbtau-43.1、46.1、47.2、和49.1对非ad和ad皮层组织切片的免疫染色。

图6a显示了cbtau-28.1和对照mab对非ad(54岁男性；无临床症状)和ad(93岁西班牙裔女性)海马组织切片的免疫反应性。

图6b显示了在有和无小牛肠磷酸酶处理的情况下，cbtau-28.1和对照mab对ad(93岁西班牙裔女性)海马组织切片的反应性。

图7显示了cbtau-28.1和磷酸taumab、at8对iphf(免疫纯化的成对螺旋纤丝)和小牛肠磷酸酶处理的iphf样本的反应性。

图8a-e显示了cbtau-27.1、28.1、43.1、46.1、47.1、47.2、和49.1对详述于表30-34中的tau磷肽的反应性。

发明详述

定义

以下给出如本发明中所用的术语的定义。

如在此所用，术语“包括(included)”或“包括着(including)”被视为后面有措辞“无限制”。

如在此使用的术语“tau”，被可互换地使用来具体指tau的天然单体形式。术语“tau”还通常用于鉴定tau的其他构象异构体，例如tau的低聚物或聚集体。术语“tau”还用来统称为所有类型和形式的tau。由于可变剪接，6种tau亚型存在于人类脑部。这些亚型的不同之处在于由氨基末端部分中的外显子2和3编码的一个或两个29氨基酸插入物与羧基末端部分中的三个(r1、r3和r4)或四个(r1-r4)重复区域的组合的存在或不存在。该微管结合结构域由外显子10编码。这些成人类tau亚型包括最长的441-氨基酸组分(seqidno:1)、或4r/2n，410-氨基酸组分(seqidno:2)、或3r/2n，412-氨基酸组分(seqidno:3)、或4r/1n，381-氨基酸组分(seqidno:4)、或3r/1n以及383-氨基酸组分(seqidno:5)或4r/0n。最短的352-氨基酸亚型(seqidno:6)、或3r/0n发现于胎儿脑中，并且因此被称为胎儿tau亚型。

该“野生型”tau氨基酸序列被表示为441氨基酸亚型(seqidno:1)，也称为“tau441”、“4r/2n”、“htau40”、“tauf”、“tau-4”或“全长tau”。

本文的术语“重组tau”是指人类脑tau(seqidno:1)的最长亚型，该人类脑tau在大肠杆菌中表达并纯化至均匀或近似均匀(巴格霍恩(barghorn)s.，分子生物学方法(methmolbiol)2004299:35-51)。重组tau是可溶的并且不被磷酸化。

术语“神经原纤维缠结”(nft)是指病理结构，其初次通过痴呆患者的脑中的阿耳茨海默进行描述。nft由称为过度磷酸化tau蛋白的成对螺旋纤丝聚集体的有序排列的亚组组成，所述nft最通常的已知为阿尔茨海默病的主要标示物。

如在此使用的术语“成对螺旋纤丝-tau”或“phf-tau”是指熟知的tau聚集体，这些tau聚集体构成了称为神经原纤维缠结(nft)的病理结构，其初次通过痴呆患者的脑中的阿耳茨海默进行描述。还在许多称为tau蛋白病变的其他疾病中发现了它们的存在。

根据如实例中详述的格林伯格(greenberg)和戴维斯(davies)的方案来制备“富集的phf-tau”或“ephftau”。通过利用它们在两性离子去污剂(科希克(kosik)，k.s等人，(1986)美国国家科学院院刊(pnasusa)83,4044-4048；鲁宾斯坦(rubenstein)，r.等人，(1986)脑研究(brainres.)372,80-88)和巯基乙醇中的不溶性，将phftau从含有0.8mnacl的27,200xg上清液中富集。用两性离子去污剂分离的phf似乎保持抗原位点，这些抗原位点可能在sds不溶性神经纤维缠结的分离过程中损失并且在结构上类似并且在nft中含有许多对phf的抗原性质。“免疫纯化的phf-tau”或“iphftau”是用抗tau单克隆抗体亲和纯化的。这样的方案已经提供了phf-tau制剂，其通过电子显微镜保留了经典的成对螺旋纤丝结构，并且完全可溶于低浓度的sds中(jicha,g.,1997,48(2):128-32)。phf-tau也通过在体外用肝素诱导聚合从重组tau形成(mandelkow等人，分子生物学方法(methodsinmolecularbiology)299:35-51(2004))。可替代地，使用例如rostagna和ghiso(rostagna,a.和ghiso,j.，分子生物学现行方案(currprotoccellbiol.)，2009年9月；章：单元-3.3333.)描述的方案，通过各种其他方法从患有ad的患者的脑中分离phf-tau。该分离的phf-tau的特征在于其纯度和已知与phf-tau反应的抗体的过度磷酸化状态。在典型的phf-tau制剂中，通过特异性结合过度磷酸化的phf-tau但不结合去磷酸化的phf-tau的at8抗体来检测在蛋白印迹法(斯皮兰提尼(spillantini)和古德特(goedert)，神经科学趋(trendsneurosci)21:428-33,1998)中在约60、64、68和72kda处迁移的过度磷酸化条带。

如在此使用的术语“抗体”是指广义的，并且包括免疫球蛋白或抗体分子，这些抗体分子包括多克隆抗体、单克隆抗体(包括鼠、人类、人类适应的、人源化的和嵌合单克隆抗体)、双特异性或多特异性抗体和抗体片段。通常，抗体是对限定的抗原显示结合特异性的蛋白质或肽链。抗体结构是熟知的。免疫球蛋白可以分为五个主要类别，即iga、igd、ige、igg和igm，这取决于重链恒定结构域氨基酸序列。进一步将iga和igg细分为同种型igal、iga2、igg1、igg2、igg3以及igg4。任何脊椎动物物种的抗体轻链可以基于其恒定结构域的氨基酸序列分为两种明显不同的类型之一，即kappa(κ)和lambda(λ)。

术语“抗原结合片段”是指完整抗体的一部分。抗体片段的实例包括fab、fab'、f(ab')2和fv片段、cdr、抗原结合位点、重链或轻链可变区、双抗体、三链抗体、单链抗体分子(scfv)和多特异性抗体，这些多特异性抗体由至少两种完整抗体或其片段或(多)肽形成，包含免疫球蛋白的至少一个足以赋予抗原与(多)肽等结合的片段。一种抗原结合片段可以包含包括抗体的氨基酸序列的至少2、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200或250个连续氨基酸残基的一种氨基酸序列的一种肽或多肽。抗原结合片段可以合成地或通过使完整免疫球蛋白酶促或化学裂解而产生，或它们可以通过重组dna技术而基因工程化。产生方法在本领域中是熟知的并且在例如《抗体：实验手册》(antibodies:alaboratorymanual)，e.哈洛(e.harlow)和d莱恩(d,lane)编(1988)，冷泉港实验室(coldspringharborlaboratory)，冷泉港(coldspringharbor)，纽约(newyork)中进行描述，该文献通过引用结合在此。一种抗体或其抗原结合片段可以具有一个或多个结合位点。如果存在多于一个结合位点，那么这些结合位点可以与彼此相同或它们可以是不同的。

免疫球蛋白轻链或重链可变区由被“抗原结合位点”间隔的“框架”区组成。这些抗原结合位点使用如下各种术语来定义：(i)互补决定区(cdr)是基于序列变异性的(吴(wu)和卡巴特(kabat)，实验医学杂志(jexpmed)132:211-50,1970)。通常，该抗原结合位点在每个可变区具有三个cdr(在重链可变区(vh)的hcdrl、hcdr2和hcdr3以及在轻链可变区(vl)的lcdrl、lcdr2和lcdr3)(卡巴特等人，免疫学上感兴趣的蛋白质序列，第5版，公共健康服务局(publichealthservice)，国立卫生研究院(nationalinstitutesofhealth)，贝塞斯达(bethesda)，马里兰州，1991)。(ii)术语“高变区”、“hvr”或“hv”是指抗体可变结构域的区域，这些区域在如乔西亚(chothia)和莱斯克(lesk)所定义的结构中是高变的(乔西亚和莱斯克，分子生物学杂志(jmolbiol)96:901-17,1987)。通常，该抗原结合位点具有三个高变区，在每个vh(hl、h2、h3)和vl(ll、l2、l3)中。乔西亚和莱斯克将结构保守的hv称为“典型结构”。编号系统以及cdr和hv的注释最近已由阿比南当(abhinandan)和马丁(martin)进行了修订(阿比南当和马丁，分子免疫学(molimmunol)45:3832-9,2008)。(iii)基于来自免疫球蛋白和t细胞受体的v结构域的比较，勒弗朗(lefranc)已经提出了形成抗原结合位点的区域的另一种定义(勒弗朗等人，发育和比较免疫学(devcampimmunol)27:55-77,2003)。国际免疫遗传学(imgt)基因库(http:_//wwwimgt_org)提供了对于这些区域的标准标号和定义。cdr、hv和imgt描述之间的对应性由勒弗朗等人进行了描述。还可以基于特异性决定残基使用(sdru)(阿尔玛格罗(almagro)，分子识别杂志(jmolrecognit)17:132-43,2004)来描述抗原结合位点，其中特异性决定残基(sdr)是指直接参与抗原接触的免疫球蛋白的氨基酸残基。

卡巴特等人还定义了可变结构域序列的可适用于任何抗体的编号系统。本领域的普通技术人员可以将这一“卡贝特编号”系统明确地分配给任何可变结构域序列，无需依赖超出序列本身的任何实验数据。如在此所使用的，“卡巴特编号”是指由卡巴特等人、美国卫生和公众服务部、“免疫学感兴趣的蛋白序列”(1983)所阐明的编号系统。除非另外说明，否则提及本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物中特定氨基酸残基位置的编号是根据卡巴特编号系统的，然而卡巴特编号系统是理论上的并且可以不等同地应用本发明的每个抗体。例如，取决于第一cdr的位置，以下cdr可以在任一方向上移位。

“框架”或“框架序列”是抗体的可变区内的剩余序列，而不是对抗原结合位点序列定义的那些。因为抗原结合位点的精确定义可以通过如上所述的各种描述来确定，所以确切的框架序列取决于抗原结合位点的定义。

如在此使用的术语“单克隆抗体”(mab)指的是从基本上同质的抗体群获得的抗体(或抗体片段)。单克隆抗体是高度特异性的，典型地其针对单个抗原决定簇。

在一方面中，本发明的抗体是嵌合人类抗体。因此，根据本发明，术语“人类嵌合抗体”、或“人类重组抗体”等用于表示结合分子，其抗原结合特征来源于人类细胞，即其中抗原结合位点来源于核酸，这些核酸产自人类细胞如b细胞、或已经克隆自人类细胞(例如人类记忆b细胞)的mrna的部分cdna。嵌合抗体仍然是“人类的”，即使在该抗体中做了氨基酸取代，例如以改善生物物理或药物代谢动力学特征。相比于人工产生的人类样抗体如来自噬菌体展示抗体文库或异种小鼠的单链抗体片段(scfv)，本发明的嵌合人类抗体被表征为：(i)使用人类免疫应答而不是动物代用物的免疫应答获得的抗原结合区域，即已经产生响应于人体中的其相关构象中的天然tau的抗原结合区域，和/或(ii)受保护的个体或至少对于tau的存在是显著的。

抗体源自人类免疫球蛋白文库或从转基因的动物针对一种或多种人类免疫球蛋白并且不表达内源性免疫球蛋白，如下文所述，例如在美国专利no.5,939,598由k等人是表示为人类-样抗体以区分它们从人类衍生的本发明的抗体。

例如，人类样抗体(如通常分离自噬菌体展示的合成的和半合成的抗体)的重链和轻链的配对不必然反映原始配对，因为它发生在原始人类b细胞中。因此，获得自常用于现有技术的重组表达文库的fab和scfv片段可以被认为是人工的，具有对免疫原性和稳定性的所有可能的相关影响。相比之下，本发明提供了来自选择的人类受试者的亲和力成熟的抗tau抗体的抗原结合区域，在某些实施例中这些抗原结合区域被重组表达为具有共同的igg1恒定区的嵌合体。

如在此所用，术语“功能变体”是指一种抗体，该抗体包含与一种参考抗体的核苷酸和/或氨基酸序列相比通过一个或多个核苷酸和/或氨基酸而改变的一种核苷酸和/或氨基酸序列并且能够与参考抗体为特异性结合到结合伴侣(即tau)而竞争。换句话说，参考抗体的氨基酸和/或核苷酸序列中的修饰不显著影响或改变由该核苷酸序列编码或含有该氨基酸序列的抗体的结合特征，即该抗体仍能够特异性识别并且结合其标靶。功能变体可以具有保守序列修饰，包括核苷酸和氨基酸取代、添加以及缺失。功能变体的实例包括在高变区中使潜在的翻译后修饰的游离半胱氨酸或氨基酸风险降低，以及fc工程改造以增加/降低igg抗体对fcrn的结合亲和力、增加/减少血清半衰期。功能性变体也可以产生该抗体作为人类嵌合或非嵌合igg2、igg3或igg4亚型，或作为不同物种的嵌合或非嵌合亚型。功能性变体还可以是一种突变或恒定区的多个突变，用于增强双特异性抗体形成。这些修饰可以通过本领域中已知的标准技术(如pcr、定点诱变和随机pcr介导的诱变)引入，并且可以包含天然以及非天然核苷酸和氨基酸。

如在此关于一种抗体与其结合伴侣(例如一种抗原)的相互作用所用，术语“特异性结合”或“特异性识别”意指相互作用取决于该结合伴侣上一种具体氨基酸序列或结构(例如一种抗原決定簇或表位)的存在。换句话说，即使当该结合伴侣存在于其他分子或生物体的混合物中时，该抗体也优先结合或识别该结合伴侣。结合可以由共价或非共价相互作用或两者的组合介导。又换句话说，术语“特异性结合”或“特异性识别”意指该抗体与一种抗原決定簇或表位具有特异性免疫反应性并且与其他抗原決定子或表位不具有免疫反应性。(免疫)特异性结合到一种抗原的一种抗体可以按较低亲和力结合到其他肽或多肽，如通过例如放射免疫分析(ria)、酶联免疫吸附分析(elisa)、biacore或本领域中已知的其他分析测定。特异性结合到一种抗原的抗体或其片段可以与携带相同表位的相关抗原具有交叉反应性。优选地，特异性结合到一种抗原的抗体或其片段与其他抗原不交叉反应。

如在此使用的术语“表位”，是指的通过抗体的cdr环而接触的该抗原的一部分。“结构表位”在抗原表面上包含约15-22个接触残基，并且包含与cdr上的大量残基接触的统称为抗体的互补位的许多氨基酸残基。表位和互补位残基之间的直接接触通过静电力(如氢键、盐桥、疏水表面的范德华力)和形状互补性来建立。该界面还结合水分子或其他有助于抗原-抗体相互作用的特异性和亲和力的辅因子。抗原-抗体复合物的结合能主要由表位-互补位界面中的一小子集的接触残基来介导。这些“能量学残基”通常位于表位-互补位界面的中心并且构成该功能性表位。界面周边的接触残基通常对结合能有很小的贡献；它们的替代对与抗原的结合通常几乎没有影响。因此，表位的结合或功能活性涉及位于结构表位中央并由特异性决定cdr接触的能量残基的小子集。可以使用若干种方法(包括丙氨酸扫描诱变或通过用抗体解决抗原的晶体结构)来进行抗原蛋白上功能表位的分配。

表位在性质上可以是线性的或可以是非连续表位，例如构象表位，该构象表位由抗原的非连续氨基酸而不是线性系列氨基酸之间的空间关系形成。构象表位包括由抗原折叠产生的表位，其中来自该抗原的线性序列的不同部分的氨基酸在3维空间中紧密接近。对于非连续表位，有可能获得比所谓的部分表位(例如，分散在该蛋白质序列的不同区域)具有降低的亲和力的一种或多种线性肽的结合(克拉格(cragg)，m.s，(2011)血液(blood)118(2):219-20)。

如在此使用的，术语“亲和力”是指单独表位或部分表位与结合分子(例如，免疫球蛋白分子)的cdr的结合强度的度量；参见例如哈洛(harlow)等人，抗体：实验室手册(antibodies:alaboratorymanual)，冷泉港实验室出版社(coldspringharborlaboratorypress)，第2版，(1988)，第27-28页。如在此使用的，术语“亲合力”是指免疫球蛋白群体与抗原之间的复合物的总体稳定性，即免疫球蛋白混合物与抗原的功能组合强度；参见例如哈洛，第29-34页。亲合力与群体中的单独免疫球蛋白分子与特定表位的亲和力相关，并且还与免疫球蛋白和抗原的效价相关。例如，二价单克隆抗体与具有高度重复表位结构如聚合物的抗原之间的相互作用将是高亲合力的相互作用。抗体对抗原的亲和力或亲合力可以使用任何适合的方法进行实验性地确定；参见例如，berzofsky等人，“抗体-抗原相互作用(antibody-antigeninteractions)”；在基础免疫学中，鲍尔(paul)，w.e.编，纽约瑞文出版社(ravenpressnewyork)，纽约(n.y.)(1984)；库比(kuby)，贾妮斯(janis)，免疫学(immunology)；w.h.弗里曼(freeman)和康帕尼(company)纽约，纽约(1992)，以及本文所述的方法。用于测量抗体对抗原的亲和力的通用技术包括elisa、ria、和表面等离子体共振。如果在不同条件(例如盐浓度、ph)下测量，测量的特定抗体-抗原相互作用的亲和力可以变化。因此，亲和力和其他抗原结合参数(例如kd、ic50)的测量优选地用抗体和抗原的标准化溶液和标准化缓冲液进行。

本发明的抗体或其抗原结合片段或变体还可以依据其特异性检测抗原的存在的能力来描述或指定。术语“检测”(detect或detecting)以最广泛的含义使用以包括靶分子的定量、半定量或定性测量。在一方面中，本文所述的抗体可以例如通过免疫组织化学仅确定生物样品中tau多肽的存在或不存在，并且因此，如通过该方法确定的tau多肽在样品中是可检测的、或者可替代地不可检测的。

本文使用的术语“磷酸特异性抗体”或“磷酸依赖性抗体”意指其中至少部分或全部表位依赖于磷酸化的氨基酸残基的特异性抗体。磷酸特异性或磷酸依赖性抗体不检测未磷酸化的抗原。术语“磷酸选择性抗体”是指优先结合磷酸化的残基并对于磷酸化抗原对非磷酸化抗原具有更高亲和力的特异性抗体。术语“非磷酸选择性抗体”或“磷酸独立性”是指优先结合非磷酸化的残基并对于非磷酸化抗原对磷酸化抗原具有更高亲和力的特异性抗体。在某些实施例中，本发明的这些抗tau抗体、或其抗原结合片段是磷酸依赖性的。在某些其他实施例中，本发明的这些抗tau抗体、或其抗原结合片段是磷酸独立性的。

术语“多核苷酸”旨在包涵单数核酸连同复数核酸，并且是指分离的核酸分子或构建体，例如，信使rna(mrna)或质粒dna(pdna)。多核苷酸可包括常规磷酸二酯键或非常规键(例如酰胺键，诸如在肽核酸(pna)中所发现)。术语“核酸分子”是指存在于多核苷酸中的任何一个或多个核酸节段，例如dna或rna片段。“分离的”核酸或多核苷酸意指已经从其天然环境中去除的核酸分子，即dna或rna。例如，编码包含于载体中的抗体的重组多核苷酸被视为是被分离的用于本发明的这些目的。

在某些实施例中，该多核苷酸或核酸是dna。在dna的情况下，包括编码多肽的核酸的多核苷酸通常可以包括启动子和/或可操作地与一个或多个编码区相关联的其他转录或翻译控制元件。可操作相关联是针对基因产物(例如多肽)的编码区按以下这种方式与一个或多个调控序列相关联，该方式使得该基因产物的表达处于这种或这些调控序列的影响或控制之下。因此，启动子区将可操作地与编码多肽的核酸相关联，只要启动子能够实现所述核酸的转录。该启动子可以是只在预定细胞中引导dna的实质性转录的细胞特异性启动子。除了启动子以外，其他转录控制元件例如增强子、操纵子、阻遏子以及转录终止信号可以可操作地与多核苷酸相关联以便引导细胞特异性转录。在此披露了合适的启动子和其他转录控制区。

如在此使用的，术语“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”都是指治疗性治疗和预防性治疗或预防性措施，其中目的是预防或减慢(减轻)不希望的生理变化或病症，如帕金森综合征或阿尔茨海默病的发展。有益的或所希望的临床结果包括但不限于症状的减轻、疾病的程度减弱、疾病状态稳定(即，未恶化)、疾病进展的延迟或减慢、疾病状态的改善或缓和、以及缓解(无论是部分缓解或完全缓解)，无论是可检测的或不可检测的。“治疗”还可以指存活期相较于未接受治疗时的预期存活期延长。需要治疗的那些包括已患有病症或障碍的那些以及易于患上病症或障碍的那些或其中要预防病症或障碍的表现的那些。如本文使用的“药物”是用于治疗不期望的生理变化或病症的药剂。

“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物，”是指希望诊断、预后、预防或治疗的任何受试者，特别是哺乳动物受试者(例如人类患者)。

描述

tau是一种具有多个熟知的亚型的丰富的中枢神经系统和周围神经系统蛋白。在人类cns中，由于可变剪接，存在尺寸范围从352至441的六种主要tau亚型(汉格(hanger)等人，分子医学趋势(trendsmolmed)15:112-9,2009)。这些亚型通过调节包含0-2个n-末端插入物、以及3或4个串联排列的微管结合重复而彼此不同，并且被称为on3r(seqidno:6)、1n3r(seqidno:4)、2n3r(seqidno:2)、on4r(seqidno:5)、1n4r(seqidno:3)以及2n4r(seqidno:1)。如本文使用的术语“重组tau”是指缺乏磷酸化和其他翻译后修饰的seqidno:1的tau亚型。该tau蛋白能够以高的量，例如，在大肠杆菌、杆状病毒、哺乳动物或无细胞系统中重组表达。“重组tau”可以使用标准方法重组表达并纯化。(巴格霍恩等人，2004，分子生物学方法(methmolbiol)35-51)。

tau结合微管并调节货物通过细胞的运输，这是可以通过在79个潜在丝氨酸(ser)和苏氨酸(thr)磷酸化位点中的许多处发生的tau磷酸化来调节的过程。在脑发育期间，tau是高度磷酸化的。在成人期，磷酸化的程度下降。一些磷酸化位点位于tau的微管结合结构域内，并且已经显示，tau磷酸化的增加负向调节微管的结合。例如，位于微管结合基序内或邻近处的ser262和ser396在异常成对螺旋纤丝(phf)的tau蛋白中是过度磷酸化的，该异常成对螺旋纤丝是ad患者脑中的神经原纤维缠结(nft)的主要组分。phf是tau蛋白的丝状聚集体，这些丝状聚集体异常地被过度磷酸化，并且可以用特异性抗tau抗体染色并通过光学显微镜检测。这同样适用于所谓的直的tau纤丝。phf形成扭曲带，这些扭曲带由以约80nm的周期性彼此缠绕的两条纤丝组成。这些病理特征通常被称为“tau-病变”、“tau病变”或“tau相关病变”。对于tau蛋白病变的神经病理学特征的更详细的描述参考李(lee)等人，神经科学年鉴(annu.rev.neurosci.)24(2001),1121-1159和格茨脑研究综述(brain.res.rev.)35(2001),266-286，将其披露内容通过引用结合在此。生理学tau蛋白使神经元中的微管稳定化。病理磷酸化导致异常的tau定位和聚集，这导致微管的不稳定和受损的细胞转运。聚集的tau在体外是神经毒性的(克里斯图诺娃(khlistunova)等人，生物化学杂志(j.biol.chem.)281(2006),1205-1214)。然而，确切的神经毒性物种仍然不清楚，因为它们导致神经元死亡的机制仍然不清楚。tau的聚集可以作为许多tau蛋白病变中的神经原纤维缠结(nft)的主要成分而观察到，这些tau蛋白病变例如阿尔茨海默病(ad)、额颞痴呆、核上性麻痹、皮克氏病、嗜银颗粒疾病(agd)、皮质基底节变性、ftdp-17、帕金森氏病、拳击员痴呆(综述于金德伦(gendron)和petrucelli，分子神经变性(mol.neurodegener.)4:13(2009)中)。除了这些观察，证据表明，甚至在不存在缠结形成下，tau介导的神经元死亡可以发生。可溶性磷酸-tau种类存在于csf中(阿路易斯(aluise)等人，生物化学与生物物理学学报(biochim.biophys.acta.)1782(2008),549-558)。tau聚集可以传输从细胞的外部至内部的错误折叠状态并且可以在共培养细胞之间转移(弗罗斯特(frost)等人，生物化学杂志(j.biol.chem.)284(2009),12845-12852)。

除了神经变性tau蛋白病变的参与，缺血/再灌注期间和之后以及震荡头损伤之后tau磷酸化中观察到的改变表明，tau、以及在慢性创伤性脑病中发现的tau的变化、在具有创伤性脑损伤(tbi)的脑震荡运动员和退伍军人中的tau蛋白病变在神经血管疾病(如，缺血性中风)的神经元损伤和临床病理生理学中起着关键作用(郑(zheng)等人，细胞生物化学杂志(j.cell.biochem.)109(2010),26-29)。

本发明提供了单克隆抗体，其中这些抗体结合人类ad脑组织中的tau沉积物。

在某些实施例中，这些抗体a)结合人类ad脑组织中的tau沉积物；并且b)不结合正常脑组织中的tau。

在某些实施例中，这些抗体a)结合人类ad脑组织中的tau沉积物，b)不结合正常人类脑组织中的tau，并且c)不结合进行性核上性麻痹(psp)脑组织中的tau沉积。

在某些实施例中，这些抗体：a)与人类ad脑组织中的tau沉积形成免疫复合物，并且b)不与正常人类脑组织中的tau形成免疫复合物。

在某些实施例中，这些抗体是嵌合抗体。

在某些实施例中，这些抗体是嵌合抗体，这些嵌合抗体包含来自人类抗体的抗原结合可变区、以及人类igg1的重组恒定区，该抗原结合可变区特异性结合tau，并且其中这些嵌合抗体不同于人类抗体。

在某些实施例中，这些抗体是嵌合抗体，这些嵌合抗体包含来自人类抗体的抗原结合可变区、以及人类igg1的重组恒定区，该抗原结合可变区特异性结合tau，其中该嵌合抗体的恒定区不同于人类抗体的恒定区。

在某些实施例中，这些抗体是嵌合抗体，这些嵌合抗体包含天然存在的人类抗原结合可变区、以及人类igg1抗体的重组恒定区，该人类抗原结合可变区特异性结合tau。

在某些实施例中，这些抗体是嵌合抗体，这些嵌合抗体包含来自人类抗体的天然存在的人类轻链和重链可变区、以及重组人类igg1重链和轻链恒定区。

在某些实施例中，这些抗体是嵌合抗体，这些嵌合抗体包含来自天然存在的人类抗体的重链和轻链可变区、以及重组人类igg1重链和轻链恒定区。

在某些实施例中，这些抗体是嵌合抗体，这些嵌合抗体包含来自人类抗体的重链和轻链可变区、以及重组人类igg1重链和轻链恒定区。

在某些实施例中，这些抗体不是天然存在的。

本文公开的这些人类抗tau抗体特异地结合tau及其表位，并且结合tau及其表位的多种构象。例如，本文公开了特异性结合病理学修饰的tau亚型和tau聚集体的抗体。在一个实例中，本文公开的tau抗体结合tau或其表位，并且对于其他蛋白质，在约3倍背景以上不显示结合。“特异性结合”或“选择性结合”tau构象异构体的抗体是指不结合tau的所有构象，即不结合至少一种其他tau构象异构体(如，重组tau)的抗体。

本发明的嵌合抗tau单克隆抗体的可变结构域可以来源于显示tau特异性免疫应答的健康人类受试者库或来源于被阿尔茨海默病侵染的受试者。本发明的这些tau抗体也可以称为“人类来源的抗体”，以强调那些抗体抗原结合区域确实由受试者表达，并且没有从例如表达人类免疫球蛋白的噬菌体文库中分离，该噬菌体文库迄今为止表示试图提供人类样抗体的一种常用方法。例如，本发明的这些抗体不同于mabat8、mc1和at100，因为它们是人类来源的抗体。

本发明的抗tau抗体可以表征为它们与重组tau在elisa中的结合特性。从大肠杆菌纯化的重组tau由于其亲水性而高度可溶。它缺乏在tau蛋白病变中发现的tau特征性的ser、thr和tyr残基的磷酸化。在本发明的一个实施例中，本文公开的抗tau单克隆抗体在elisa中不特异性结合重组tau。在本发明的另一个实施例中，这些抗tau单克隆抗体在elisa中结合重组tau。

在一个实施例中，本发明的抗tau抗体已经显示特异性结合seqidno:315或seqidno:365的非磷酸化tau肽。在另一个实施例中，本发明的抗tau抗体已经显示结合seqidno:317的磷酸化tau肽和seqidno:318的非磷酸化tau肽两者或seqidno:329的磷酸化tau肽和seqidno:367的非磷酸化tau肽两者。

本文公开的抗tau抗体在某些实施例中在肽elisa中特异性结合tau肽。在一个实施例中，抗tau抗体结合tau肽，例如gtpgsrsrtpslptpptr(seqidno:318)，对应于tau441的氨基酸204-221。在另一个实施例中，抗tau抗体结合tau肽，例如geppksgdrsgysspgspgtpgsrsrtpslptpptrepkkvavvrtppkspssaksrlqtapvpmpdl(seqidno:367)，对应于tau441的氨基酸221-253。本发明的抗tau抗体不同于先前公开的人类抗tau单克隆抗体(us20130295021)，该人类抗tau单克隆抗体已经报道结合不同tau肽。单克隆抗体ni-105.4e4、ni-105.4a3和ni-105.4e4分别结合tau441的329-351+387-397、337-343、以及35-49。

本发明的抗tau抗体可以表征为它们与phf-tau在elisa中的结合特性。抗phf-tau抗体克隆at8与phf-tau结合，并且已广泛用于检测来自阿尔茨海默病患者的样品中的神经原纤维缠结中的phf-tau。at8是磷酸特异性单克隆抗体，并且结合phf-tau的磷酸化ser202和thr205，并且被广泛公开用于elisa、免疫组织化学、免疫印迹、蛋白质印迹以及相关应用。克隆at8通过elisa识别阿尔茨海默病tau、以及phf-tau，并且不结合来自健康个体的非磷酸化tau或重组tau。在一个实例中，本发明的抗tau抗体不通过elisa结合phftau。在另一个实例中，本发明的抗tau抗体通过elisa结合phftau。

本发明的抗tau抗体可以通过蛋白质印迹被表征为它们与phf-tau和重组tau的结合特性。在神经变性障碍中，若干种机制(磷酸化、泛素化、氧化、糖化)参与tau蛋白聚集成phf。这些病理性tau蛋白通过蛋白质印迹可视化为在55kda和69kda之间的三个主要条带和在74kda处的一个次要条带。tau55来自最短亚型(seqidno:6)的磷酸化，tau64来自具有一个盒式外显子的tau变体(seqidno:4和/或seqidno:5)的磷酸化，tau69来自具有两个盒式外显子的tau变体(seqidno:2和/或seqidno:3)的磷酸化。最长的tau亚型(seqidno:1)的磷酸化诱导另外的过度磷酸化的tau74变体的形成。在某些实施例中，这些抗tau抗体通过蛋白质分析结合phftau。

抗tau抗体可以用于并表征为来自正常或ad脑的组织切片的免疫组织化学(ihc)。具体地，磷酸tau抗体突出了具有高度灵敏度和特异性的神经原纤维病变，而在正常健康的脑中没有观察到tau的检测。临床病理研究已经证明，与淀粉样蛋白-β积累相比，磷酸tau沉积或积累更紧密地对应临床征象，并且以逐步方式从经口到边缘区域、到异皮质区域进展，从而形成ad分期的基础(r.j.卡斯泰拉尼(castellani)等人，神经病理学报(伯尔)(actaneuropathol(柏林))111,503(2006)；h.布拉克和e.布拉克，神经病理学报(柏林)82,239(1991))。经常用于免疫组织化学的tau单克隆抗体包括at8(p202/p205tau)、at180(p231tau)、at270(p181tau)、at100(pt212和s214)、以及mc-1(默克(mercken)m等人，1992神经病理学报(actaneuropatho)84:265-272；郑(zheng)-fischhofer1998欧洲生物化学杂志(eurjbiochem)252:542-552；古德特(goedert)m等人，1994生物化学杂志(biochemj)301:871-877)。在一个实施例中，本发明的这些抗tau单克隆抗体检测正常(即，健康)人类脑组织中的tau并且检测人类ad脑组织中的tau沉积物。在另一个实例中，本发明的这些抗tau抗体检测人类ad脑中的tau沉积物并且不检测正常人类脑中的tau。

本发明的抗tau抗体还可以用于并表征为另外的tau蛋白病变的免疫组织化学，这些tau蛋白病变包括进行性核上性麻痹、皮克氏病以及其他疾病。psp中的病理性丝状tau内含物由异常磷酸化的tau蛋白组成，但是存在异常4rtau亚型的优先积累。一系列抗tau单克隆抗体(包括alz50、tau-2、t46、phf-1、phf-6、12e8、phf-1、rd4和at8)已用于表征psp沉积物(神经病理学和实验神经学杂志(jneuropatholexpneurol.)1998(6):588-601)。所有的单克隆抗体染色神经内膜和神经胶质内含物，但是，12e8和phf-6染色较少强度。这些抗体检测tau的不同表位，例如磷酸特异性、亚型特异性，并且还检测ad脑中的tau沉积物。rd3，一种特异性检测3重复tau亚型的抗tau单克隆抗体，显示有限的psp的ihc检测，但是强烈地染色人类ad脑组织中的tau沉积物。通过该抗体对psp的有限检测是由于psp中3-重复tau亚型的水平的降低(德席尔瓦(desilva)，r.等人，神经病理学与应用神经生物学(neuropathandapplneurobio)(2003)29(3)288-302)。在一个实施例中，本发明的这些抗tau抗体检测人类ad脑中的tau沉积物并且不检测正常人类脑中的tau并且不检测人类psp脑中的tau沉积物。

在某些实施例中，该抗体包含一条重链，该重链包含：a)seqidno:163的重链cdr1区、seqidno:164的重链cdr2区、和seqidno:165的重链cdr3区，b)seqidno:169的重链cdr1区、seqidno:170的重链cdr2区、和seqidno:171的重链cdr3区，c)seqidno:175的重链cdr1区、seqidno:176的重链cdr2区、和seqidno:177的重链cdr3区，d)seqidno:181的重链cdr1区、seqidno:182的重链cdr2区、和seqidno:183的重链cdr3区，e)seqidno:185的重链cdr1区、seqidno:186的重链cdr2区、和seqidno:187的重链cdr3区，f)seqidno:190的重链cdr1区、seqidno:191的重链cdr2区、和seqidno:192的重链cdr3区，g)seqidno:196的重链cdr1区、seqidno:197的重链cdr2区、和seqidno:198的重链cdr3区，h)seqidno:213的重链cdr1区、seqidno:214的重链cdr2区、和seqidno:215的重链cdr3区，i)seqidno:219的重链cdr1区、seqidno:220的重链cdr2区和seqidno:221的重链cdr3区。在某些实施例中，该抗体包含一条轻链，该轻链包含：a)seqidno:166的轻链cdr1区、seqidno:167的轻链cdr2区、和seqidno:168的轻链cdr3区，b)seqidno:172的轻链cdr1区、seqidno:173的轻链cdr2区、和seqidno:174的轻链cdr3区，c)seqidno:178的轻链cdr1区、seqidno:179的轻链cdr2区、和seqidno:180的轻链cdr3区，d)seqidno:172的轻链cdr1区、seqidno:173的轻链cdr2区、和seqidno:184的轻链cdr3区，e)seqidno:188的轻链cdr1区、seqidno:173的轻链cdr2区、和seqidno:189的轻链cdr3区，f)seqidno:193的轻链cdr1区、seqidno:194的轻链cdr2区、和seqidno:195的轻链cdr3区，g)seqidno:199的轻链cdr1区、seqidno:173的轻链cdr2区、和seqidno:200的轻链cdr3区，h)seqidno:216的轻链cdr1区、seqidno:173的轻链cdr2区、和seqidno:217的轻链cdr3区，以及i)seqidno:218的轻链cdr1区、seqidno:173的轻链cdr2区和seqidno:217的轻链cdr3区。

在某些实施例中，该抗体选自下组，该组由以下各项组成：a)一种抗体，该抗体包含seqidno:163的重链cdr1区、seqidno:164的重链cdr2区、和seqidno:165的重链cdr3区，seqidno:166的轻链cdr1区、seqidno:167的轻链cdr2区和seqidno:168的轻链cdr3区；b)一种抗体，该抗体包含seqidno:169的重链cdr1区、seqidno:170的重链cdr2区、和seqidno:171的重链cdr3区，seqidno:172的轻链cdr1区、seqidno:173的轻链cdr2区和seqidno:174的轻链cdr3区；c)一种抗体，该抗体包含seqidno:175的重链cdr1区、seqidno:176的重链cdr2区、和seqidno:177的重链cdr3区，seqidno:178的轻链cdr1区、seqidno:179的轻链cdr2区和seqidno:180的轻链cdr3区；d)一种抗体，该抗体包含seqidno:181的重链cdr1区、seqidno:182的重链cdr2区、和seqidno:183的重链cdr3区，seqidno:172的轻链cdr1区、seqidno:173的轻链cdr2区和seqidno:184的轻链cdr3区；e)一种抗体，该抗体包含seqidno:185的重链cdr1区、seqidno:186的重链cdr2区、和seqidno:187的重链cdr3区，seqidno:188的轻链cdr1区、seqidno:173的轻链cdr2区和seqidno:189的轻链cdr3区；f)一种抗体，该抗体包含seqidno:190的重链cdr1区、seqidno:191的重链cdr2区、和seqidno:192的重链cdr3区，seqidno:193的轻链cdr1区、seqidno:194的轻链cdr2区和seqidno:195的轻链cdr3区；g)一种抗体，该抗体包含seqidno:196的重链cdr1区、seqidno:197的重链cdr2区、和seqidno:198的重链cdr3区，seqidno:199的轻链cdr1区、seqidno:173的轻链cdr2区和seqidno:200的轻链cdr3区；h)一种抗体，该抗体包含seqidno:213的重链cdr1区、seqidno:214的重链cdr2区、和seqidno:215的重链cdr3区，seqidno:216的轻链cdr1区、seqidno:173的轻链cdr2区和seqidno:217的轻链cdr3区；i)一种抗体，该抗体包含seqidno:213的重链cdr1区、seqidno:214的重链cdr2区、和seqidno:215的重链cdr3区，seqidno:218的轻链cdr1区、seqidno:174的轻链cdr2区和seqidno:217的轻链cdr3区；j)一种抗体，该抗体包含seqidno:219的重链cdr1区、seqidno:220的重链cdr2区、和seqidno:221的重链cdr3区，seqidno:218的轻链cdr1区、seqidno:173的轻链cdr2区和seqidno:217的轻链cdr3区。

在某些实施例中，该抗体包含选自下组的重链可变区，该组由以下各项组成：seqidno:87、91、95、99、103、107、111、123、127和131的氨基酸序列。在某些实施例中，该抗体包含选自下组的轻链可变区，该组由以下各项组成：seqidno:88、92、96、100、104、108、112、124、128和132的氨基酸序列。

在某些实施例中，提供了以上描述的抗体的抗原结合片段。这些抗原结合片段优选地结合到相同表位。与已知的人类抗tau抗体的表位相比，本发明的抗tau单克隆抗体和抗原结合片段结合不同的表位，例如，ni-105.4e4和ni-105.4a3。结合到一种不同表位意指该抗体与已知抗体相比结合到不同的关键氨基酸残基。

在某些实施例中，这些抗体当与结合到tau蛋白的其他抗体组合使用时协同地起作用。如在此所用，术语“协同”意指这些抗体或抗原结合片段当组合使用时的组合效应大于其当单独地使用时的叠加效应。一种计算协同作用的方式是借助于组合指数。组合指数(ci)的概念已经由周(chou)和塔拉利(talalay)(酶调节进展(advenzymeregul.)，22:27-55,1984)进行了描述。

在某些实施例中，这些抗体和抗原结合片段用作一种药剂，并且优选地用于诊断性、治疗性和/或预防性治疗神经变性疾病。本发明的人类抗tau抗体或其片段(包括fab、(fab')2、scfv片段)或包含本发明抗体的抗原结合位点的抗体可用于治疗、减轻或预防患有神经变性疾病的患者的症状，该神经变性疾病涉及脑内的tau累积或病理性tau或tau聚集，例如患有ad的患者以及任何其他tau蛋白病变或其中tau可能过表达的其他tau相关病变。尽管不希望受任何具体理论的束缚，本发明的这些抗体可以通过减少或消除病理性tau或tau聚集和脑中phf-tau的量而发挥其有益效果。本发明的这些抗体可以用于治疗属于任何分类的动物患者。此类动物的实例包括哺乳动物，例如人类、啮齿类动物、狗、猫和家畜。例如，本发明的这些抗体在制备用于治疗ad的药物中是有用的，其中该药物被制备用于以本文定义的剂量给予。

本发明的另一个实施例是一种在对其有需要的患者中减少tau聚集的方法，该方法包括向该患者给予治疗有效量的本发明的分离的抗体足够的时间以减少tau聚集。本发明的另一个实施例是一种治疗或减轻神经变性疾病的症状的方法，该神经变性疾病涉及患者中的tau聚集，该方法包括向患者给予治疗有效量的本发明的分离的抗体持续足够的时间以治疗或减轻该神经变性疾病的症状。本发明的另一个实施例是一种减少对其有需要的患者中的tau的方法，该方法包括向该患者给予治疗有效量的本发明的分离的抗体持续足够的时间以减少tau。

在任何以上实施例中，涉及tau聚集的该神经变性疾病是tau蛋白病变。如本文所用的“tau蛋白病变”涵盖涉及tau在脑内的病理聚集的任何神经变性疾病。除了家族性和散发性ad，其他示例性tau蛋白病变是与17号染色体连锁的帕金森综合征的额颞痴呆(ftdp-17)、进行性核上性麻痹、皮质基底节变性、皮克氏病、进行性皮层下神经胶质增生、缠结仅痴呆、扩散神经原纤维缠结与钙化、嗜银颗粒痴呆、肌萎缩性侧索硬化、帕金森-痴呆复合、唐氏综合征、吉斯特曼-斯召斯列疾病、哈-斯二氏病、包涵体肌炎、克-雅病、多系统萎缩、尼曼-皮克病类型c、朊病毒蛋白大脑淀粉样血管病、亚急性硬化性全脑炎、强直性肌营养不良、具有神经原纤维缠结的nonguanamian运动神经元疾病、脑炎后帕金森综合征、以及慢性创伤性脑病(如，痴呆拳击手(拳击病(boxingdisease))。(莫里斯(morris)等人，神经元(neuron)70:410-26,2011)。

tau蛋白病变相关的行为表型包括认知缺损、早期人格改变和去抑制、情感淡漠、意志缺失、缄默、失用症、持续言语、刻板运动/行为、高度口头、无组织化、无法计划或组织连续任务、自私/冷漠、反社会性状、缺乏同情、迟疑不决、具有频繁错语错误但相对保守的理解的语法错乱言语、受损的理解和字词寻找缺陷、慢性进行性步态不稳、反步症、冷淡、频繁跌倒、非左旋多巴响应轴向刚度、核上注视麻痹、方形急跳、缓慢垂直扫视、假延髓性麻痹、肢体失用、肌张力障碍、皮层感觉丧失以及震颤。

适于治疗的患者包括具有ad或其他tau蛋白病变风险的无症状个体、以及目前显示症状的患者。适于治疗的患者包括具有已知的ad遗传风险，例如ad的家族史或基因组中存在遗传风险因子的个体。示例性风险因子是淀粉样前体蛋白(app)中，特别是在位置717以及位置670和671处的突变(分别为哈迪(hardy)突变和瑞典(swedish)突变)。其他风险因子是早老素基因(ps1和ps2)以及apoe4、高胆固醇血症或动脉粥样硬化家族史的突变。通过上述风险因子的存在，可以从特征性痴呆中识别目前患有ad的个体。此外，多种诊断测试可用于识别患有ad的个体。这些包括脑脊液tau和aβ42水平的测量。升高的tau和降低的aβ42水平表示ad的存在。还可以通过ad和相关疾病协会标准来诊断患有ad的个体。

本发明的另一个实施例是一种减少对其有需要的患者中的tau的方法，该方法包括向该患者给予治疗有效量的本发明的分离的抗tau抗体持续足够的时间以减少tau。适于治疗的患者可能患有与tau的过表达相关的疾病。一些突变(包括内含子10中的突变)诱导功能正常的四重复tau蛋白亚型的水平增加，这导致神经变性。四重复人类tau蛋白亚型特异性地在转基因小鼠中的神经元中的过表达导致脑和脊髓中的轴突变性的发展。在该模型中，记录了具有神经丝、线粒体和囊泡的积累的轴突扩张。轴突病变和伴随的功能障碍感觉运动能力是转基因-剂量相关的。这些发现证明，仅增加四重复tau蛋白亚型的浓度而不形成神经元内神经原纤维缠结足以损伤中枢神经系统中的神经元(spittaels等人，美国病理学杂志(amjpathology)155(6)2153-2165,1999)。

给药/药物组合物

本发明的抗tau抗体适合作为用于治疗或预防神经变性疾病的治疗剂和预防剂，该神经变性疾病涉及tau的积累、和/或tau的病理性聚集，例如ad或其他tau蛋白病变或tau相关疾病。在无症状患者中，治疗可以在任何年龄开始，例如，在约10、15、20、25、30岁。然而，通常，直到患者达到约40、50、60或70岁之前无需开始治疗。在一段时间内治疗通常需要多个剂量。可以通过随时间测定抗体或活化的t细胞或b细胞对治疗剂的响应来监测治疗。如果该响应下降，指示加强剂量。

在预防性应用中，向患者(该患者易感于或另外处于涉及tau的ad或其他疾病的风险中)以足以消除或减少该风险、减轻该疾病的严重程度或延迟其发作的量给予药物组合物或药物，该疾病包括疾病的生物化学的、组织学和/或行为的症状，在该疾病的发展期间存在的并发症和中间病理性表型。在治疗性应用中，向患者(该患者被怀疑患有或已经患有此类疾病)以足以减少、抑制或延缓任何该疾病的症状(生物化学的、组织学的、和/或行为的)的量给予组合物或药物。给予治疗剂可以减少或消除尚未发展特征性阿尔茨海默病变的患者的轻度认知缺损。将适于完成治疗性或预防性治疗的量定义为治疗学有效剂量或预防性有效剂量。在预防和治疗方案两者中，组合物或药物通常以几种剂量给予直到达到足够的免疫应答。

本发明的抗tau抗体或其片段可以与对治疗相关神经变性疾病有效的其他试剂组合给予。在ad的情况下，本发明的抗体可以与减少或防止淀粉样蛋白β(aβ)沉积的试剂组合给予。有可能的是，phf-tau和aβ病变是协同的。因此，同时靶向phf-tau和aβ相关病变两者的清除的联合治疗可能比各自单独地靶向更有效。

在帕金森病和相关的神经变性疾病的情况下，对α-突触核蛋白蛋白质的清晰聚集形式的免疫调节也是一种新兴的疗法。靶向tau和α-突触核蛋白蛋白质两者的清除的组合疗法可能比单独靶向蛋白质更有效。在本发明的这些方法中，在治疗或改善tau蛋白病变的症状中的抗体的“治疗有效量”可以通过标准研究技术确定。例如，可以通过将药剂施用于本领域熟知的相关动物模型来确定该抗体的剂量。

此外，体外测定可任选地用于帮助确定最佳剂量范围。基于对若干因素的考虑，本领域技术人员可以确定(例如，通过临床试验)具体有效剂量的选择。这些因素包括待治疗或预防的疾病、所涉及的症状、患者的体重、患者的免疫状态以及本领域技术人员已知的其他因素。配制品中采用的精确剂量还将取决于给药途径和疾病的严重性，并且应当根据执业医师的判断和每一患者的情况来决定。可从来源于体外或动物模型测试系统的剂量-反应曲线外推出有效剂量。本发明的抗体的治疗性用途的给药方式可以是将试剂递送至宿主的任何合适途径。这些抗体的药物组合物对于胃肠外给药，例如皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内或颅内给药是有用的，或者它们可以给予进脑或脊柱的脑脊液中。

本发明的这些抗体可以制备为药物组合物，该药物组合物包含有效量的抗体作为药学上可接受的载体中的活性成分。术语“载体”是指与抗体一起给予的稀释剂、佐剂、赋形剂或运载体。此类药学运载体可以是液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成起源的那些油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。例如，可以使用0.4％盐水和0.3％甘氨酸。这些溶液是无菌的，通常不含颗粒物质。它们可通过常规的公知灭菌技术(例如过滤)进行灭菌。这些组合物可以含有接近生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，诸如ph调节剂和缓冲剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂以及着色剂等。本发明的抗体在这种药物配制品中的浓度可以广泛变化，即按重量计从小于约0.5％、通常为或至少约1％到多达15％或20％，并且将根据选择的具体给药方式主要基于所需的剂量、流体体积、粘性等进行选择。

可以以单剂量方案或作为多剂量方案给出治疗，其中治疗的初级过程可以有1-10个单独剂量，此后在后续的时间间隔中给予其他剂量，该时间间隔需要保持和/或强化应答，例如二次剂量在1-4个月时，且若需要时，在数月后给予后续剂量。适合的治疗方案的实例包括：(i)0、1个月和6个月，(ii)0、7天和1个月，(iii)0和1个月，(iv)0和6个月，或其他足以引起期望减少疾病症状或降低疾病严重性的所希望的响应。因此，用于肌内注射的本发明的药物组合物可被制备以含有1ml无菌缓冲水，以及约1ng至约100mg、约50ng至约30mg或约5mg至约25mg之间的本发明的抗体。类似地，用于静脉内输注的本发明的药物组合物可被制造以包含约250ml的无菌林格氏溶液以及约1mg至约30mg或约5mg至约25mg的本发明的抗体。用于制备胃肠外给予的组合物的实际方法是众所周知的，并且详细描述于例如“雷明顿的药物科学(remington'spharmaceuticalscience)”，第15版，麦克出版公司(mackpublishingcompany)，伊斯顿(easton)，宾夕法尼亚州(pa)中。

本发明的这些抗体可以冻干用于储存，并在使用前重构于适合的载体中。已经显示该技术对于抗体和其他蛋白质制剂是有效的，并且可以使用本领域已知的冻干和重构技术。

诊断方法和试剂盒

本发明的抗体可以用于诊断受试者中的ad或其他tau蛋白病变的方法中。该方法涉及在受试者中使用诊断试剂(诸如本发明的抗体或其片段)检测tau的存在。通过使生物样品与诊断抗体试剂接触，并且检测该诊断抗体试剂与来自受试者的样品中的phf-tau的结合，可以在来自受试者的生物样品(例如，血液、尿液、脑脊髓液)中检测tau。用于进行检测的测定包括熟知的方法，诸如elisa、免疫组织化学、蛋白质印迹法或体内成像。示例性诊断抗体是本发明的抗体cbtau7.1、cbtau-8.1、cbtau-16.1、cbtau-18.1、cbtau-20.1、cbtau-22.1、cbtau-24.1、cbtau-41.1、cbtau-41.2和cbtau-42.1，并且属于iggl,k类型。

诊断抗体或类似试剂可通过静脉内注射给予到患者体内，或通过将试剂递送到如上所例示的宿主的任何适合途径直接给予到脑中。抗体的剂量应在与治疗方法相同的范围内。典型地，抗体被标记，尽管在一些方法中对tau具有亲和力的第一抗体是未标记的，并且使用第二标记试剂来结合该第一抗体。标记的选择取决于检测手段。例如，荧光标记适合于光学检测。顺磁标记的使用适合于无手术干预的断层成像检测。也可以使用pet或spect检测放射性标记。

通过将来自受试者或受试者中的样品中的标记的tau、tau累积、tau聚集和/或神经原纤维缠结的数量、大小、和/或强度与对应的基线值进行比较来进行诊断。这些基线值可以表示未患病个体的群体中的平均水平。基线值还可以表示在同一受试者中确定的先前水平。

上述这些诊断方法还可以用于通过在治疗之前、期间或之后检测受试者中tau的存在来监测受试者对治疗的应答。相对于基线的值的变化表示对治疗的应答。当病理性tau从脑中清除时，值也可以在生物流体中暂时改变。

本发明进一步涉及用于进行上述诊断和监测方法的试剂盒。通常，这样的试剂盒包含诊断试剂，诸如本发明的这些抗体、和任选的可检测标记。诊断抗体本身可以包含该可检测标记(例如，荧光分子、生物素等)，该可检测标记是通过二级反应(例如，与链霉亲和素的反应)直接可检测的或可检测的。可替代地，可以使用含有该可检测标记的第二试剂，其中该第二试剂对第一抗体具有结合特异性。在适于测量生物样品中的tau的诊断试剂盒中，该试剂盒的抗体可以预先结合到固相，例如结合到微量滴定盘的孔中而提供。

在本申请全文中引用的所有引用的参考文献(包括参考文献、授权专利、公开的专利申请和共同未决的专利申请)的内容通过引用明确地并入本文。

实例

实例1

tau肽设计和标记

导致从微管释放并导致解聚的tau蛋白的过度磷酸化是在阿尔茨海默病(ad)和其他相关tau蛋白病变中存在的病理学标志。由于游离tau与微管结合的tau的平衡有利于前者，认为未结合的tau蛋白以错误折叠的聚集状态积累。在疾病过程中，tau被认为采取多种构象从可溶性二聚体和寡聚体形式发展为更高级的不溶性聚集体，诸如成对螺旋纤丝(phf)和神经原纤维缠结(nft)。然而，有助于病理学并因此是治疗靶向的最佳的tau的确切形式仍然是未知的。因此，促进靶标疾病的tau的尝试通常受到靶标的选择的限制。为了制备新的抗tau结合分子，使用磷酸化和非磷酸化tau肽作为诱饵抗原，使用基于单细胞的方法从人类记忆b细胞中回收对tau的抗体可变区。

对tau的人类记忆b细胞在人类抗体库中可能是罕见的；因此，我们决定用最亮的荧光团标记tau诱饵。用氨基末端生物素基团合成所有tau肽，以用两个亮荧光团、链霉亲和素-apc或链霉亲和素-pe(也称为tau肽四聚体)辅助标记。在筛选来自供体样品的人类记忆b细胞(实例2中详述)期间，用两个荧光团标记每个tau肽以增加信噪比。通过将肽与链霉亲和素标记的摩尔比为35:1的生物素化的肽在4℃下温和混合过夜混合来制备标记的tau肽四聚体。通过在biospin30柱(伯乐公司(biorad))上分离来除去游离肽。将所有tau肽四聚体在4℃下储存长达2个月。

实例2

通过用标记的肽四聚体分选的fac来回收抗tau特异性记忆b细胞

针对tau的单克隆抗体回收自记忆b细胞(cd22+cd19+cd27+igg+)，这些记忆b细胞分离自外周血单核细胞(pbmc)，这些外周血单核细胞获得自从圣地亚哥血库(sandiegobloodbank)和tsri正常血液供体服务获得的推测无症状(非ad)人类血液供体。此外，ad患者血液样品通过cro、昆泰公司(quintiles)获得，从中回收了在此详述的三种抗体。在ficoll-paqueplus(ge医疗公司)上分离pbmc，并在90％fbs和10％dmso中以5千万个细胞/ml进行深冷保存。将等分试样的血浆在56℃下热灭活并储存在-20℃下，用于血浆反应性的下游评估。

对于每个分选实验，将来自3-4个供体的pbmc解冻并转移到含有完全预热的rpmi(rpmi，10％热灭活的fbs和1％青霉素/链霉素)的试管中，洗涤并单独在37℃下孵育16hr。通过使用cd22+磁珠(美天旎生物技术公司(miltenyibiotec))进行阳性选择来使合并的pbmc富集用于成熟的b细胞。将细胞重悬于含有2mmedta和0.25％牛血清白蛋白馏分v(tbs缓冲液)的tris-缓冲盐水ph7.4中。将这些细胞用细胞外标记物igg-fitc、cd19-percpcy5.5和cd27-pecy7(均来自bd生物科学公司)进行染色以标记b细胞。去除一千万个细胞，并使用生物素、链霉亲和素标记的缀合物作为阴性对照。将剩余的细胞与10个双标记的tau肽四聚体(sa-apc和sa-pe)的库(每个为16.8nm)一起孵育。将细胞在4℃下温和混合孵育60min，洗涤两次，并在tbs缓冲液中以2千万细胞/ml进行重悬。在分选之前，添加dapi(赛默飞世尔公司(thermofisher))作为活细胞标记物，并在贝克曼库尔特(beckmancoulter)mofloxdp上分选细胞。阴性对照样品用于测定非特异性结合和信噪比。收集cd19+、igg+、cd27hi和抗原双阳性细胞，并将其沉积到96孔pcr板的各孔中并在-80℃下储存。

实例3

从tau特异性单个b细胞中回收重链和轻链基因

如实例2中详述的，鉴定、分离具有对tau肽四聚体的反应性的记忆b细胞，并分选到单个微量滴定孔中。然后通过两步pcr方法从单个b细胞中回收重链和轻链cdna，并克隆可变结构域序列并在体外作为全长重组igg1抗体表达，并且因此是人类嵌合抗体。

第一链cdna合成

根据制造商的方案(superscriptiii，英杰公司)从单个分选的细胞产生第一链互补dna(cdna)，该方案具有以下修改：向每个含有单个b细胞、0.5μl的10％np-40、1.0μl的寡dt的孔中添加1.0μl的dntp，并将样品在65℃孵育5min。孵育后，将样品置于冰上1min。然后向每孔中加入以下：2.0μl的dtt、4.0μl的mgcl2、1.0μl的superscriptrt、和0.5μl的rnaseout。将样品在50℃下孵育50min，随后在85℃下孵育5min。

步骤i扩增

对于初始pcr(步骤i)，使用2.5μl的cdna制剂作为模板来扩增重链和κ或λ轻链。使用对抗体重链(cb-5'lvh引物，表1)，κ轻链(cb-5'lvk引物，表2)和λ轻链(cb-5'lvlam引物，表3)的前导区特异的引物库。将分别对重链、κ轻链和λ轻链的ch1区、ck区和cl区特异的单一反向引物用于步骤ipcr反应中。

步骤ii扩增

对于步骤ii，使用2.5μl的步骤ipcr产物作为模板来扩增重链和κ轻链或λ轻链可变区。将针对抗体重链(pcb-igg-vh和3'salijh引物，表4)、κ轻链(pcb-igg-vk和3'jk引物，表5)和λ轻链(cb-vl和3'clam-步骤ii引物，表6)的框架区1而特异性设计的正向和反向引物的库用于从可变区制备dna。此外，设计步骤ii引物以引入用于下游克隆的xbai(vk和vl正向引物)和xhoi(3'salijh引物)限制性位点。在步骤ii扩增反应之后，将重链和轻链可变结构域pcr产物在1％琼脂糖凝胶上运行。根据制造商的方案(凯杰公司)纯化重链和轻链可变区片段，并用于步骤iiipcr反应中。

步骤iii扩增：重叠延伸pcr

对于步骤iii，将步骤ii中产生的重链和轻链可变区dna片段经由重叠延伸pcr使用以下各项连接到单个盒中：1)κ接头或λ接头(参见下面的接头制备方法)，该接头退火到轻链步骤ii片段的3'末端和重链步骤ii片段的5'末端，并且含有κ或λ恒定区，2)含有xbai限制性位点的正向重叠引物，以及3)含有xhoi限制性位点的反向引物。该反应导致κ或λ链的约2400bp或2200bp扩增子(即，盒)，该扩增子分别由轻链可变区、接头和重链可变区组成。扩增后，根据制造商的说明书(凯杰公司pcr纯化试剂盒)将重叠延伸pcr反应产物进行pcr纯化。

接头制备

使用pcb-igg(在内部产生并用于表达重链和轻链基因两者的双重cmv启动子载体)作为模板和表7中所列的引物来扩增接头片段。对于κ或λ接头，该接头片段的长度分别为1765或1536个碱基对。该κ接头包含从5'至3'内含子序列，其后是κ恒定区、poly(a)终止序列、和巨细胞病毒启动子序列(其允许重组抗体的一种载体表达)。该λ接头包含λ恒定区、poly(a)终止序列、和巨细胞病毒启动子序列。使用共同的反向引物(接头_vh_havt20_pcb-igg-r)和κ特异性正向引物(接头_ck_内含子_pcb-igg-f)(表7)。在1％琼脂糖凝胶上分离该扩增的片段，并根据制造商的方案(凯杰公司凝胶提取试剂盒)进行纯化。

克隆进入哺乳动物表达载体中

在纯化该重叠延伸pcr产物后，用xhoi和xbai消化该片段，并随后在1％琼脂糖凝胶上分离。将对应于重叠盒(约2.4kb)的条带进行纯化并连接到igg1表达载体pcb-igg中。将抗体可变基因亚克隆到该载体中，并且抗体重组表达为igg1，而不管其原始(天然)亚型。(igg1重链恒定区氨基酸序列的实例示于seqidno:83中，并且轻链κ恒定区氨基酸序列示于seqidno:84中)。使用dh5a最大效率细胞(英杰公司)进行所有转化，并在250μl的soc中在37℃下回收1hr。将约100μl的回收的细胞种在补充有20mm葡萄糖的羧苄青霉素板上。将板在37℃下孵育过夜以允许集落生长。将剩余的回收细胞混合物与补充有50μg/ml羧苄青霉素的4ml的超级肉汤(superbroth)(sb)培养基一起培养，并在37℃下以250rpm振荡孵育过夜。第二天，每个板挑取5个菌落，并在37℃下在补充有50μg/ml羧苄青霉素的3ml的sb培养基中生长过夜。将过夜培养物用于dna质粒制备(凯杰公司)。

实例4

抗体测序、种系鉴定和转染上清液中抗tau肽反应性的确认

为了表达igg1，制备前述4ml培养物的dna质粒小量制备物(凯杰公司)，并根据制造商的说明书(英杰公司)使用expifectamine将其用于转染293expi细胞。在10ml培养物中进行转染最少持续72hr，以允许足够的ig1g表达。转染后收获细胞培养基并离心以去除这些细胞和碎片。使用octetred系统(福特生物(fortebio))上的蛋白a传感器尖端对上清液进行定量。随后用诱饵肽通过elisa测试每种上清液，以便证实抗tau反应性抗体的存在。制备来自实例3中四种单独挑选的培养物的质粒小量制备dna(凯杰公司)，并用引物pc9_seq_hc-r(5’catgtcaccggggtgtgg3’)(seqidno:85)和pc9_seq_lc-r(5’tcacaggggatgttagggaca3’)(seqidno:86)对轻链测序。选择四个中的一个克隆用于随后的实验。

抗体克隆cbtau-7.1(seqidno:87、88、89、90)、cbtau-8.1(seqidno:91、92、93、94)、cbtau-16.1(seqidno:95、96、97、98)、cbtau-18.1(seqidno:99、100、101、102)、cbtau-20.1(seqidno:103、104、105、106)、cbtau-22.1(seqidno:107、108、109、110)、cbtau-24.1(seqidno:111、112、113、114)、cbtau-27.1(seqidno:115、116、117、118)、cbtau-28.1(seqidno:119、120、121、122)、cbtau-41.1(seqidno:123、124、125、126)、cbtau-41.2(seqidno:127、128、129、130)、cbtau-42.1(seqidno:131、132、133、134)、cbtau-43.1(seqidno:135、136、137、138)、cbtau-44.1(seqidno:139、140、141、142)、cbtau-45.1(seqidno:143、144、145、146)、cbtau-46.1(seqidno:147、148、149、150)、cbtau-47.1(seqidno:151、152、153、154)、cbtau-47.2(seqidno:155、156、157、158)以及cbtau-49.1(seqidno:159、160、161、162)的重链和轻链可变区蛋白质和核酸序列定义了所选择的抗tau抗体的新的cdr(表8)。

产生了抗tau抗体cbtau-7.1，其包含seqidno:87的vh和seqidno:88的vl以及人类igg1恒定区。产生了抗tau抗体cbtau-8.1，其包含seqidno:91的vh和seqidno:92的vl以及人类igg1恒定区。产生了抗tau抗体cbtau-16.1，其包含seqidno:95的vh和seqidno:96的vl以及人类igg1恒定区。产生了抗tau抗体cbtau-18.1，其包含seqidno:99的vh和seqidno:100的vl以及人类igg1恒定区。产生了抗tau抗体cbtau-20.1，其包含seqidno:103的vh和seqidno:104的vl以及人类igg1恒定区。产生了抗tau抗体cbtau-22.1，其包含seqidno:107的vh和seqidno:108的vl以及人类igg1恒定区。产生了抗tau抗体cbtau-24.1，其包含seqidno:111的vh和seqidno:112的vl以及人类igg1恒定区。产生了抗tau抗体cbtau-27.1，其包含seqidno:115的vh和seqidno:116的vl以及人类igg1恒定区。产生了抗tau抗体cbtau-28.1，其包含seqidno:119的vh和seqidno:120的vl以及人类igg1恒定区。产生了抗tau抗体cbtau-41.1，其包含seqidno:123的vh和seqidno:124的vl以及人类igg1恒定区。产生了抗tau抗体cbtau-41.2，其包含seqidno:127的vh和seqidno:128的vl以及人类igg1恒定区。产生了抗tau抗体cbtau-42.1，其包含seqidno:131的vh和seqidno:132的vl以及人类igg1恒定区。产生了抗tau抗体cbtau43.1，其包含seqidno:135的vh和seqidno:136的vl以及人类igg1恒定区。产生了抗tau抗体cbtau44.1，其包含seqidno:139的vh和seqidno:140的vl以及人类igg1恒定区。产生了抗tau抗体cbtau45.1，其包含seqidno:143的vh和seqidno:144的vl以及人类igg1恒定区。产生了抗tau抗体cbtau46.1，其包含seqidno:147的vh和seqidno:148的vl以及人类igg1恒定区。产生了抗tau抗体cbtau47.1，其包含seqidno:151的vh和seqidno:152的vl以及人类igg1恒定区。产生了抗tau抗体cbtau47.2，其包含seqidno:155的vh和seqidno:156的vl以及人类igg1恒定区。产生了抗tau抗体cbtau49.1，其包含seqidno:159的vh和seqidno:160的vl以及人类igg1恒定区。

表8：重链和轻链可变区cdr的氨基酸序列

cbtau-7.1抗体包含seqidno:163的重链cdr1区、seqidno:164的重链cdr2区、和seqidno:165的重链cdr3区、seqidno:166的轻链cdr1区、seqidno:167的轻链cdr2区、和seqidno:168的轻链cdr3区。cbtau-8.1抗体包含seqidno:169的重链cdr1区、seqidno:170的重链cdr2区、和seqidno:171的重链cdr3区、seqidno:172的轻链cdr1区、seqidno:173的轻链cdr2区、和seqidno:174的轻链cdr3区。cbtau-16.1抗体包含seqidno:175的重链cdr1区、seqidno:176的重链cdr2区、和seqidno:177的重链cdr3区、seqidno:178的轻链cdr1区、seqidno:179的轻链cdr2区、和seqidno:180的轻链cdr3区。cbtau-18.1抗体包含seqidno:181的重链cdr1区、seqidno:182的重链cdr2区、和seqidno:183的重链cdr3区、seqidno:172的轻链cdr1区、seqidno:173的轻链cdr2区、和seqidno:184的轻链cdr3区。cbtau-20.1抗体包含seqidno:185的重链cdr1区、seqidno:186的重链cdr2区、和seqidno:187的重链cdr3区、seqidno:188的轻链cdr1区、seqidno:173的轻链cdr2区、和seqidno:189的轻链cdr3区。cbtau-22.1抗体包含seqidno:190的重链cdr1区、seqidno:191的重链cdr2区、和seqidno:192的重链cdr3区、seqidno:193的轻链cdr1区、seqidno:194的轻链cdr2区、和seqidno:195的轻链cdr3区。cbtau-24.1抗体包含seqidno:196的重链cdr1区、seqidno:197的重链cdr2区、和seqidno:198的重链cdr3区、seqidno:199的轻链cdr1区、seqidno:173的轻链cdr2区、和seqidno:200的轻链cdr3区。cbtau-27.1抗体包含seqidno:201的重链cdr1区、seqidno:202的重链cdr2区、和seqidno:203的重链cdr3区、seqidno:204的轻链cdr1区、seqidno:205的轻链cdr2区、和seqidno:206的轻链cdr3区。cbtau-28.1抗体包含seqidno:207的重链cdr1区、seqidno:208的重链cdr2区、和seqidno:209的重链cdr3区、seqidno:210的轻链cdr1区、seqidno:211的轻链cdr2区、和seqidno:212的轻链cdr3区。cbtau-41.1抗体包含seqidno:213的重链cdr1区、seqidno:214的重链cdr2区、和seqidno:215的重链cdr3区、seqidno:216的轻链cdr1区、seqidno:173的轻链cdr2区、和seqidno:217的轻链cdr3区。cbtau-41.2抗体包含seqidno:213的重链cdr1区、seqidno:214的重链cdr2区、和seqidno:215的重链cdr3区、seqidno:218的轻链cdr1区、seqidno:174的轻链cdr2区、和seqidno:217的轻链cdr3区。cbtau-42.1抗体包含seqidno:219的重链cdr1区、seqidno:220的重链cdr2区、和seqidno:221的重链cdr3区、seqidno:218的轻链cdr1区、seqidno:173的轻链cdr2区、和seqidno:217的轻链cdr3区。cbtau-43.1抗体包含seqidno:222的重链cdr1区、seqidno:223的重链cdr2区、和seqidno:224的重链cdr3区、seqidno:225的轻链cdr1区、seqidno:173的轻链cdr2区、和seqidno:226的轻链cdr3区。cbtau-44.1抗体包含seqidno:227的重链cdr1区、seqidno:228的重链cdr2区、和seqidno:229的重链cdr3区、seqidno:230的轻链cdr1区、seqidno:167的轻链cdr2区、和seqidno:231的轻链cdr3区。cbtau-45.1抗体包含seqidno:232的重链cdr1区、seqidno:233的重链cdr2区、和seqidno:234的重链cdr3区、seqidno:235的轻链cdr1区、seqidno:236的轻链cdr2区、和seqidno:237的轻链cdr3区。cbtau-46.1抗体包含seqidno:238的重链cdr1区、seqidno:239的重链cdr2区、和seqidno:240的重链cdr3区、seqidno:241的轻链cdr1区、seqidno:173的轻链cdr2区、和seqidno:242的轻链cdr3区。cbtau-47.1抗体包含seqidno:243的重链cdr1区、seqidno:244的重链cdr2区、和seqidno:245的重链cdr3区、seqidno:246的轻链cdr1区、seqidno:173的轻链cdr2区、和seqidno:212的轻链cdr3区。cbtau-47.2抗体包含seqidno:243的重链cdr1区、seqidno:247的重链cdr2区、和seqidno:248的重链cdr3区、seqidno:249的轻链cdr1区、seqidno:173的轻链cdr2区、和seqidno:212的轻链cdr3区。cbtau-49.1抗体包含seqidno:250的重链cdr1区、seqidno:251的重链cdr2区、和seqidno:252的重链cdr3区、seqidno:254的轻链cdr1区、seqidno:254的轻链cdr2区、和seqidno:255的轻链cdr3区。

使用igblast(免疫球蛋白可变结构域序列分析工具，可从ncbi获得)将抗tau单克隆抗体的重链和轻链可变区的核酸序列与已知的种系序列进行比较。(核酸研究(nucleicacidsres.)2013年7月；41(网页服务器(webserver)发行)：w34-40)。将与它们分别提出的种系序列和pcr引物比对的重链和轻链构架h1和l1区的序列比对示于表9中。将确认的序列按比例增加，用于表达和纯化(在实例5中详述)。将选择的克隆扩增到50ml培养物中，并制备质粒中量制备dna(马歇雷-纳高公司(macherynagel)中量制备(midiprep)试剂盒)。然后如实例5中详述的，将质粒dna用于转染293expi细胞的30ml培养物。

表9：与种系和引物比对的h1和l1的框架核酸

(以上氨基酸)用小写字母标记的差异。天然的是指抗体

通过elisa测定转染的igg1上清液对tau肽的反应性。首先，用作为阴性对照的50μl牛肌动蛋白(1μg/ml，西格玛公司)、和亲和纯化山羊抗人类f(ab)2(2μg/ml，杰克逊免疫研究)将96半孔的elisa板(科斯塔尔(costar))进行涂布，以确认抗体产生。将板在tbs中涂布在4℃下过夜。第二天，将板用tbs/0.05％tween(tbs-t)洗涤5次，并用150μl的tbs-t加2.5％bsa(封闭缓冲液)封闭2hr。在100μl的tbs中以0.43μm的浓度在链霉亲和素涂布的平板(皮尔斯(pierce)公司)上捕获tau肽。用于建立elisa测定的tau肽与用作相应分选实验中的诱饵相同。然后将tau肽包被的平板在rt下孵育1.5hr。然后将所有板用tbs/0.05％tween洗涤5次，并用150μl和300μl(仅tau肽平板)的封闭缓冲液封闭，并在rt下孵育2hr。将igg转染上清液稀释至5μg/ml(基于octetred的定量)，并在tbs/0.25％bsa中滴定5倍。将小鼠抗肌动蛋白(西格玛公司，目录号a3853)以1.25μg/ml作为牛肌动蛋白涂布的平板的阳性对照。将商业级抗体以1μg/ml作为elisa测定的阳性对照，包括at8单克隆抗体(赛默公司，mn1020)、at100单克隆抗体(赛默公司，mn1060)和at180单克隆抗体(赛默公司，mn1040)。将第一抗体在rt下孵育2hr，并在tbs-t中洗涤5次。最后，分别以1:2000和1:4000使用山羊抗人类iggfab或山羊抗小鼠hrp(杰克逊实验室)，并在rt下孵育1hr。将板在tbs-t中洗涤5次，并用surebluereservetmb微孔过氧化物酶底物(kpl)进行显影。通过加入50μl和100μl(肽板)的tmb终止液(kpl)终止反应，并使用elisa板读取器测量450nm处的吸光度。随后在独立的elisa实验中再次确认具有前述结合活性的上清液。一旦再确认，选择一个克隆用于下游igg表达和纯化(实例5)。

实例5

克隆的抗tau嵌合mab的igg1表达和纯化

在elisa筛选和确认抗体反应性后，将选择的克隆表达为如实例4中所示的igg1。收获细胞培养基，并且在最少72hr并直到最多168hr之后进行心以去除细胞。随后将澄清的上清液通过蛋白asepharose柱(ge医疗集团生命科学部)两次，并用50ml的pbs洗涤。随后用10ml的igg洗脱缓冲液(皮尔斯公司)洗脱igg，并用trisph8.0中和，并且随后对pbs透析过夜。使用10,000mwco超离心单元(amicon)将透析的样品浓缩至终体积为约1ml，并使用octetred384(福特生物)上的人类igg标准品，用蛋白a传感器尖端测定抗体浓度。通过在非还原和还原条件下进行sds-page并通过尺寸排阻色谱法来进一步质量控制纯化的抗体。

实例6

igg结合

对tau肽的反应性

通过elisa测试如上所述产生和质量控制的igg1结合特定的一种或多种同源肽以及非同源肽的能力(表10)。如实例4所述，分别用抗原(牛肌动蛋白和亲和纯化山羊抗人类f(ab)2)或tau肽涂布96孔elisa板(科斯塔尔)或链霉亲和素涂布的板(皮尔斯公司)。将纯化的抗tauigg在含有0.25％bsa的tbs中稀释至5μg/ml，并滴定5倍。如在实例4中详述使用抗体对照和第二抗体。通过elisa测定在1μg/ml处的抗体反应性，并记为没有结合(-)、弱结合(-/+)、中等结合(+)或强结合(++)。(-)表示两个o.d.450nm读数的平均值<0.3；(-/+)表示>0.5并且<1.0；(+)表示>1.0并且<1.5，(++)表示>1.5。

表10在elisa中使用的同源肽和非同源肽

*人类tau441亚型上的氨基酸区

结果示于图1a-t中。本文所述的抗taumab可以分为两个主要组：仅与磷酸化肽(磷酸依赖性mab)反应的那些和与磷酸化肽和非磷酸化肽(磷酸独立性mab)反应的那些。使用实例3中详述的方法从非ad个体中回收抗taumabcbtau-7.1、cbtau-8.1、cbtau-18.1和cbtau-22.1。这些mab是磷酸依赖性的，如通过elisa所示(图1)，其仅与磷酸化肽反应，而不与跨该区域的非磷酸化肽或该肽的非磷酸化形式反应。抗taumabcbtau-7.1和cbtau-8.1特异性地与含有at8结合表位的磷酸化肽反应。该肽跨越氨基酸194至212并且在位置202和205处包含磷酸化残基。cbtau-18.1与跨越氨基酸200-217、在位置210处具有磷酸化丝氨酸残基的磷酸化肽进行反应。最后，cbtau-22.1与跨越氨基酸406-429、在位置416和422处具有两个磷酸化丝氨酸的肽进行反应。

类似地，从非ad个体中鉴定出cbtau-20.1，并且其主要是磷酸依赖性的，因为其与跨越氨基酸59-77的三种不同的磷酸化肽进行反应。这些肽中的两个被双重磷酸化，一个在位置68和69处，并且第二个在位置69和71处。cbtau-20.1还与在位置71处的单磷酸化的第三肽反应，这表明苏氨酸71处的磷酸化是足够的且对于cbtau-20.1反应性很重要。cbtau-20.1显示出对跨区42-103的非磷酸化肽的弱反应性。

类似于上述mab，还从非ad个体中回收cbtau-16.1和cbtau-24.1；然而，这两种mab是磷酸独立性的，并且如通过elisa所观察到的，它们与跨越特定区域的磷酸化肽和非磷酸化肽两者反应。cbtau-16.1与氨基酸区204-221反应，而cabtau-24.1与跨越氨基酸221-245的三种不同的肽反应。此外，使用分别对应于氨基酸区域42-103和299-369的60-70个氨基酸长度的非磷酸化肽，从用非ad供体样品进行的筛选中鉴定了两个另外的抗taumab(cbtau-27.1和cbtau-28.1)；因此，这两种mab对于非磷酸化tau都是特异性的。

最后，从一小型研究中鉴定了cbtaumab41.1、41.2、42.1、43.1、44.1、45.1、46.1、47.1、47.2和49.1，在该小型研究中筛选了25名年轻非ad(18-27岁)、25名非ad(55岁以上)以及25名ad(55岁以上)个体。用于本研究的肽组包括8个磷酸化肽(包括cbtau-22.1同源肽)和2个非磷酸化肽(cbtau-27.1和cbtau-28.1同源肽)。从ad供体回收cbtaumab41.1、41.2和42.1，并与cbtau-22.1同源肽反应。与cbtau-22.1类似，这些mab是磷酸依赖性的，如图1j-l所示。从对cbtau-22.1同源肽具有反应性的非-ad(55岁以上)个体中鉴定了两个另外的mab(cbtau-44.1和cbtau-45.1)。如所预期的，这两个也是磷酸依赖性的(图1n-o)。还从在非ad(55岁以上)个体中进行的筛选中鉴定出cbtau-43.1；然而，该mab用cbtau-27.1同源肽回收并且对非磷酸化tau是特异性的(图1m)。最后，从对cbtau-28.1肽具有反应性的非ad(18-27岁)个体中回收cbtau-46.1、47.1、47.2和49.1，并且与cbtau-28.1类似，它们对非磷酸化tau是特异性的(图1p-s)。

实例7

通过elisa，对成对螺旋纤丝和重组tau的反应性

为了进一步表征一些嵌合抗体的特异性，通过elisa测试其对重组tau、富集的和免疫纯化的成对螺旋纤丝的反应性。

根据格林伯格和戴维斯的方案免疫纯化phf-tau。简言之，将对应于阿尔茨海默病个体的皮层组织用10体积的冷缓冲液(10mmtris、ph7.4、1mmegta、0.8mnacl和10％蔗糖)进行均质化，并在4℃下以27,200xg离心20min。向上清液中添加n-月桂酰肌氨酸和2-巯基乙醇，分别达到1％(wt/vol)和1％(vol/vol)的终浓度。将该混合物在37℃下恒温摇动孵育2-2.5hr，然后在室温下以108,000xg离心30min。将含有phf-tau的沉淀用pbs洗涤3次，并溶解于不含蛋白质抑制剂的pbs中，并进一步以12,000xg离心5min。将回收的含有富集的phf-tau(ephf-tau)的上清液在htau10亲和柱上进行免疫亲和纯化，并用3m或4mkscn在4℃下洗脱过夜，然后用3次变化缓冲液在4℃下对1lpbs进行透析。htau10是通过用重组tau免疫在内部产生的抗体。它在氨基末端表位结合重组tau和phf-tau两者。用赛多利斯(sartorius)离心过滤装置浓缩该免疫纯化的phf-tau(iphf-tau)。

对于elisa，用50μl在tbs中的抗原(2μg/ml重组tau、2μg/ml牛肌动蛋白亲和纯化山羊抗人类f(ab)2、1μg/ml亲和纯化的成对螺旋纤丝、和1μg/ml单克隆抗tau抗体ht7(赛默科技公司，mn1000))涂布半面积96孔结合板(科斯塔尔)。第二天，将板用tbs-t洗涤，并随后在rt下用150μl的tbs加2.5％bsa封闭2hr。封闭后，在抗tau抗体涂布的板上在rt下捕获ephf-tau持续2hr。将纯化的抗tauigg在加有0.25％bsa的tbs中稀释至10μg/ml，并且将igg在rt下滴定5倍持续2hr。将at8(10μg/ml)用作iphf-tau和捕获的ephf-tau的阳性对照。将平板用tbs-t洗涤5次，并且添加在tbs加0.25％bsa中稀释的第二抗体，并在rt下孵育1hr。使用1:2000稀释的山羊抗人类iggf(ab')2(杰克逊实验室)，并使用1:4000(用于抗肌动蛋白对照)的山羊抗小鼠hrp(杰克逊实验室)。孵育后，将板在tbs-t中洗涤4次，并用surebluereservetmb微孔过氧化物酶底物(kpl)进行显色持续约2min。通过添加tmb终止溶液(kpl)立即停止反应，并且使用elisa板读取器测量450nm处的吸光度。

结果示于图2a-j中。如所预期的，磷酸依赖性mabcbtau-7.1、cbtau-8.1和cbtau-18.1不通过elisa与重组tau反应(图2a、b、d)。cbtau-20.1显示对重组tau的较小反应性，与其对跨越区域42-103的非磷酸化肽的弱反应性一致。有趣的是，除了cbtau-7.1之外，这些磷酸依赖性mab对成对螺旋纤丝(即，ephf-tau和iphf-tau)没有显示任何反应性，其在较高抗体浓度下显示对ephf-tau的较小反应性。最后，磷酸依赖性cbtau-22.1显示对重组tau没有反应性，但是它与iphf-tau和ephf-tau都反应(图2f)。

磷酸独立性抗taumab，cbtau-16.1和cbtau-24.1与重组tau和两种形式的成对螺旋纤丝(即，iphf-tau和ephf-tau；图2c和g)都反应。cbtau-28.1显示与重组tau的强结合，对两种phf-tau形式具有弱免疫反应性(图2i)。最后，cbtau-27.1显示对重组tau和phf-tau两者的弱免疫反应性(图1h)。

实例8

通过蛋白质印迹分析，对成对螺旋纤丝和重组tau的反应性

为了扩展rtau和phf结合elisa的观察结果并为了检查二级结构是否在反应性中起作用，通过蛋白质印迹分析测试重组tau、富集的和免疫纯化的成对螺旋纤丝。将约0.5μg的iphf、ephf和1μg的rtau在最终浓度的1xnupagelds样品缓冲液(0.5％lds终浓度)(novex，np0007)下在70℃下加热10分钟。将样品加载到26孔、4％-12％bis-trisnovexnupage凝胶(英杰公司，具有mopssds运行缓冲液(诺瓦基公司(novagen)，np0001))上，并且随后转移到硝酸纤维素膜上。将膜在具有0.05％tween20和4％脱脂奶粉的1xtris缓冲盐水(tbs)中封闭过夜。在具有0.05％tween20和4％脱脂奶粉的1xtbs中，将cbtaumab作为初级在25g/ml下使用，并在室温下孵育2hr。然后将膜在具有0.05％tween20的1xtbs中洗涤3次，每次5min。然后将过氧化物酶亲和纯化山羊抗人类igg、特异的fcγ片段(杰克逊免疫研究)作为次要，以1:2000稀释于具有0.05％tween20和4％脱脂奶粉的1xtbs中，并在rt下孵育45min。将膜洗涤3次，每次5min，并使用supersignalwestpico试剂盒(皮尔斯公司)进行显色。

蛋白质印迹分析的结果示于图3中。该图显示了三种对照抗体at8、at100和ht7(分别为两种磷酸tau特异性和总tau特异性)的反应性。at8和at100都显示出phf-tau的三联带特征，其对应于约68、64和60kda。与elisa结果相反，磷酸依赖性mab，cbtau-7.1和cbtau-18.1通过蛋白质印迹与iphf-tau和ephf-tau两者反应，这表明当tau采用更高级构象存在于phf-tau中时，这些mab的表位是不可及的。然而，在sds-page的强变性条件下，这些表位变得可及。cbtau-27.1显示通过蛋白质印迹结合重组tau和phf，但通过elisa显示对每种的弱反应性，这表明该抗体的表位仅在强变性条件下暴露。cbtau-28.1通过蛋白质印迹和elisa两者与重组tau强烈反应，并且还通过这两种测定显示对phf-tau的反应性。cbtau-28.1与tau的e1/e2区(氨基酸42-103)(不存在于所有tau亚型中)反应；因此，通过cbtau-28.1仅检测到phf-tau上的68和64kda条带。最后，cbtau-22.1和cbtau-24.1显示与elisa测定类似的结果，分别与phf-tau而非重组tau反应，和与phf-tau和重组tau两者反应。

实例9

通过elisa，对tau片段肽的反应性

为了表征回收的抗体的特异性，通过elisa测试它们对tau磷酸化肽和非磷酸化肽(表11-21，图4a-g)的反应性。商业化合成生物素化的tau肽并以1mg/ml溶于水中并在-80℃下冷冻。简言之，用稀释在tbs中的2μg/ml的tau肽涂布96孔链霉亲和素结合板(赛默飞世尔公司)，并在4℃下孵育过夜。第二天，将板用tbs-t洗涤，并且随后在rt下用tbs中的2.5％bsa封闭2hr。封闭后，将纯化的抗tauigg在tbs加0.25％bsa中稀释至2g/ml(或至5g/ml并使用表15-20中的肽序列滴定5倍，用于cbtau-27.1、28.1、43.1、46.1、47.1、47.2和49.1的更精细绘图)，并在rt下孵育2hr。将实例11中描述的人类嵌合形式的at8igg(以2μg/ml)用作每个作图实验中的阳性对照。将板用tbs-t洗涤5次，然后加入在tbs加0.25％bsa中稀释的第二抗体[山羊抗人类iggf(ab')2(杰克逊实验室)，以1:2000稀释]，并在rt下孵育1hr。孵育后，将板在tbs-t中洗涤4次，并用surebluereservetmb微孔过氧化物酶底物(kpl)进行显色持续约90sec。通过添加tmb终止溶液(kpl)立即停止反应，并且使用elisa板读取器测量450nm处的吸光度。每个实验在不同的三天中进行三次重复。当值在elisa测定中等于或高于0.4od时，反应性被认为是阳性的。为了确定每种mab对tau磷酸化肽和非磷酸化肽的反应性，通过elisa确定2μg/ml的抗体反应性，并记为没有结合(-)、弱结合(-/+)、中等结合(+)、或强结合(++)。(-)表示两个o.d.450nm读数的平均值<0.3；(-/+)表示>0.5并且<1.0；(+)表示>1.0并且<1.5，(++)表示>1.5。对于cbtau-27.1、28.1、43.1、46.1、47.1、47.2和49.1的更精细作图(详见表15-20)，通过elisa测定1μg/ml的抗体反应性，并记为没有结合(-)、弱结合(-/+)、中等结合(+)、或强结合(++)。(-)表示三个o.d.450nm读数的平均值<0.3；(-/+)表示>0.5并且<1.0；(+)表示>1.0并且<1.5，(++)表示>1.5。

表17.cbtau-43.1：通过elisa的肽的反应性

表18.cbtau-46.1：通过elisa的肽的反应性

表19.cbtau-47.1和cbtau-47.2：通过elisa的肽的反应性

表20.cbtau-49.1：通过elisa的肽的反应性

表21.at8通过elisa的肽的反应性

尽管使用含有at8表位的肽(表21；192-212；ps202，pt205)回收了cbtau-7.1，但是对cbtau-7.1的结合有贡献的磷酸残基似乎是混杂的，这些磷酸残基包括位置s202+t205，还包括s198+s202、s198+t205、s199+t205和可能的y197+t205的组合。未磷酸化的肽显示对cbtau-7.1无反应性。对于cbtau-18.1，发现最小表位由氨基酸198-217组成并且依赖于ps210，但是当t212、s214或t217也被磷酸化时不依赖于ps210。发现cbtau-22.1反应性依赖于ps422，而抗体cbtau-24.1显示出与其相应的未磷酸化肽的强结合，因此不受磷酸化的影响。

使用跨氨基酸299-369的未磷酸化肽回收cbtau-27.1和cbtau-43.1。有趣的是，该区域内的重叠肽显示对两种mab(即，cbtau-27.1和cbtau-43.1，分别与跨越氨基酸299-318和309-328的肽反应)的类似结合需求，这表明这两种mab的表位在tau441上的区域299-328内(图4a和c)。

使用跨越tau441上的区域42-103的肽，从人类供体样品中回收cbtau-28.1、46.1、47.1、47.2和49.1。测试每个mab对肽的较小的重叠组的反应性显示了cbtau-47.1、47.2和49.1与cbtau-28.1(即，跨越区域52-71的肽的反应性)类似的结合，这表明可比的结合要求；然而，cbtau-46.1结合到上述mab的c末端区域(即，82-103l；图4b和d-g)。

实例10

肽表位的丙氨酸扫描

为了进一步表征贡献于结合每种复原mab的特异性和氨基酸，通过elisa测试它们对tau肽的反应性，其中tau肽的每个位置被丙氨酸取代。所有实验方案与实例9相同。通过elisa测定在1μg/ml处的抗体反应性，并记为没有结合(-)、弱结合(-/+)、中等结合(+)、或强结合(++)。(-)表示两个o.d.450nm读数的平均值<0.3；(-/+)表示>0.5并且<1.0；(+)表示>1.0并且<1.5，(++)表示>1.5。每种抗体的结果示于表22-29中。

表22.cbtau-7.1和cbtau-8.1的丙氨酸扫描结果

表23.cbtau-22.1的丙氨酸扫描结果

表24.cbtau-24.1丙氨酸扫描结果

表25.cbtau-27.1丙氨酸扫描结果

表26.cbtau-28.1丙氨酸扫描结果

表27.cbtau-43.1丙氨酸扫描结果

表28.cbtau-47.1和47.2丙氨酸扫描结果

表29.cbtau-49.1丙氨酸扫描结果

尽管使用含有at8表位(即，ps202、pt205)的tau磷肽回收cbtau-7.1和cbtau-8.1，但是根据丙氨酸扫描结果(表22)，这两种mab都表现出不同的表位需求。除了s202和t205，在位置g204和p206处的取代导致cbtau-7.1的结合降低。相比之下，在位置g204、t205、p206和r209处的丙氨酸取代降低了cbtau-8.1对肽的反应性，但s202a取代没有效果。像at8一样，这两种mab都是磷酸依赖性的，但是需要另外的(非磷酸化残基)用于结合。对于cbtau-22.1的丙氨酸扫描结果显示对s422处的磷酸化的依赖性(表23)，因为在该位置的取代完全抑制结合。在d421处的取代导致结合的减少，但不是完全抑制结合。最后，cbtau-24.1的丙氨酸扫描结果显示p236是结合的唯一关键残基(表24)。

为了绘制cbtau-27.1和43.1的关键接触残基，还在tau的区域299-323内进行丙氨酸扫描(分别为表25和表27)。对于cbtau-27.1结合的关键接触残基显示为d314、l315和k317。这些结果表明残基d314和k317可以在mab上的表位和cdr残基之间形成盐桥相互作用。虽然使用cbau-27.1的同源肽回收cbtau-43.1，但根据丙氨酸扫描的这些关键残基是不同的。除了l315和k317，位置312处的脯氨酸显示为cbtau-43.1结合的重要接触。最后，对cbtau-28.1以及cbtau-47.1、47.1和49.1也进行丙氨酸扫描(表26、28、29)。如实例9所示，cbtaumab47.1、47.2、49.1映射到与cbtau-28.1相同的肽区(即，52-71)。有趣的是，所有mab共享与cbtau-28.1相同的结合要求。这些关键接触残基显示为p59、s61、e62、t63、d65、和k67。发现这些残基中的几个是带电荷的，这暗示着表位和mab之间的重要的盐桥相互作用。

实例11

免疫组织化学

tau病变被认为在内嗅皮层(ec)内引发并且在进入皮层之前沿着海马中的连接的神经元途径扩散。为了确定所回收的igg对沿着这些神经元途径的tau病原性沉积物的反应性，从82岁的非患病(非ad；艾博抗公司(abcam)，目录号ab4305)男性和88岁的阿尔茨海默病(ad；艾博抗公司，目录号ab4583)男性(艾博抗公司)获得海马组织。从71岁的非患病(非ad)和71岁的阿尔茨海默病(ad)个体(班纳太阳医疗(bannersunhealth))获得皮层组织。除了ad，还有许多以tau病变(也称为tau蛋白病变)为特征的神经障碍。为了扩展我们的发现，我们测试了分别从73岁男性和81岁女性获得的进行性核上性麻痹(psp)和非进行性核上性麻痹(非psp)额叶获得的组织中的回收的mab(生物链公司(biochain))。通过使用载玻片染色装置(vwr国际公司)在二甲苯(vwr国际公司(vwrinternational))中洗涤两次10min，然后在100％乙醇中洗涤两次3min，在95％乙醇中洗涤两次3min，在70％乙醇中洗涤两次3min，并在蒸馏h2o中洗涤一次30sec，将脑组织脱石蜡并再水化。使用柠檬酸盐缓冲液(10mm柠檬酸，ph6.0)将组织切片进行热介导的抗原修复以暴露抗原位点。然后将切片与封闭缓冲液[10％正常山羊血清(杰克逊免疫研究公司)，pbs中的1％bsa和0.3％triton-x100]在rt下孵育1hr。除去过量的水，并用immedge疏水阻隔笔(载体实验室公司)圈上组织切片。通过用h2o覆盖染色托盘的底部来制备调湿室，然后通过抽吸用pbs洗涤切片3次5min。将内源性过氧化物酶活性在10％h2o2中在rt下淬灭30min。淬灭后，通过抽吸用pbs洗涤载玻片3次5min。然后在rt下用10％正常山羊血清、0.3％tritonx-100、1％bsa在1xpbs中的溶液将载玻片封闭1hr。使用zenon人类igg标记试剂盒(生命科技公司)根据制造商的说明书用生物素标记第一抗体。作为阴性对照，使用人类抗rsv特异性抗体。将fc区人类嵌合形式的at8igg用作阳性对照。标记后，将第一抗体分别在5μg/ml和20μg/ml浓度的封闭缓冲液中稀释。对于肽竞争实验，在与组织切片孵育之前，将13.3μm的同源肽(即，用于在分选实验中回收mab的肽)与初级抗体在rt下预孵育30min。将组织切片在rt下与100μl稀释的生物素标记的第一抗体或肽竞争的抗体孵育2hr。通过抽吸去除抗体后，在pbs中的4％甲醛中进行组织切片的第二次固定，并在rt下孵育15min。通过抽吸用pbs洗涤切片3次5min。然后将切片与链霉亲和素底物vectastainabc试剂(载体实验室公司)一起孵育30min，然后用pbs洗涤。然后在镍存在下用dab底物(载体实验室公司)将组织进行显色。然后将切片用ddh2o洗涤2次，并允许在rt下完全干燥，然后用50μl的vectamount永久性封固剂(载体实验室公司)进行封固。最后，将组织切片用苏木精(载体实验室公司)复染。使用metamorph软件，用olympusbx-41直立显微镜获取代表性图像。

来自免疫组织化学的结果示于图5a-d中。cbtau-7.1和cbtau-8.1对ad脑组织特异地而不是对健康脑组织显示出阳性免疫反应性，这表明与存在于患病脑组织中的致病性tau沉积物进行结合。这些抗体识别海马(图5a；内嗅皮质)和大脑皮层(图5b)的亚区中的at8阳性tau缠结和嗜中性粒细胞线。此外，在神经元细胞质和突起中的多个实验中一致地发现阳性免疫反应性。此外，还针对海马和皮层组织切片测试了cbtau-18.1、22.1和24.1(图5a-b)。与cbtau-7.1和cbtau-8.1类似，所有mab与ad组织切片上的tau特异性反应，但不与非ad组织切片上的tau反应。感兴趣的是，不对磷酸化tau特异的cbtau-24.1特异性地与ad组织切片上的患病tau反应，而不与非ad切片上的tau反应。最后，cbtau-16.1和cbtau-20.1显示对非ad和ad组织切片两者上的tau的反应性。

此外，在对应于进行性核上性麻痹的皮层组织切片上测试cbtau-7.1、8.1、16.1、18.1、20.1、22.1和24.1(图5c)。不像at8，cbtau-7.1和cbtau-8.1未能检测人类psp脑中的tau缠结，这表明这两种mab的表位不存在于psp上。cbtau-16.1和cbtau-20.1在非psp和psp皮层脑切片上显示对tau的阳性免疫反应，这表明结合正常tau和致病形式的tau两者。在非ad脑切片中，这些抗体在神经元细胞质和突起中显示对tau的阳性免疫染色(图5a和5b)，但是类似于at8，这两种mab都检测ad脑切片中的缠结和嗜中性粒细胞线。在psp脑组织切片中还检测到与at8类似的对tau缠结的免疫反应性，这表明cbtau-16.1和cbtau-20.1都识别其他非adtau蛋白病变中的常见致病性tau形式。此外，cbtau-22.1和cbtau-24.1仅在ad脑组织中显示免疫反应性，对缠结和嗜中性粒细胞线具有阳性免疫反应性。cbtau-18.1在非ad脑组织中显示弱的免疫反应性，但对ad组织样品反应更强。cbtau-18.1、cbtau-22.1和cbtau-24.1对于psp脑组织切片中的tau缠结也是阳性的(图5c)。

cbtau-27.1和cbtau-28.1在非ad组织切片中显示选择性免疫染色，这些非ad组织切片具有神经元细胞质和突起中的弥漫性免疫染色。有趣的是，这两种抗体都不能在ad组织切片(海马和皮层)中显示免疫反应性，这限定了在疾病进展过程中丢失的新表位。不像我们鉴定的大多数人类抗taumab，通过使用跨越人类tau441的整个区域的非磷酸化肽组筛选供体样品来回收cbtau-27.1和cbtau-28.1。这些抗体不需要用于结合的磷酸化(图1)，并且如图2所示，不通过elisa与phf反应。因此，期望针对这两种mab所观察的弥漫性免疫染色模式。此外，针对皮层组织切片测试最初使用cbtau-27.1同源肽回收的cbtau-43.1。cbtau-43.1反应类似于cbtau-27.1，在非ad上染色tau但在ad组织切片上不染色tau。同样，使用cbtau-28.1同源肽回收的cbtau-46.1、47.2(仅一种测试变体)和49.1在非ad但不是ad组织切片上特异性地与tau反应(图5d)。有趣的是，注意到这些mab都共享共同的重链和轻链种系(即，vh5-51和vk4-1)，结合tau上的相同区域，并且如图5d所示，共享相似的免疫组织化学特性。

在对应于若干个非ad和ad个体的脑和组织样品的多个区域上已经证实了针对cbtau-7.1、8.1、18.1、22.1、24.1、27.1和28.1所呈现的免疫组织化学结果。已经使用相同的组织样品证实了cbtaumab43.1、46.1、47.2和49.1的免疫反应性，并且其在对应于其他ad和非ad个体的样品中尚未证实。

实例12

脱磷酸化ihc

考虑到cbtau-28.1的ihc的结果显示对非ad组织切片上的tau而不是ad组织切片上的tau的免疫反应性，我们假设在疾病进展期间该表位的缺失是一个或多个结果修饰(即，磷酸化)。为了测试这一假设，在评估cbtau-28.1的免疫反应性之前将人类脑组织切片进行脱磷酸化。使用载玻片染色装置(vwr国际公司)，将石蜡包埋的人类脑组织切片(艾博抗公司，目录号：ab4305，54岁男性，无临床症状对比艾博抗公司，目录号：ab4583，93岁西班牙裔女性，阿尔茨海默病)通过在二甲苯(vwr国际公司)中洗涤两次10min、然后在100％乙醇中洗涤两次3min、在95％乙醇中洗涤两次3min，在70％乙醇中洗涤两次3min、并且在蒸馏h2o中洗涤一次30sec进行脱石蜡和再水化。为了使非特异性抗体结合最小化，在洗涤期间从不允许组织干燥。使用柠檬酸盐缓冲液(柠檬酸，ph6.0)将组织切片进行热介导的抗原修复以暴露抗原位点。除去过量的水，并用immedge疏水阻隔笔(载体实验室公司)圈上组织切片。通过用h2o覆盖染色托盘的底部来制备调湿室，然后通过抽吸用pbs洗涤切片3次5min。将内源性过氧化物酶活性在h2o2中在rt下淬灭15分钟。淬灭后，通过抽吸用pbs洗涤载玻片3次5min。随后将切片用130单位/ml的牛小肠碱性磷酸酶(ciap)在32℃下处理2.5hr。然后在rt下用10％正常山羊血清、0.3％tritonx-100、1％bsa在1xpbs中的溶液将载玻片封闭1hr。将鼠源化的cbtau-28.1(fc区鼠源化)和对照mabat8和亚型对照(抗rsvmab4.1)以1ug/ml的终浓度在海马切片上孵育过夜。洗涤切片并与抗小鼠的fcy片段特异性抗体在室温下孵育2hr。在镍存在下用过氧化物酶底物溶液dab将样品进行显色。用苏木精复染样品。(载体实验室公司)。使用metamorph软件，用olympusbx-41直立显微镜获取代表性图像。

结果示于图6a和b中。如所预期的，cbtau-28.1与存在于非ad海马组织切片中的tau反应，但不与ad组织切片中的tau反应。相比之下，对照mab，at8在非ad切片中不与tau反应，但明显与存在于ad切片中的致病性tau沉积物反应(图6a)。然而，用磷酸酶预处理ad组织切片恢复了cbtau-28.1的反应性，允许其对存在于这些切片中的致病性tau沉积物进行染色。如所预期的，在用磷酸酶预处理ad组织切片下，at8的反应性降低(图6b)。

实例13

脱磷酸化elisa

为了证实实例12的结果，通过elisa测试成对螺旋纤丝的脱磷酸化对cbtau-28.1的反应性。将半面积96孔结合板(科斯塔尔)用在tbs中的50μl抗原(2μg/ml牛肌动蛋白亲和纯化山羊抗人类f(ab)2、和1μg/ml亲和纯化的成对螺旋纤丝、用和不用牛小肠磷酸酶(cip)预处理的iphf)进行涂布。如下制备磷酸酶处理的iphf。将iphf样品重悬于终浓度为0.05μg/ml的1xneb缓冲液4(50mm乙酸钾、20mmtris-乙酸盐、10mm乙酸镁、和1mmdtt)中。每μgiphf中加入一单位的cip(cip，neb目录号m0290s)。将iphf样品在37℃下用cip孵育90min，然后涂布在elisa结合板上。抗原结合过夜后，将板用tbs-t洗涤，并且随后在rt下用150μl的tbs加2.5％bsa进行封闭2hr。将纯化的对照和抗tauigg(cbtau-28.1)以在tbs/0.25％bsa和igg中以25μg/ml开始的5倍稀释液进行滴定，并孵育1.5hr。将板用tbs-t洗涤4次，并且加入第二抗体(抗人类fabhrp，杰克逊免疫研究公司，目录号109-036-097)，并在rt下孵育45min。孵育后，将板在tbs-t中洗涤4次，并用surebluereservetmb微孔过氧化物酶底物(kpl)进行显色约2min。通过添加tmb终止溶液(kpl)立即停止反应，并且使用elisa板读取器测量450nm处的吸光度。每个实验点重复进行三次。

结果示于图7中。如前面实例7所示，与at8相比，cbtau-28.1通过elisa与iphf反应较差。然而，具有cip的iphf的脱磷酸化恢复了cbtau-28.1对丝状样品的反应性。如所预期的，磷酸tau对照mab，at8的反应性在脱磷酸化具有cip的iphf之后被消除。

实例14

cbtau-27.1、28.1、43.1、47.1、47.2和49.1对磷酸肽的反应性

cbtau-27.1(和cbtau-43.1)和cbtau-28.1(和cbtau-46.1、47.2、49.1)的免疫组织化学结果表明这些mab与存在于正常非ad组织切片中的tau上的表位进行反应，但是所述表位在疾病环境期间丢失或掩蔽(图5)。我们假设这是区域内的磷酸化事件的结果，该区域导致掩蔽一个或多个表位。实例12和实例13中突出显示的实验表明，对于28.1，这确实是真的。因此，我们想特异地鉴定可能潜在靶向磷酸化的位点，并考虑cbtau-28.1的反应性丧失。因为47.1、47.2和49.1结合到与cbtau-28.1上的tau相同的区域(即，52-71)，所以我们决定在这些实验中也测试这些mab。此外，我们还对cbtau-43.1和cbtau-27.1进行了相同的练习，因为它们与通过ihc的cbtau-28.1表现相似。

设计单一和双重磷酸化tau肽以覆盖具有区域52-71和299-323(分别为cbtau-28.1和cbtau-27.1结合区)的所有潜在磷酸化位点。针对表30和32所列的肽测试cbtau-27.1和cbtau-43.1mab。如实例9中详述的，将96孔链霉亲和素涂布的elisa板(皮尔斯公司)用磷酸化tau肽进行涂布。将纯化的抗tauigg在含有0.25％bsa的tbs中稀释至5μg/ml，并滴定5倍。如在实例9中详述使用抗体对照和第二抗体。通过elisa测定在1g/ml处的抗体反应性，并记为没有结合(-)、弱结合(-/+)、中等结合(+)、或强结合(++)。(-)表示两个o.d.450nm读数的平均值<0.3；(-/+)表示>0.5并且<1.0；(+)表示>1.0并且<1.5，(++)表示>1.5。每种抗体的结果示于表30-34和图8中。

表30.cbtau-27.1：通过elisa的肽的反应性

表31.cbtau-28.1：通过elisa的肽的反应性

表32.cbtau-43.1：通过elisa的肽的反应性

表33.cbtau-47.1和cbtau-47.2：通过elisa的肽的反应性

表34.cbtau-49.1：通过elisa的肽的反应性

cbtau-27.1和cbtau-43.1的结果显示在s316处的磷酸化足以完全抑制反应性(表30和表32)。这表明，对ad组织切片上的tau的反应性的损失(实例11)可能由于s316处的磷酸化，这是可能在疾病过程中早期发生的事件。对于cbtau-28.1、47.1、47.2、49.1，在s61或t63处的磷酸化足以完全抑制反应性。总之，cbtau-28.1、47.1、47.2和49.1的结果表明，在s61和/或t63处的磷酸化是在疾病过程中说明该表位丧失的机制。

实例15

抗taumab小鼠-人类嵌合体和人类亚型的产生

为了测试人类抗taumab在tau蛋白病变的小鼠模型中的功效，通过用小鼠igg1fc替换人类fc区产生小鼠-人类抗体嵌合体。简言之，使用引物步骤1hmchim-fwd和步骤1hmchim-rev(表35)从pcb-igg载体扩增人类igg1ch1区，以产生含有5'-xhoi位点的0.95kb片段(片段1)。使用引物步骤2hmchim-fwd和步骤2hmchim-rev(表30)从基因合成的构建体扩增小鼠igg1ch2和ch3结构域(fc区)，以产生0.82kb片段(片段2)。通过使用包含3'-draiii位点的引物步骤3hmchim-fwd和步骤3hmchim-rev(表30)扩增pcb-igg载体的polya区域来产生第三片段(片段3)。通过重叠延伸pcr将这三个片段连接到单盒中，以产生含有人类ch1、随后是小鼠ch2-ch3结构域的2.3kb重叠片段。随后经由xhoi和draiii位点将该重叠片段克隆到pcb-iggcbtau-7.1载体中，以产生cbtau-7.1的小鼠-人类嵌合体，其含有人类可变区ch1、铰链区和ck区，随后是小鼠ch2和ch3区。然后通过用xhoi和xbai消化cbtau-7.1嵌合体构建体和pcb-iggcbtau人类mab构建体来产生cbtau-22.1、24.1、27.1、28.1、47.1、47.2、46.1、49.1和43.1嵌合体，并且亚克隆其相应的片段。根据技术人员已知的标准技术来验证用于所有构建体的核苷酸序列。随后如实例5中详述的，使用蛋白g琼脂糖代替蛋白a来表达和纯化嵌合抗体。

表35用于小鼠-人类嵌合的引物

实例16：

igg2、3和4亚型的制备

如实例3中所述，所有cbtaumab被克隆并表达为嵌合人类igg1，而不管其天然亚型。为了产生另外的人类亚型形式(即，igg2/3/4)，从包含相应的恒定区、铰链、和内含子序列的基因合成的构建体来pcr扩增对应于每种人类igg亚型的ch1至ch3区。这些pcr扩增子含有5'-xhoi和3'-draiii位点，这些pcr扩增子用于将片段亚克隆到相应的pcb-iggcbtau抗体构建体中。以这种方式，针对每种抗taumab产生人类igg2、3和4亚型形式。

实例17

风险降低的和fc工程化的抗tau嵌合单克隆抗体变体的产生

分析实例3中分离的每种抗tau抗体克隆的重链和轻链可变区(vh和vl)中游离半胱氨酸和潜在的翻译后修饰位点(包括糖基化、脱酰胺以及氧化位点)的存在。由结构上保守和/或基于种系的取代组成的氨基酸突变用于改变这些位点。可变区中的非保守半胱氨酸突变为丝氨酸。对于糖基化位点来说，使用若干突变，包括用天冬酰胺置换保守谷氨酰胺或种系突变。对脱酰胺位点的修饰包括用天冬氨酸置换天冬酰胺以及用丝氨酸或丙氨酸置换甘氨酸。不对可能的氧化位点进行修饰。为了增加对fcrn的结合亲和力并因此增加体内igg1mab的半衰期，产生位于ch2和ch3区之间的边界处的若干突变。这些突变包括m252y/s254t/t256e加h433k/n434f(瓦卡罗(vaccaro)c.等人，2005)或t250q/m428l(辛顿(hinton)pr.等人，2004)，它们已经显示增加igg1与fcrn结合。根据制造商的说明书(quikchangeii，安捷伦科技公司(agilenttechnologies)，目录号200521)通过定点诱变产生所有取代。根据技术人员已知的标准技术来验证用于所有构建体的核苷酸序列。

序列表

<110>荷兰库赛尔有限公司（crucellhollandb.v.）

<120>特异性结合微管相关蛋白tau的抗体和抗原结合片段

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<211>23

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gtgctgtccttgctgtcctgctc23

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<211>26

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<400>29

gcactctcccctgttgaagctctttg26

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<211>20

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<211>20

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ctcctctctcactgcacagg20

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ctcctcactcgggacacagg20

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atggcctggacccctctctg20

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<211>24

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<221>r

<222>(7)..(7)

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<220>

<221>r

<222>(7)..(7)

<223>a或g

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<213>合成的

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cgcaaagtgcacttacgtttaatctccagtcgtgtcccttggc43

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<213>合成的

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<213>合成的

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<210>76

<211>27

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<213>合成的

<220>

<221>y

<222>(13)..(13)

<223>c或t

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ctcagaggagggygggaacagagtgac27

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gcttcttggtctccttgctataattatctgggataagcatgctgttttctgtctgtccct120

aacatgccctgtgattatccgcaaacaacacacccaagggcagaactttgttacttaaac180

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actctgttcccrccctcctctgagg25

<210>81

<211>23

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<213>合成的

<400>81

ccggtctagagttttccatggcg23

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<212>dna

<213>合成的

<400>82

tcgggcctcgagactcacc19

<210>83

<211>330

<212>prt

<213>智人

<400>83

alaserthrlysglyproservalpheproleualaproserserlys

151015

serthrserglyglythralaalaleuglycysleuvallysasptyr

202530

pheprogluprovalthrvalsertrpasnserglyalaleuthrser

354045

glyvalhisthrpheproalavalleuglnserserglyleutyrser

505560

leuserservalvalthrvalproserserserleuglythrglnthr

65707580

tyrilecysasnvalasnhislysproserasnthrlysvalasplys

859095

argvalgluprolyssercysasplysthrhisthrcysproprocys

100105110

proalaprogluleuleuglyglyproservalpheleuphepropro

115120125

lysprolysaspthrleumetileserargthrprogluvalthrcys

130135140

valvalvalaspvalserhisgluaspprogluvallyspheasntrp

145150155160

tyrvalaspglyvalgluvalhisasnalalysthrlysproargglu

165170175

gluglntyrasnserthrtyrargvalvalservalleuthrvalleu

180185190

hisglnasptrpleuasnglylysglutyrlyscyslysvalserasn

195200205

lysalaleuproalaproileglulysthrileserlysalalysgly

210215220

glnproarggluproglnvaltyrthrleuproproserarggluglu

225230235240

metthrlysasnglnvalserleuthrcysleuvallysglyphetyr

245250255

proseraspilealavalglutrpgluserasnglyglnprogluasn

260265270

asntyrlysthrthrproprovalleuaspseraspglyserphephe

275280285

leutyrserlysleuthrvalasplysserargtrpglnglnglyasn

290295300

valphesercysservalmethisglualaleuhisasnhistyrthr

305310315320

glnlysserleuserleuserproglylys

325330

<210>84

<211>107

<212>prt

<213>智人

<400>84

argthrvalalaalaproservalpheilepheproproseraspglu

151015

glnleulysserglythralaservalvalcysleuleuasnasnphe

202530

tyrproargglualalysvalglntrplysvalaspasnalaleugln

354045

serglyasnserglngluservalthrgluglnaspserlysaspser

505560

thrtyrserleuserserthrleuthrleuserlysalaasptyrglu

65707580

lyshislysvaltyralacysgluvalthrhisglnglyleuserser

859095

provalthrlysserpheasnargglyglucys

100105

<210>85

<211>18

<212>dna

<213>合成的

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catgtcaccggggtgtgg18

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<211>21

<212>dna

<213>合成的

<400>86

tcacaggggatgttagggaca21

<210>87

<211>117

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>pcr产生的及人类序列的组合

<400>87

glnvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly

151015

serleuargleusercysalaalaserglyphethrphesersertyr

202530

trpmethistrpvalargglnalaproglylysglyleuvaltrpval

354045

serargileasnseraspglyseraspthrasntyralaaspserval

505560

lysglyargphethrpheserargaspasnalalysasnthrleutyr

65707580

leuglnmetthrserleuargalagluaspthralailetyrtyrcys

859095

thrargglyargsertyrglyphepheasptyrtrpglyglnglyala

100105110

leuvalthrvalser

115

<210>88

<211>108

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>pcr产生的及人类序列的组合

<400>88

aspilevalmetthrglnserproaspthrleuserleuserprogly

151015

gluargalathrleusercysargalaserglnileileserserasn

202530

tyrleualatrptyrglnglnglnproglyglnalaproargleuleu

354045

iletyrglyalaserserargalathrglyileproaspargpheser

505560

glyserglyseralathraspphethrleuthrileserargleuglu

65707580

progluaspphealavaltyrtyrcysglnglntyrglythrserpro

859095

argthrpheglyglnglythrlysleugluilelys

100105

<210>89

<211>354

<212>dna

<213>人工的

<220>

<223>pcr产生的及人类序列的组合

<400>89

caggtccagctggtggagtccgggggaggcttagttcagcctggggggtccctgagactc60

tcctgtgcagcgtctggattcaccttcagcagctactggatgcactgggtccgccaagct120

ccagggaaggggctggtgtgggtctcccgtattaatagtgatgggagtgacacaaactac180

gcggactccgtgaagggccgattcaccttctccagagacaacgccaagaacacattgtat240

ctgcagatgaccagtctgcgagccgaggacacggctatatattactgtacaagggggcgc300

agttatggtttctttgactactggggccagggagccctggtcaccgtctcctca354

<210>90

<211>324

<212>dna

<213>人工的

<220>

<223>pcr产生的及人类序列的组合

<400>90

gacatcgtgatgacccagtctccagacaccctgtctttgtctccaggggagagagccacc60

ctctcctgcagggccagtcagattattagcagcaactacttagcctggtaccaacaacaa120

cctggccaggctcccaggctcctcatctatggtgcatccagcagggccacaggcatccca180

gacaggttcagtggcagtgggtctgcgacagacttcactctcaccatcagcagactggag240

cctgaagattttgcagtgtattactgtcagcagtatggtacctcacctcggacgttcggc300

caggggaccaagctggagatcaaa324

<210>91

<211>124

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>pcr产生的及人类序列的组合

<400>91

glnvalglnleuvalgluserargglyglyvalvalglnproglythr

151015

serleuargleusercyslysalaserglyphethrpheserthrtyr

202530

glymethistrpvalargglnalaproglylysalaleuglutrpval

354045

alavaliletrppheaspglyasnasnlystyrtyralaaspserval

505560

lysglyargphethrileserargaspasnserlysasnthrvaltyr

65707580

leuglnmetasnserleuargglygluaspthralavaltyrtyrcys

859095

alaargasptrptrpglualaglycysargprocystyrphepheasp

100105110

tyrtrpglyglnglyserleuvalthrvalserser

115120

<210>92

<211>113

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>pcr产生的及人类序列的组合

<400>92

gluthrthrleuthrglnserproaspserleualavalserleugly

151015

gluargalathrileasncyslysserserglnservalleutyrser

202530

serasnasnlysasntyrleualatrptyrglnglnlysproglygln

354045

proprolysvalleuiletyrtrpalaserthrarggluserglyval

505560

proaspargpheserglyserglyserglythraspphethrleuthr

65707580

ileserserleuglnalagluaspvalalavaltyrtyrcysglngln

859095

tyrtyrserproproleuthrpheglyglyglythrlysleugluile

100105110

lys

<210>93

<211>372

<212>dna

<213>人工的

<220>

<223>pcr产生的及人类序列的组合

<400>93

caggtgcagctggtggagtcgaggggaggcgtggtccagcctgggacgtccctgagactc60

tcctgtaaagcgtctggattcaccttcagcacttatggcatgcactgggtccgccaggct120

ccaggcaaggcgctggagtgggtggcagttatatggtttgatggaaataacaaatattat180

gcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacggtgtat240

ctgcaaatgaacagcctgagaggcgaggacacggctgtttattactgtgcgagagattgg300

tgggaagccgggtgccggccctgttatttctttgactactggggccagggaagcctggtc360

accgtctcctca372

<210>94

<211>339

<212>dna

<213>人工的

<220>

<223>pcr产生的及人类序列的组合

<400>94

gaaacgacactcacgcagtctccagactccctggctgtgtctctgggcgagagggccacc60

atcaactgcaagtccagccagagtgttttatacagctccaacaataagaactacttagct120

tggtaccagcagaaaccaggacagcctcctaaggtgctcatttactgggcttctacccgg180

gaatccggggtccctgaccgattcagtggcagcgggtctgggaccgatttcactctcacc240

atcagcagcctgcaggctgaagatgtggcagtttattactgtcagcaatattatagtcct300

ccgctcactttcggcggagggaccaagctggagatcaaa339

<210>95

<211>127

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>pcr产生的及人类序列的组合

<400>95

gluvalglnleuvalglnserglyglyglyleuvalglnproglygly

151015

serleuargleusercysalaalaserglyphethrpheserasptyr

202530

trpmetsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval

354045

alaasnileasnglnaspglyseralaalatyrtyrvalaspserval

505560

argglyargphethrileserargaspseralagluasnserleuasn

65707580

leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys

859095

alalysaspalahistyrtyraspargasnargasnasntyrtyrtyr

100105110

tyrpheaspphetrpglyglnglythrleuvalthrvalserser

115120125

<210>96

<211>107

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>pcr产生的及人类序列的组合

<400>96

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151015

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atcacctgcgagtccagccacagtcttttatacaggtccaacaataggaactacttagct120

tggtaccagcaaaaaccaagacagcctcctaagttgctcatttactgggcatctacccgg180

gagtccggggtcccagaccgattcagcggcagcgggtctgagacagatttcactctcacc240

atcagcagcctgcgggctgaagatgtggcggtatattactgtcaacaattttatactact300

ccttacacttttggccaagggaccaaggtggagatcaaa339

<210>127

<211>126

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>pcr产生的及人类序列的组合

<400>127

gluvalglnleuvalglnserglyglyglyleuvallysproglygly

151015

serleuargleusercysvalalaserglyilethrpheseraspser

202530

tyrmetsertrpileargglnthrproglylysglyleuglutrpleu

354045

sertyrileserargserserserhisthrasntyralaaspserval

505560

lysglyargphethrileserargaspasnalalysasnserleutyr

65707580

leuglnmetasnserleuargglygluaspthralavaltyrtyrcys

859095

alaargvalglnthrthrmetilegluglylysthrlysleuasntyr

100105110

pheasptyrtrpglyglnglythrleuvalthrvalserser

115120125

<210>128

<211>113

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>pcr产生的及人类序列的组合

<400>128

alaileglnleuthrglnserproaspserleualavalserleugly

151015

gluargvalthrilesercysgluserserhisserleuleutyrarg

202530

serasnasnlysasntyrleualatrptyrglnglnlysproarggln

354045

proprolysleuleuiletyrtrpalaserthrarggluserglyval

505560

proaspargpheserglyserglysergluthraspphethrleuthr

65707580

ileserserleuargalagluaspvalalavaltyrtyrcysglngln

859095

phetyrthrthrprotyrthrpheglyglnglythrlysleugluile

100105110

lys

<210>129

<211>378

<212>dna

<213>人工的

<220>

<223>pcr产生的及人类序列的组合

<400>129

gaggtgcagctggtgcagtctgggggaggcttggtcaagcctggagggtccctgagactc60

tcctgtgtcgcctctggaatcaccttcagtgactcctacatgagctggatccgccagact120

ccagggaaggggctagagtggctttcatacattagtcgtagtagttctcacacaaattac180

gcagactctgtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaattcactatat240

ctccaaatgaatagcctgagaggcgaggacacggctgtgtattactgtgcgagagtccag300

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ctggtcaccgtctcctca378

<210>130

<211>339

<212>dna

<213>人工的

<220>

<223>pcr产生的及人类序列的组合

<400>130

gccatccagttgacccagtctccagactccctggctgtgtctctgggcgagagggtcacc60

atcagctgcgagtccagccacagtcttttatacaggtccaacaataagaactacttagct120

tggtaccagcagaaaccaagacagcctcctaagttgctcatttactgggcatctacccgg180

gagtccggggtcccagaccgattcagcggcagcgggtctgagacagatttcactctcacc240

atcagcagcctgcgggctgaagatgtggcagtgtattactgtcaacaattttatactact300

ccttacacttttggccaggggaccaagctggagatcaaa339

<210>131

<211>122

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>pcr产生的及人类序列的组合

<400>131

glnleuvalglnsergluglyglyleualagluproglyglyserleu

151015

argleusercysalaalaserglyphethrphethrlysalatrpmet

202530

sertrpvalargglnthrproglyargglyleuglutrpleuglyarg

354045

ilelysserlysvalaspglygluthrthrasptyralaalaproval

505560

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leuglnmetthrglyleuargthrgluaspthrglyvaltyrphecys

859095

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100105110

glyargglythrleuvalthrvalserser

115120

<210>132

<211>113

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>pcr产生的及人类序列的组合

<400>132

gluilevalleuthrglnserproaspserleualavalserleugly

151015

gluargvalthrilesercysgluserserhisserleuleutyrarg

202530

serasnasnlysasntyrleualatrptyrglnglnlysproarggln

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proprolysleuleuiletyrtrpalaserthrarggluserglyval

505560

proaspargpheserglyserglysergluthraspphethrleuthr

65707580

ileserserleuargalagluaspvalalavaltyrtyrcysglngln

859095

phetyrthrthrprotyrthrpheglyglnglythrlysleugluile

100105110

lys

<210>133

<211>378

<212>dna

<213>人工的

<220>

<223>pcr产生的及人类序列的组合

<400>133

gaggtgcagctggtgcagtctgggggaggcttggtcaagcctggagggtccctgagactc60

tcctgtgtcgcctctggaatcaccttcagtgactcctacatgagctggatccgccagact120

ccagggaaggggctagagtggctttcatacattagtcgtagtagttctcacacaaattac180

gcagactctgtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaattcactatat240

ctccaaatgaatagcctgagaggcgaggacacggctgtgtattactgtgcgagagtccag300

acaactatgatagaagggaaaacgaaacttaactactttgactactggggccagggaacc360

ctggtcaccgtctcctca378

<210>134

<211>339

<212>dna

<213>人工的

<220>

<223>pcr产生的及人类序列的组合

<400>134

gaaattgtgttgacgcagtctccagactccctggctgtgtctctgggcgagagggtcacc60

atcagctgcgagtccagccacagtcttttatacaggtccaacaataagaactacttagct120

tggtaccagcagaaaccaagacagcctcctaagttgctcatttactgggcatctacccgg180

gagtccggggtcccagaccgattcagcggcagcgggtctgagacagatttcactctcacc240

atcagcagcctgcgggctgaagatgtggcagtgtattactgtcaacaattttatactact300

ccttacacttttggccaggggaccaagctggagatcaaa339

<210>135

<211>124

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>pcr产生的及人类序列的组合

<400>135

glnvalglnleuvalglnserglyglygluvallyslysproglyglu

151015

serleulysilesercyslysglyserglytyrserpheserasntyr

202530

trpilealatrpvalargglnmetproglylysglyleuglucysmet

354045

glyileiletyrproglyaspseraspthrthrtyrserproserphe

505560

glnglyglnvalthrileseralaasplysservalserthrthrtyr

65707580

leuglntrpserserleulysalaseraspseralamettyrtyrcys

859095

alaargleuproargthraspglyaspasnserileglytyrpheglu

100105110

tyrtrpglyglnglythrmetvalthrvalserser

115120

<210>136

<211>113

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>pcr产生的及人类序列的组合

<400>136

gluilevalleuthrglnserproalaserleualavalserleugly

151015

gluargalathrileasncyslysserserglnservalleutyrser

202530

serasnsergluasntyrleualatrptyrglnglnlysproglygln

354045

proprolysleuleuiletyrtrpalaserthrarggluserglyval

505560

proaspargpheserglyserglyserglythraspphethrleuthr

65707580

ileserserleuglnalagluaspvalalavaltyrtyrcysglngln

859095

tyrtyrserthrprophethrpheglyglnglythrargleugluile

100105110

lys

<210>137

<211>372

<212>dna

<213>人工的

<220>

<223>pcr产生的及人类序列的组合

<400>137

caggtgcagctggtgcagtctggaggagaggtgaaaaagccgggggagtctctgaagatc60

tcctgtaagggttctgggtactcctttagtaactactggatcgcctgggtgcgccagatg120

cccgggaaaggcctggagtgcatgggaatcatctatcctggtgactctgataccacatac180

agcccgtccttccaaggccaggtcaccatttctgccgacaagtccgtcagtaccacctac240

ctacaatggagcagcctgaaggcctcggacagcgccatgtattattgtgcgaggctaccc300

cgtacagatggcgacaattccatcggctactttgaatattggggccagggaaccatggtc360

accgtctcttca372

<210>138

<211>345

<212>dna

<213>人工的

<220>

<223>pcr产生的及人类序列的组合

<400>138

gaaattgtgttgacacagtctccagcctccctggctgtgtctctgggcgagagggccacc60

atcaactgcaagtccagccagagtgttttatacagctccaacagtgagaactacttagct120

tggtatcagcagaaaccaggacagcctcccaagttgctcatttactgggcgtctacccgg180

gaatccggggtccctgaccgattcagtggcagcgggtctgggacagatttcactctcacc240

atcagcagcctgcaggctgaagatgtggcagtttattactgtcagcaatattatagtact300

ccattcactttcggccaagggacacgactggagattaaacgtaag345

<210>139

<211>118

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>pcr产生的及人类序列的组合

<400>139

gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly

151015

serleuargleusercysalaalaserglyphethrphesersertyr

202530

sermetasntrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval

354045

sertyrileserserserthrthrthriletyrtyralaaspserval

505560

lysglyargphethrileserargaspasnvallysasnserleutyr

65707580

leuglnmethisserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys

859095

valproalaproargleuglyglysertyrthrtyrtrpglyglngly

100105110

thrleuvalthrvalser

115

<210>140

<211>108

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>pcr产生的及人类序列的组合

<400>140

aspileglnmetthrglnserproglythrleuserleuserprogly

151015

gluargalathrleusercysargalaserglnservalserserser

202530

tyrleualatrptyrglnglnlysproglyglnalaproargleuleu

354045

iletyrglyalaserserargalathrglyileproaspargpheser

505560

glyserglyserglythraspphethrleuthrileserargleuglu

65707580

progluaspphealavaltyrtyrcysglnglntyrglythrserpro

859095

leuthrpheglyglyglythrlysvalgluilelys

100105

<210>141

<211>357

<212>dna

<213>人工的

<220>

<223>pcr产生的及人类序列的组合

<400>141

gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtccctgagactc60

tcctgtgcagcctctggattcaccttcagtagttatagcatgaactgggtccgccaggct120

ccagggaaggggctggagtgggtttcatacattagtagtagtactactaccatatactac180

gcagactctgtgaagggccgattcaccatctccagggacaatgtcaagaactctctgtat240

ctgcaaatgcacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgtcccggccccc300

cggttgggtgggagctacacttactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctca357

<210>142

<211>324

<212>dna

<213>人工的

<220>

<223>pcr产生的及人类序列的组合

<400>142

gacatccagatgacccagtctccaggcaccctgtctttgtctccaggggaaagagccacc60

ctctcctgcagggccagtcagagtgttagcagcagctacttagcctggtaccagcagaaa120

cctggccaggctcccaggctcctcatctatggtgcatccagcagggccactggcatccca180

gacaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagactggag240

cctgaagattttgcagtgtattactgtcagcagtatggcacctcaccgctcactttcggc300

ggagggaccaaggtggaaatcaaa324

<210>143

<211>119

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>pcr产生的及人类序列的组合

<400>143

gluvalglnleuvalgluserglyglyaspleuvallysproglygly

151015

serleuargleusercysalaalaserglyphevalphethraspala

202530

trpmetsertrpvalargglnserproglylysglyproglutrpleu

354045

glyargilelysserlysasnvalglygluthrthrasptyralaglu

505560

hisvalargglyargphethrilealaargaspaspserasnargthr

65707580

leutyrleuglnmetserasnleulysileaspaspthralavaltyr

859095

tyrcysthrthrglyleuglyglyglythrtyrglytrpglyarggly

100105110

thrargvalthrvalserser

115

<210>144

<211>108

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>pcr产生的及人类序列的组合

<400>144

gluilevalleuthrglnserproleuserleuproalathrleugly

151015

glnproalaserilesercysargserseralaglyleuargasnasn

202530

aspglyaspileleuleusertrpphehisglnargproglyglnser

354045

proargargleuphetyrargvalserargargaspserglyvalpro

505560

aspargpheasnglyserglyseralathraspphethrleuargile

65707580

asnservalglualagluaspvalglyiletyrtyrcysmetarggly

859095

protyrtrpglyglnglythrargleugluilelys

100105

<210>145

<211>357

<212>dna

<213>人工的

<220>

<223>pcr产生的及人类序列的组合

<400>145

gaggtgcagctggtggagtctgggggagacttggtaaagcctggggggtcccttagactc60

tcctgtgcagcctctggattcgttttcactgacgcctggatgagctgggtccgccagagt120

cccgggaaggggccggagtggcttggccgtatcaaaagtaaaaatgtcggtgagacaaca180

gactacgctgaacacgtgagaggcagatttaccatcgcaagagatgattccaaccgcact240

ctatatctacaaatgagcaacctgaaaatcgacgacacagccgtctattattgtaccact300

ggactgggaggagggacctacggatggggccggggaacccgggtcaccgtctcttca357

<210>146

<211>324

<212>dna

<213>人工的

<220>

<223>pcr产生的及人类序列的组合

<400>146

gaaattgtgttgacacagtctccactctccctgcccgccacccttggacagccggcctcc60

atctcctgcaggtcgagtgcaggcctccgaaacaacgatggtgacatcctcttgagttgg120

tttcatcagcggccaggccagtctccgaggcgcctattttatagagtttctaggcgtgac180

tctggagtcccagacagattcaacggcagtgggtcagccactgatttcacactgagaatc240

aattctgtggaggctgaagatgttggcatttactactgcatgcgaggaccatattggggc300

caagggacacgactggagattaaa324

<210>147

<211>119

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>pcr产生的及人类序列的组合

<400>147

glnvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglyglu

151015

serleuargleusercysvalalaserglypheasnpheseriletyr

202530

glumetasntrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval

354045

sertyrilethrasnargglyserthriletyrtyralaaspserval

505560

lysglyargphethrileserargaspasnalaglnasnserleutyr

65707580

leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys

859095

alalysproargileglyalaargvalpheaspvaltrpglyglngly

100105110

thrmetvalthrvalserser

115

<210>148

<211>113

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>pcr产生的及人类序列的组合

<400>148

aspileglnleuthrglnserproaspserleualavalserleugly

151015

gluargalathrileasncyslysserserglnthrleuleutyrlys

202530

serasnasngluasntyrleualatrptyrglnglnlysproglygln

354045

proprolysleuleuiletyrtrpalaserthrarggluserglyval

505560

proaspargpheserglyserglyserglythraspphethrleuthr

65707580

ileserserleuglnalagluaspvalalavaltyrtyrcysglngln

859095

tyrphethrthralaleuthrpheglyglyglythrlysvalgluile

100105110

lys

<210>149

<211>357

<212>dna

<213>人工的

<220>

<223>pcr产生的及人类序列的组合

<400>149

caggtacagctggtggagtctgggggaggcttggtacagcctggagagtccctgagactc60

tcctgtgtagcctctggattcaacttcagtatttatgagatgaattgggtccgccaggct120

ccagggaaggggctggagtgggtttcatacattaccaatcgaggtagtaccatatactac180

gcagactctgtgaagggccgattcaccatctccagggacaacgcccagaactcactgtat240

ctgcaaatgaacagcctgagagccgaagacacggctgtttattactgtgcgaaaccccgt300

ataggagctcgtgtatttgatgtctggggccaagggacaatggtcaccgtctcctca357

<210>150

<211>339

<212>dna

<213>人工的

<220>

<223>pcr产生的及人类序列的组合

<400>150

gacatccagttgacccagtctccagactccctggctgtgtctctgggcgagagggccacc60

atcaactgcaagtccagccagactcttttatacaagtccaacaatgagaactacttagct120

tggtaccagcagaaaccaggacagcctccaaagctgctcatttactgggcatctactcgg180

gaatccggggtccctgaccgattcagtggcagcgggtctgggacagatttcactctcacc240

atcagcagcctgcaggctgaggatgtggcagtttactactgtcagcaatattttactact300

gcgctcactttcggcggagggaccaaggtggagatcaaa339

<210>151

<211>121

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>pcr产生的及人类序列的组合

<400>151

glnvalglnleuvalgluserglyalavalvallyslysproglyglu

151015

serleulysilesercysglualaserglytyrmetpheleuasphis

202530

trpileglytrpvalargglnmetproglylysglyleuglutrpmet

354045

glyileilepheprogluaspseraspthrargtyrserglyserphe

505560

gluglyglnvalthrileseralaaspargservalasnthrvaltyr

65707580

leuglutrpserserleulysalaseraspthralamettyrtyrcys

859095

alaargvalservalvalarglysglyglytrppheaspprotrpgly

100105110

glnglythrleuvalthrvalserser

115120

<210>152

<211>113

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>pcr产生的及人类序列的组合

<400>152

alaileglnleuthrglnserproaspserleualavalserleugly

151015

gluargalathrileasncyslysserserglnserleuleutyrthr

202530

serasnasnlysasntyrleualatrptyrglnglnlysproglygln

354045

thrprolysleuleuileiletrpalaserthrarggluserglyval

505560

proaspargphethrglyserglyserglythraspphethrleuthr

65707580

ileserserleuglnalagluaspvalalavaltyrtyrcysglngln

859095

tyrtyrasnserprotyrthrpheglyglnglythrargleugluile

100105110

lys

<210>153

<211>363

<212>dna

<213>人工的

<220>

<223>pcr产生的及人类序列的组合

<400>153

caggtgcagctggtgcagtctggagcagtggtgaaaaagcccggggagtctctgaagatc60

tcctgtgaggcttctggatacatgttcctcgatcactggatcggctgggtgcgccagatg120

cccgggaaaggcctggagtggatgggaatcatctttcctgaggactctgataccagatat180

agtgggtccttcgaaggccaggtcaccatctcagccgacaggtccgtcaacaccgtctac240

ctggagtggagcagcctgaaggcctcggacaccgccatgtattattgtgcgagagtctca300

gtagttcgtaaagggggctggttcgacccatggggccagggaaccacggtcaccgtctcc360

tca363

<210>154

<211>339

<212>dna

<213>人工的

<220>

<223>pcr产生的及人类序列的组合

<220>

<221>尚未归类的特征

<222>(5)..(6)

<223>n是a、c、g、或t

<400>154

gaaanncaactgacgcagtctccagactccctggctgtgtctctgggcgagagggccacc60

atcaactgcaagtccagccagagtcttttatacacctccaacaataagaactacttagct120

tggtaccagcagaaaccaggacagactcctaaactgctcattatctgggcctctacccga180

gaatccggggtccctgaccgattcactggcagcgggtctgggacagatttcactctcacc240

atcagcagcctgcaggctgaagatgtggcagtttattactgtcagcaatattataatagt300

ccgtacacttttggccaagggacacgactggagattaaa339

<210>155

<211>121

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>pcr产生的及人类序列的组合

<400>155

glnvalglnleuvalgluserglyalagluleulyslysproglyglu

151015

serleulysilesercysglualaserglytyrilephealaasphis

202530

trpileglytrpvalargglnmetproglylysglyleuglutrpmet

354045

glyileilepheproglyaspseraspileargtyrserproserphe

505560

gluglyglnvalthrileservalaspargservalserthralaphe

65707580

leuglntrpserserleulysalaseraspthralamettyrphecys

859095

alaargvalalavalvalarglysglyglytrppheaspsertrpgly

100105110

glnglythrargvalthrvalserser

115120

<210>156

<211>113

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>pcr产生的及人类序列的组合

<400>156

gluilevalmetthrglnserprogluserleualavalserleugly

151015

gluargalathrileasncyslysserthrglnserleuleutrpser

202530

alaasnasnlysasntyrleualatrptyrargglnlysproarggln

354045

thrprogluleuleuilethrtrpalaserthrarggluserglyval

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proaspargpheserglyserglyserglythraspphethrleuthr

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lys

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<212>dna

<213>人工的

<220>

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tca363

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<212>dna

<213>人工的

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<212>prt

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151015

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<212>prt

<213>人工的

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<212>prt

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gly

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1510

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<212>prt

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ala

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<211>17

<212>prt

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gly

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<212>prt

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ala

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<211>5

<212>prt

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gly

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<212>prt

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ser

<210>253

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<212>prt

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lysserserglnserleuphetyrserglyasnserlysasppheleu

151015

ala

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<212>prt

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<212>prt

<213>智人

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202530

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<210>302

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<211>110

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<220>

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<222>(9)..(9)

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151015

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151015

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<220>

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<221>mod_res

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<220>

<221>mod_res

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20

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151015

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<220>

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<220>

<221>mod_res

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2025

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151015

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<220>

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151015

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20

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151015

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<210>334

<211>26

<212>prt

<213>合成的

<220>

<221>mod_res

<222>(11)..(11)

<223>磷酸化

<220>

<221>mod_res

<222>(19)..(19)

<223>磷酸化

<400>334

gluproprolysserglyaspargserglytyrserserproglyser

151015

proglythrproglyserargserargthr

2025

<210>335

<211>18

<212>prt

<213>合成的

<220>

<221>磷酸化

<222>(11)..(12)

<223>在氨基酸11处的丝氨酸的磷酸化

<220>

<221>mod_res

<222>(11)..(11)

<223>磷酸化

<400>335

proprolysserglyaspargserglytyrserserproglyserpro

151015

glythr

<210>336

<211>19

<212>prt

<213>合成的

<220>

<221>mod_res

<222>(11)..(11)

<223>磷酸化

<220>

<221>mod_res

<222>(12)..(12)

<223>磷酸化

<400>336

proprolysserglyaspargserglytyrserserproglyserpro

151015

glythrpro

<210>337

<211>22

<212>prt

<213>合成的

<220>

<221>mod_res

<222>(11)..(11)

<223>磷酸化

<220>

<221>mod_res

<222>(15)..(15)

<223>磷酸化

<400>337

proprolysserglyaspargserglytyrserserproglyserpro

151015

glythrproglyserarg

20

<210>338

<211>25

<212>prt

<213>合成的

<220>

<221>mod_res

<222>(11)..(11)

<223>磷酸化

<220>

<221>mod_res

<222>(18)..(18)

<223>磷酸化

<400>338

proprolysserglyaspargserglytyrserserproglyserpro

151015

glythrproglyserargserargthr

2025

<210>339

<211>18

<212>prt

<213>合成的

<220>

<221>mod_res

<222>(11)..(11)

<223>磷酸化

<400>339

prolysserglyaspargserglytyrserserproglyserprogly

151015

thrpro

<210>340

<211>21

<212>prt

<213>合成的

<220>

<221>mod_res

<222>(11)..(11)

<223>磷酸化

<220>

<221>mod_res

<222>(14)..(14)

<223>磷酸化

<400>340

prolysserglyaspargserglytyrserserproglyserprogly

151015

thrproglyserarg

20

<210>341

<211>24

<212>prt

<213>合成的

<220>

<221>mod_res

<222>(11)..(11)

<223>磷酸化

<220>

<221>mod_res

<222>(14)..(14)

<223>磷酸化

<400>341

prolysserglyaspargserglytyrserserproglyserprogly

151015

thrproglyserargserargthr

20

<210>342

<211>20

<212>prt

<213>合成的

<400>342

lysserglyaspargserglytyrserserproglyserproglythr

151015

proglyserarg

20

<210>343

<211>18

<212>prt

<213>合成的

<220>

<221>mod_res

<222>(11)..(11)

<400>343

glyaspargserglytyrserserproglyserproglythrprogly

151015

serarg

<210>344

<211>21

<212>prt

<213>合成的

<220>

<221>mod_res

<222>(11)..(11)

<223>磷酸化

<220>

<221>mod_res

<222>(14)..(14)

<223>磷酸化

<400>344

glyaspargserglytyrserserproglyserproglythrprogly

151015

serargserargthr

20

<210>345

<211>24

<212>prt

<213>合成的

<220>

<221>mod_res

<222>(11)..(11)

<223>磷酸化

<220>

<221>mod_res

<222>(17)..(17)

<223>磷酸化

<400>345

glyaspargserglytyrserserproglyserproglythrprogly

151015

serargserargthrproserleu

20

<210>346

<211>26

<212>prt

<213>合成的

<220>

<221>mod_res

<222>(11)..(11)

<223>磷酸化

<220>

<221>mod_res

<222>(19)..(19)

<223>磷酸化

<400>346

glyaspargserglytyrserserproglyserproglythrprogly

151015

serargserargthrproserleuprothr

2025

<210>347

<211>18

<212>prt

<213>合成的

<220>

<221>mod_res

<222>(11)..(11)

<223>磷酸化

<400>347

serglytyrserserproglyserproglythrproglyserargser

151015

argthr

<210>348

<211>21

<212>prt

<213>合成的

<220>

<221>mod_res

<222>(11)..(11)

<223>磷酸化

<220>

<221>mod_res

<222>(14)..(14)

<223>磷酸化

<400>348

serglytyrserserproglyserproglythrproglyserargser

151015

argthrproserleu

20

<210>349

<211>23

<212>prt

<213>合成的

<220>

<221>mod_res

<222>(11)..(11)

<223>磷酸化

<220>

<221>mod_res

<222>(16)..(16)

<223>磷酸化

<400>349

serglytyrserserproglyserproglythrproglyserargser

151015

argthrproserleuprothr

20

<210>350

<211>25

<212>prt

<213>合成的

<220>

<221>mod_res

<222>(11)..(11)

<223>磷酸化

<220>

<221>mod_res

<222>(18)..(18)

<223>磷酸化

<400>350

serglytyrserserproglyserproglythrproglyserargser

151015

argthrproserleuprothrpropro

2025

<210>351

<211>20

<212>prt

<213>合成的

<400>351

serglytyrserserproglyserproglythrproglyserargser

151015

argthrproser

20

<210>352

<211>18

<212>prt

<213>合成的

<220>

<221>mod_res

<222>(11)..(11)

<223>磷酸化

<400>352

serserproglyserproglythrproglyserargserargthrpro

151015

serleu

<210>353

<211>20

<212>prt

<213>合成的

<220>

<221>mod_res

<222>(11)..(11)

<223>磷酸化

<220>

<221>mod_res

<222>(13)..(13)

<223>磷酸化

<400>353

serserproglyserproglythrproglyserargserargthrpro

151015

serleuprothr

20

<210>354

<211>22

<212>prt

<213>合成的

<220>

<221>mod_res

<222>(11)..(11)

<223>磷酸化

<220>

<221>mod_res

<222>(15)..(15)

<223>磷酸化

<400>354

serserproglyserproglythrproglyserargserargthrpro

151015

serleuprothrpropro

20

<210>355

<211>24

<212>prt

<213>合成的

<220>

<221>mod_res

<222>(11)..(11)

<223>磷酸化

<220>

<221>mod_res

<222>(17)..(17)

<223>磷酸化

<400>355

serserproglyserproglythrproglyserargserargthrpro

151015

serleuprothrproprothrarg

20

<210>356

<211>20

<212>prt

<213>合成的

<400>356

serserproglyserproglythrproglyserargserargthrpro

151015

serleuprothr

20

<210>357

<211>20

<212>prt

<213>合成的

<220>

<221>mod_res

<222>(11)..(11)

<223>磷酸化

<220>

<221>mod_res

<222>(13)..(13)

<223>磷酸化

<400>357

proglyserproglythrproglyserargserargthrproserleu

151015

prothrpropro

20

<210>358

<211>22

<212>prt

<213>合成的

<220>

<221>mod_res

<222>(11)..(11)

<223>磷酸化

<220>

<221>mod_res

<222>(15)..(15)

<223>磷酸化

<400>358

proglyserproglythrproglyserargserargthrproserleu

151015

prothrproprothrarg

20

<210>359

<211>25

<212>prt

<213>合成的

<220>

<221>mod_res

<222>(11)..(11)

<223>磷酸化

<220>

<221>mod_res

<222>(18)..(18)

<223>磷酸化

<400>359

proglyserproglythrproglyserargserargthrproserleu

151015

prothrproprothrarggluprolys

2025

<210>360

<211>18

<212>prt

<213>合成的

<220>

<221>mod_res

<222>(11)..(11)

<223>磷酸化

<400>360

serproarghisleuserasnvalserserthrglyserileaspmet

151015

valasp

<210>361

<211>26

<212>prt

<213>合成的

<220>

<221>mod_res

<222>(11)..(11)

<223>磷酸化

<220>

<221>mod_res

<222>(17)..(17)

<223>磷酸化

<400>361

serproarghisleuserasnvalserserthrglyserileaspmet

151015

valaspserproglnleualathrleuala

2025

<210>362

<211>19

<212>prt

<213>合成的

<400>362

proarghisleuserasnvalserserthrglyserileaspmetval

151015

aspserpro

<210>363

<211>18

<212>prt

<213>合成的

<220>

<221>mod_res

<222>(11)..(11)

<223>磷酸化

<400>363

arghisleuserasnvalserserthrglyserileaspmetvalasp

151015

serpro

<210>364

<211>20

<212>prt

<213>合成的

<400>364

serasnvalserserthrglyserileaspmetvalaspserprogln

151015

leualathrleu

20

<210>365

<211>18

<212>prt

<213>合成的

<220>

<221>mod_res

<222>(11)..(11)

<223>磷酸化

<400>365

serserthrglyserileaspmetvalaspserproglnleualathr

151015

leuala

<210>366

<211>23

<212>prt

<213>合成的

<220>

<221>mod_res

<222>(11)..(11)

<223>磷酸化

<220>

<221>mod_res

<222>(16)..(16)

<223>磷酸化

<400>366

serserthrglyserileaspmetvalaspserproglnleualathr

151015

leualaaspgluvalserala

20

<210>367

<211>68

<212>prt

<213>合成的

<400>367

glygluproprolysserglyaspargserglytyrserserprogly

151015

serproglythrproglyserargserargthrproserleuprothr

202530

proprothrarggluprolyslysvalalavalvalargthrpropro

354045

lysserproserseralalysserargleuglnthralaprovalpro

505560

metproaspleu

65

<210>368

<211>18

<212>prt

<213>合成的

<220>

<221>mod_res

<222>(11)..(11)

<223>磷酸化

<400>368

arggluprolyslysvalalavalvalargthrproprolysserpro

151015

serser

<210>369

<211>22

<212>prt

<213>合成的

<220>

<221>mod_res

<222>(15)..(15)

<223>磷酸化

<400>369

arggluprolyslysvalalavalvalargthrproprolysserpro

151015

serseralalysserarg

20

<210>370

<211>24

<212>prt

<213>合成的

<220>

<221>mod_res

<222>(11)..(11)

<223>磷酸化

<220>

<221>mod_res

<222>(17)..(17)

<223>磷酸化

<400>370

arggluprolyslysvalalavalvalargthrproprolysserpro

151015

serseralalysserargleugln

20

<210>371

<211>18

<212>prt

<213>合成的

<220>

<221>mod_res

<222>(11)..(11)

<223>磷酸化

<400>371

lysvalalavalvalargthrproprolysserproserseralalys

151015

serarg

<210>372

<211>20

<212>prt

<213>合成的

<220>

<221>mod_res

<222>(11)..(11)

<223>磷酸化

<220>

<221>mod_res

<222>(13)..(13)

<223>磷酸化

<400>372

lysvalalavalvalargthrproprolysserproserseralalys

151015

serargleugln

20

<210>373

<211>18

<212>prt

<213>合成的

<220>

<221>mod_res

<222>(11)..(11)

<223>磷酸化

<400>373

alavalvalargthrproprolysserproserseralalysserarg

151015

leugln

<210>374

<211>19

<212>prt

<213>合成的

<220>

<221>mod_res

<222>(11)..(11)

<223>磷酸化

<220>

<221>mod_res

<222>(12)..(12)

<223>磷酸化

<400>374

alavalvalargthrproprolysserproserseralalysserarg

151015

leuglnthr

<210>375

<211>20

<212>prt

<213>合成的

<400>375

hisvalproglyglyglyservalglnilevaltyrlysprovalasp

151015

leuserlysval

20

<210>376

<211>20

<212>prt

<213>合成的

<400>376

valtyrlysprovalaspleuserlysvalthrserlyscysglyser

151015

leuglyasnile

20

<210>377

<211>20

<212>prt

<213>合成的

<400>377

thrserlyscysglyserleuglyasnilehishislysproglygly

151015

glyglnvalglu

20

<210>378

<211>20

<212>prt

<213>合成的

<400>378

hishislysproglyglyglyglnvalgluvallysserglulysleu

151015

aspphelysasp

20

<210>379

<211>20

<212>prt

<213>合成的

<400>379

vallysserglulysleuaspphelysaspargvalglnserlysile

151015

glyserleuasp

20

<210>380

<211>21

<212>prt

<213>合成的

<400>380

argvalglnserlysileglyserleuaspasnilethrhisvalpro

151015

glyglyglyasnlys

20

<210>381

<211>20

<212>prt

<213>合成的

<400>381

glyleulysgluserproleuglnthrprothrgluaspglyserglu

151015

gluproglyser

20

<210>382

<211>20

<212>prt

<213>合成的

<400>382

thrgluaspglyserglugluproglysergluthrseraspalalys

151015

serthrprothr

20

<210>383

<211>18

<212>prt

<213>合成的

<220>

<221>mod_res

<222>(11)..(11)

<223>磷酸化

<400>383

gluproglysergluthrseraspalalysserthrprothralaglu

151015

aspval

<210>384

<211>20

<212>prt

<213>合成的

<400>384

gluthrseraspalalysserthrprothralagluaspvalthrala

151015

proleuvalasp

20

<210>385

<211>20

<212>prt

<213>合成的

<400>385

alagluaspvalthralaproleuvalaspgluglyalaproglylys

151015

glnalaalaala

20

<210>386

<211>22

<212>prt

<213>合成的

<400>386

gluglyalaproglylysglnalaalaalaglnprohisthrgluile

151015

progluglythrthrala

20

<210>387

<211>20

<212>prt

<213>合成的

<400>387

glyaspargserglytyrserserproglyserproglythrprogly

151015

serargserarg

20

<210>388

<211>26

<212>prt

<213>合成的

<220>

<221>mod_res

<222>(16)..(16)

<223>磷酸化

<220>

<221>mod_res

<222>(19)..(19)

<223>磷酸化

<400>388

alaproprolysserglyaspargserglytyrserserproglyser

151015

proglythrproglyserargserargthr

2025

<210>389

<211>26

<212>prt

<213>合成的

<220>

<221>mod_res

<222>(16)..(16)

<223>磷酸化

<220>

<221>mod_res

<222>(19)..(19)

<223>磷酸化

<400>389

glualaprolysserglyaspargserglytyrserserproglyser

151015

proglythrproglyserargserargthr

2025

<210>390

<211>26

<212>prt

<213>合成的

<220>

<221>mod_res

<222>(16)..(16)

<223>磷酸化

<220>

<221>mod_res

<222>(19)..(19)

<223>磷酸化

<400>390

gluproalalysserglyaspargserglytyrserserproglyser

151015

proglythrproglyserargserargthr

2025

<210>391

<211>26

<212>prt

<213>合成的

<220>

<221>mod_res

<222>(16)..(16)

<223>磷酸化

<220>

<221>mod_res

<222>(19)..(19)

<223>磷酸化

<400>391

gluproproalaserglyaspargserglytyrserserproglyser

151015

proglythrproglyserargserargthr

2025

<210>392

<211>26

<212>prt

<213>合成的

<220>

<221>mod_res

<222>(16)..(16)

<223>磷酸化

<220>

<221>mod_res

<222>(19)..(19)

<223>磷酸化

<400>392

gluproprolysalaglyaspargserglytyrserserproglyser

151015

proglythrproglyserargserargthr

2025

<210>393

<211>26

<212>prt

<213>合成的

<220>

<221>mod_res

<222>(16)..(16)

<223>磷酸化

<220>

<221>mod_res

<222>(18)..(18)

<223>磷酸化

<400>393

gluproprolysseralaaspargserglytyrserserproglyser

151015

proglythrproglyserargserargthr

2025

<210>394

<211>26

<212>prt

<213>合成的

<220>

<221>mod_res

<222>(16)..(16)

<223>磷酸化

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<222>(16)..(16)

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<221>mod_res

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<223>磷酸化

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151015

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2025

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<223>磷酸化

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<223>磷酸化

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151015

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2025

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151015

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2025

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<223>磷酸化

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151015

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151015

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<220>

<221>mod_res

<222>(19)..(19)

<223>磷酸化

<400>404

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151015

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<220>

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gluproprolysserglyaspargserglytyrserserproglyser

151015

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2025

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151015

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151015

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2025

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<221>mod_res

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arghisleuserasnvalserserthrglyserileaspmetvalasp

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<221>mod_res

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arghisleuserasnvalserserthrglyserileaspmetvalasp

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20

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<212>prt

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<221>mod_res

<222>(11)..(11)

<223>磷酸化

<220>

<221>mod_res

<222>(17)..(17)

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arghisleuserasnvalserserthrglyserileaspmetvalasp

151015

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20

<210>433

<211>24

<212>prt

<213>合成的

<220>

<221>mod_res

<222>(11)..(11)

<223>磷酸化

<220>

<221>mod_res

<222>(17)..(17)

<223>磷酸化

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arghisleuserasnvalserserthrglyserileaspmetvalasp

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20

<210>434

<211>24

<212>prt

<213>合成的

<220>

<221>mod_res

<222>(11)..(11)

<223>磷酸化

<220>

<221>mod_res

<222>(17)..(17)

<223>磷酸化

<400>434

arghisleuserasnvalserserthrglyserileaspmetvalasp

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20

<210>435

<211>24

<212>prt

<213>合成的

<220>

<221>mod_res

<222>(11)..(11)

<223>磷酸化

<220>

<221>mod_res

<222>(17)..(17)

<223>磷酸化

<400>435

arghisleuserasnvalserserthrglyserileaspmetvalasp

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20

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<212>prt

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<220>

<221>mod_res

<222>(11)..(11)

<223>磷酸化

<220>

<221>mod_res

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<223>磷酸化

<400>436

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151015

serseralalysserargleuglnthr

2025

<210>437

<211>25

<212>prt

<213>合成的

<220>

<221>mod_res

<222>(11)..(11)

<223>磷酸化

<220>

<221>mod_res

<222>(18)..(18)

<223>磷酸化

<400>437

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151015

serseralalysserargleuglnthr

2025

<210>438

<211>25

<212>prt

<213>合成的

<220>

<221>mod_res

<222>(11)..(11)

<223>磷酸化

<220>

<221>mod_res

<222>(18)..(18)

<223>磷酸化

<400>438

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151015

serseralalysserargleuglnthr

2025

<210>439

<211>25

<212>prt

<213>合成的

<220>

<221>mod_res

<222>(11)..(11)

<223>磷酸化

<220>

<221>mod_res

<222>(18)..(18)

<223>磷酸化

<400>439

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151015

proseralalysserargleuglnthr

2025

<210>440

<211>25

<212>prt

<213>合成的

<220>

<221>mod_res

<222>(11)..(11)

<223>磷酸化

<220>

<221>mod_res

<222>(18)..(18)

<223>磷酸化

<400>440

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151015

serseralalysserargleuglnthr

2025

<210>441

<211>25

<212>prt

<213>合成的

<220>

<221>mod_res

<222>(11)..(11)

<223>磷酸化

<220>

<221>mod_res

<222>(18)..(18)

<223>磷酸化

<400>441

arggluprolyslysvalalaalavalargthrproprolysserpro

151015

serseralalysserargleuglnthr

2025

<210>442

<211>25

<212>prt

<213>合成的

<220>

<221>mod_res

<222>(11)..(11)

<223>磷酸化

<220>

<221>mod_res

<222>(18)..(18)

<223>磷酸化

<400>442

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151015

serseralalysserargleuglnthr

2025

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<221>mod_res

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leuserlysvalthrserlyscysgly

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leuglnthrprothrgluaspglyserglugluproglysergluthr

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<221>mod_res

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leuglnthrprothrgluaspglyserglugluproglysergluthr

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<220>

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alacyscysalathrcysalacyscys

2025