嵌合自身抗体受体T细胞的组合物和方法与流程

相关申请的交叉引用

本申请要求2014年5月2日提交的美国临时申请号61/987,989的优先权和权益，该申请通过引用以其全文并入本文。

关于联邦资助的研究或开发的声明

本发明是根据由美国国立卫生研究院(nationalinstitutesofhealth)授予的ar057001在政府支持下进行。政府在本发明中享有一定的权利。

背景技术：

自身免疫是美国第三最常见的疾病类型，影响8％的人口。有两种基本类型的自身免疫性疾病：主要由t细胞引起的那些，以及主要由b细胞和它们产生的自身抗体引起的那些。寻常性天疱疮(pv)是模型自身抗体介导的疾病，其中针对皮肤细胞粘附蛋白桥粒芯蛋白3(dsg3)的自身抗体引起皮肤和粘膜的潜在致命的起泡。

目前的疗法集中于一般免疫抑制以减少所有抗体，但这些策略还靶向保护我们免受感染的良好抗体。因为天疱疮是慢性缓解-复发性疾病，所以这种治疗与多种副作用相关，包括致命感染和继发性癌症的风险。例如，已报道利妥昔单抗(抗cd20单克隆抗体试剂)在治疗寻常性天疱疮中具有优异的功效，其中95％的患者在3个月内实现水疱的完全愈合，并且35％的患者在长期随访期间实现所有全身治疗的完全缓解。然而，大于80％的患者将复发(大概因为利妥昔单抗的cd20+b细胞消耗的功效通常是不完全的)，并且严重感染并不罕见，据报道在7％的用利妥昔单抗治疗的自身免疫性疾病患者中发生，其中致命感染为1％-2％。因此，患有严重自身免疫性疾病(如寻常性天疱疮、副肿瘤天疱疮或落叶型天疱疮)的患者不再因其疾病而死亡，而是患有治疗并发症。

然而，目前不存在pv的治疗仅靶向自身反应性b细胞的治疗策略。系统性皮质类固醇、硫唑嘌呤、霉酚酸酯和环磷酰胺在治疗pv方面有效，但非特异性抑制淋巴细胞增殖。利妥昔单抗靶向在大多数b细胞上表达的cd20，但是缺乏仅对自身反应性b细胞的特异性。

因此，治疗策略可以引起与一般免疫抑制相关的严重副作用，包括致命感染和继发性癌症。因此，存在对仅靶向自身反应性b细胞的治疗的需要。

本发明的概述

如下所述，本发明包括对自身抗体具有特异性的嵌合自身抗体受体(caar)的组合物及其使用方法。

本发明的一方面包括编码嵌合自身抗体受体(caar)的分离的核酸序列，其中分离的核酸序列包括自身抗原的核酸序列或其片段、跨膜结构域的核酸序列、共刺激分子的胞内结构域的核酸序列和信号传导结构域的核酸序列。

在另一方面，本发明包括载体，该载体包括本文所述的分离的核酸序列。

在仍另一方面，本发明包括分离的嵌合自身抗体受体(caar)，该嵌合自身抗体受体包括包含自身抗原或其片段的胞外结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域。

在又另一方面，本发明包括包含本文所述的caar的遗传修饰的细胞。

在上述方面或本文描述的本发明的任何其他方面的各种实施方式中，自身抗原选自：dsg1、dsg3及其片段。在一个实施方式中，自身抗原包括dsg3，该dsg3包括选自以下的氨基酸序列：seqidno：3、seqidno：4、seqidno：5、seqidno：6、seqidno：7、seqidno：8、seqidno：9、seqidno：10、seqidno：11、seqidno：12、和seqidno：36。

在另一个实施方式中，自身抗原包括dsg3，分离的核酸序列还包括编码dsg3的前肽的核酸序列。在包括dsg3前肽的一些实施方式中，其包括seqidno：2的氨基酸序列。

在另一个实施方式中，分离的核酸序列还包括cd8α链信号肽的核酸序列。在包括cd8α链信号肽的一些实施方式中，其包括seqidno：1的氨基酸序列。

在又另一个实施方式中，跨膜结构域的核酸序列编码cd8α链铰链和跨膜结构域。在包括cd8α链铰链和跨膜结构域的一些实施方式中，跨膜结构域包括seqidno：13的氨基酸序列。

在仍另一个实施方式中，分离的核酸序列还包括肽接头的核酸序列。在包括肽接头的一些实施方式中，其包括seqidno：14的氨基酸序列。

在另一个实施方式中，胞内信号传导结构域的核酸序列包括编码cd137胞内结构域的核酸序列。在包括cd137胞内结构域的一些实施方式中，胞内信号传导结构域包括seqidno：15的氨基酸序列。

在又另一个实施方式中，胞内信号传导结构域的核酸序列包括编码cd3ζ信号传导结构域的核酸序列。在包括cd3ζ信号传导结构域的一些实施方式中，胞内信号传导结构域包括seqidno：16的氨基酸序列。

在一个实施方式中，包括caar的细胞表达它，并且对在b细胞上表达的自身抗体具有高亲和力。在另一个实施方式中，细胞表达caar并诱导杀伤表达自身抗体的b细胞。在仍另一个实施方式中，细胞表达caar，并且对结合fc受体的抗体具有低亲和力。在又另一个实施方式中，细胞表达caar并且对健康细胞具有有限的毒性。在另一个实施方式中，细胞选自：辅助t细胞、细胞毒性t细胞、记忆t细胞、调节性t细胞、γδt细胞、天然杀伤(nk)细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞、其细胞系和其他效应细胞。

在另一个方面，本发明包括用于治疗受试者中的自身免疫性疾病的方法，该方法包括：向受试者给予有效量的遗传修饰的t细胞，该t细胞包括编码嵌合自身抗体受体(caar)的分离的核酸序列，其中分离的核酸序列包括包含自身抗原或其片段的胞外结构域，跨膜结构域的核酸序列和胞内信号传导结构域的核酸序列，从而治疗受试者中的自身免疫性疾病。自身免疫性疾病包括寻常性天疱疮、副肿瘤天疱疮和落叶型天疱疮。

在上述方面或本文描述的本发明的任何其他方面的各种实施方式中，受试者是人。在另一个实施例中，修饰的t细胞靶向b细胞。

附图的简要说明

当结合附图阅读时，将更好地理解本发明的优选实施方式的以下详细描述。为阐明本发明，在附图中示出了目前优选的实施方式。然而，应当理解，本发明不限于附图中所示的实施方式的精确安排和手段。

图1是描述建议的嵌合自身抗体受体(caar)如何区别于所有之前开发的技术的示意图。

图2是图示，显示工程化嵌合t细胞受体靶向dsg3特异性b细胞。

图3是图示，显示dsg特异性记忆b细胞的靶向和去除短寿命抗体分泌b细胞。

图4是包括桥粒芯蛋白3(dsg3)嵌合自身抗体受体(caar)的蛋白质结构域的示意图。

图5是图像，显示来自外周血单核细胞的cdna的dsg3caar中使用的单个结构域的扩增。

图6是图像，显示来自外周血单核细胞cdna的dsg3caar中使用的cd137的扩增。

图7是一组图像，显示来自质粒dn653的dsg3caar中使用的dsg3的扩增。

图8是图像，显示在还原条件下dsg3caar的蛋白质印迹，以确定在293t细胞的转化和细胞裂解后48小时的蛋白质表达。dsg3e-his杆状病毒上清液是阳性对照，未转染的hek293t细胞是阴性对照。未糖基化蛋白的预期大小为96kda，其通常随着糖基化以约112kd迁移。

图9是示意图，描述测试dsg3caar对预期和非预期靶标的特异性的实验。

图10是一组流式细胞术图，其显示在暴露于预期靶标后的dsg3caar信号。用抗体包被的珠以3∶1的比例(珠∶细胞)刺激表达dsg3-caar的nfat-gfpjurkat细胞。ak23、pv4b3和pv2b7是dsg3特异性mab，其如果结合至caar，应该触发导致gfp表达的信号传导。ef1a启动子比pgk启动子更好地起作用，并导致特异性信号传导。ss1＝抗间皮素car，阳性对照，具有基线阳性活性。非转导，阴性对照，没有检测到gfp信号。

图11是一组流式细胞术图，显示dsg3caar在暴露于多克隆寻常性天疱疮(pv)患者血清igg后诱导低水平但特异性的信号传导(反映了dsg3特异性的总igg的低总体百分比)。

图12是一组流式细胞术图，显示dsg3caar以剂量依赖性方式响应低数量的表面igg+细胞(ak23杂交瘤)。

图13是一组流式细胞术图，显示当暴露于表达dsg3的角质细胞时，通过没有诱导信号传导的dsg3caar的安全性，表明dsg3与角质细胞上的桥粒钙粘素的相互作用不应当导致皮肤或粘膜毒性。

图14是示意图，显示用于测试针对表达抗dsg3表面自身抗体的靶细胞和表达表面fc受体的脱靶细胞的细胞毒性的不同情况，所述表面fc受体可结合血清pv自身抗体，导致非预期的重定向裂解。

图15是一组图，显示dsg3caar未显示针对表达预先负载有pv抗-dsg3mab(pv2b7)的表面fc受体的k562细胞系的重定向裂解。

图16a是电泳凝胶的图像，显示不同的dsg3胞外结构域(ec2-3、ec1-2、ec1-3、ec1-4和ec1-5)的扩增，其被构建以优化dsg3caar细胞毒性，因为caar介导的细胞毒性的功效取决于效应细胞和靶细胞之间的距离。

图16b是图16a中扩增的dsg3胞外结构域的示意图。

图17是一组流式细胞术图，显示dsgec1-3、ec1-4、ec1-5caar可以在原代人t细胞中表达，并被3种不同的pv抗dsg3mab、ak23、px44和f779识别。ec1-2没有有效表达。21d4＝阴性对照car。

图18是一组图，显示dsg3caar对抗dsg3igg小鼠杂交瘤的功效(意在模拟在细胞表面上显示抗dsg3igg的pv特异性人记忆b细胞或浆母细胞)。在原代人t细胞的表面上表达的dsg3caar显示了在4小时后在铬释放测定中ak23(抗dsg3杂交瘤)的特异性体外杀伤。

图19是一组图，显示24小时后铬释放测定中ak23杂交瘤的dsg3caar杀伤随时间增加。caar的杀伤效力与caar大小相关(越短越好，因此ec1-3＞ec1-4＞ec1-5)。模拟品＝抗人cd19car；人cd19不在靶杂交瘤细胞上表达。不表达dsg3-自身抗体的对照杂交瘤(bk2)在24小时内显示通过dsg3caar的一些杀伤，可能是由于人-小鼠同种异体反应性。

图20是图，显示在4小时铬释放测定中由dsg3caart细胞杀伤靶向不同dsg3表位的抗dsg3细胞。值代表具有来自不同正常供体(nd)的t细胞的至少4个实验。

图21是图，显示在4小时铬释放测定中由dsg3caart细胞杀伤靶向另外不同人dsg3表位的抗dsg3细胞。

图22是一组图像，显示抗dsg杂交瘤的表面igg密度与人记忆b细胞相当。考虑不同的细胞类型以计算相对靶密度。

图23是图，显示针对dsg3caar的不同靶抗体的相对亲和力elisa，表明dsg3caart细胞在抗体亲和力范围内杀伤靶细胞。

图24是一组图，显示即使在可溶性阻断抗dsg3抗体存在下，dsg3caart细胞也被杀伤。所有条件的效应因子与靶标(e∶t)比例：30∶1。⁵¹cr，8小时。

图25是一组图，显示dsg3caart细胞没有通过体外逆转抗体依赖性细胞毒性(radcc)杀伤可以结合pv患者血清中的可溶性抗dsg3抗体的表达fc受体的细胞。

图26是图，显示dsg3caart细胞不杀伤原代角质细胞。

图27是图，显示dsg3caart细胞在体内有效控制分泌生物发光igg的抗-dsg3杂交瘤细胞。

图28是一组图，通过流式细胞术分析显示在来自图27中逃避dsg3caart处理的4只小鼠中，生物发光“逃逸”杂交瘤不表达表面igg，解释了为什么它们不再被dsg3caart细胞靶向。右边3个小图上的数字表示单个小鼠。9406和9407显示表面igg阴性的gfp+细胞，表明这些细胞不被dsg3caart细胞靶向。

图29是图，显示移植入小鼠的dsg3caart细胞的存在和移植。

图30a是图，显示血液中dsg3caart细胞的存在。

图30b是图，显示骨髓中dsg3caart细胞的存在。

图30c是图，显示脾中dsg3caart细胞的存在。

图31是图，显示dsgcaart细胞在体内不引起针对表达fcγr的嗜中性粒细胞和单核细胞的radcc。参考值由水平线表示。nsg小鼠不具有b、t淋巴细胞/nk细胞。

图32a是图，显示在注射dsg3ec1-3caart的小鼠中ak23肿瘤负荷的生物发光。

图32b是图，显示对照和注射dsg3ec1-3caart的ak23荷瘤小鼠的存活。

图33是一组图，显示dsg3ec1-4caart细胞在体内显示针对广泛靶的功效(在注射后第0-3天生物发光成像)。

图34是一组图，显示dsg3ec1-4caart细胞在体内显示针对广泛靶的功效(在注射后第7-13天生物发光成像)。

图35是一组图，显示基于存活曲线，其中总通量10e8定义为死亡，dsg3ec1-4caart细胞在体内针对广泛靶表现出功效。

图36是包括桥粒芯蛋白1(dsg1)嵌合自身抗体受体(caar)的蛋白质结构域的示意图。

图37a是一组图，显示由dsg1caart细胞通过靶向ec1和ec2结构域杀伤两种不同抗-dsg1细胞。

图37b是一组图，显示dsg1caart细胞没有非特异性杀伤野生型k562细胞或表达抗dsg3抗体pvb28的k562细胞。

图38是桥粒芯蛋白1或3嵌合自身抗体受体(caar)中的kir结构域的示意图。

图39a是图，显示出在16小时铬释放测定中通过dsg3ec1-3和dsg3ec1-4kir-caart细胞杀伤抗dsg3(pvb28抗-ec2)细胞。

图39b是图，显示没有发生通过dsg3kircaar杀伤野生型k562细胞。

发明详细说明

本发明包括包含对自身抗体具有特异性的至少一种嵌合自身抗体受体(caar)的组合物，包括其的载体，包括包装在病毒颗粒中的caar载体的组合物和包括caar的重组t细胞。本发明还包括制备表达caar(caart)的遗传修饰的t细胞的方法，其中所表达的caar包括桥粒芯蛋白胞外结构域。

本发明还一般涉及t细胞工程化以表达嵌合自身抗体受体(caar)以治疗与自身抗原表达相关的自身免疫性疾病的用途。在一个实施方式中，表达本发明的caar的t细胞特异性结合并杀伤表达桥粒芯蛋白1或3自身抗体的细胞，但不结合并杀伤表达正常抗体的细胞。

定义

除非另外指明，本文所用的所有科学技术术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同意义。虽然类似或等同于本文所描述的方法和材料的任何方法和材料均可用于本发明的实践和/或测试中，但本文描述了优选的材料和方法。在描述和要求保护本发明中，将根据在提供定义的情况下，术语如何定义，来使用以下术语。

还应当理解，本文所使用的术语仅用于描述具体实施方式的目的，并不旨在进行限制。

在此使用的冠词“一个”或“一种”(“a”和“an”)指的是一个/种或多于一个/种(即，至少一个/种)该冠词的语法宾语。通过举例，“一个元件”意指一个元件或多于一个元件。

当指可测量的值例如量、持续时间等时，本文使用的“约”意在涵盖与规定值的±20％或±10％，在一些情况下±5％，在一些情况下±1％，并且在一些情况下±0.1％的偏差，因为这样的变化适于执行所披露的方法。

本文所用的术语“抗体”是指与抗原结合的免疫球蛋白分子。抗体可以是源自天然来源或源自重组来源的完整免疫球蛋白，并且可以是完整免疫球蛋白的免疫反应性部分。抗体通常是免疫球蛋白分子的四聚体。本发明中的抗体可以以多种形式存在，其中抗体作为连续多肽链的部分表达，该多肽链包括例如单结构域抗体片段(sdab)，单链抗体(scfv)和人源化抗体(哈洛(harlow)等人，1999，在：使用抗体：实验手册(usingantibodies：alaboratorymanual)中，冷泉港实验室出版社，纽约州；哈洛等人，1989，在：抗体：实验手册(antibodies：alaboratorymanual)中，冷泉港，纽约州；休斯顿(houston)等人，1988，美国国家科学院院刊(proc.natl.acad.sci.usa)85：5879-5883；伯德(bird)等人，1988，科学(science)242：423-426)。

本文使用的术语“高亲和力”是指在一个分子与靶分子的结合或相互作用或吸引中的高特异性。

本文使用的术语“抗原”或“ag”定义为引发免疫应答的分子。这种免疫应答可涉及抗体产生，或特异性免疫活性细胞的活化，或两者。技术人员将理解，任何大分子，包括几乎所有蛋白质或肽，可以用作抗原。此外，抗原可以源自重组或基因组dna。因此，本领域技术人员将理解，包括编码引发免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何dna编码如本文所使用的术语“抗原”。此外，本领域技术人员将理解，抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码。显而易见的是，本发明包括但不限于使用多于一个基因的部分核苷酸序列，并且这些核苷酸序列以各种组合排列以编码引起所需免疫应答的多肽。此外，本领域技术人员将理解，抗原根本不需要由“基因”编码。显而易见的是，抗原可以是合成的或可以源自生物样品。这样的生物样品可以包括但不限于组织样品，肿瘤样品，细胞或生物流体。

“自身抗原”意指刺激产生自身免疫应答(如产生自身抗体)的内源性抗原。自身抗原还包括来自正常组织的自体抗原或抗原，该正常组织是细胞介导的或抗体介导的免疫应答的靶标，其可导致自身免疫性疾病的发展。自身抗原的实例包括但不限于桥粒芯蛋白1，桥粒芯蛋白3及其片段。

本文所用的术语“有限毒性”是指本发明的肽，多核苷酸，细胞和/或抗体表现出在体外或体内对健康细胞、非肿瘤细胞、非疾病细胞，非靶细胞或这些细胞的群体缺乏基本上消极的生物学效应，抗肿瘤效应或基本上消极的生理学症状。

“自身抗体”是指由对自身抗原具有特异性的b细胞产生的抗体。

本文所用的术语“自身免疫性疾病”定义为由针对自身抗原的抗体介导的自身免疫应答产生的障碍或病症。自身免疫性疾病导致产生不适当地产生和/或过度产生的针对自身抗原或自身抗原的自身抗体。

如本文所使用的，术语“自体的”意指来源于随后被重新引入个体中的相同个体的任何材料。

“同种异体”是指源自相同物种的不同动物的移植物。

“异种”指源自不同物种的动物的移植物。

“嵌合自身抗体受体”或“caar”是指在t细胞或任何其他能够细胞介导细胞毒性的效应细胞类型上表达的工程化受体。caar包括对致病性自身抗体具有特异性的抗原或其片段。caar还包括跨膜结构域，胞内结构域和信号传导结构域。

如本文所用，术语“保守序列修饰”旨在是指不显著影响或改变包含氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。这类保守修饰包括氨基酸取代、添加以及缺失。可以通过本领域已知的标准技术(例如定点诱变以及pcr介导的诱变)将多种修饰引入本发明的抗体中。保守性氨基酸取代是氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代的取代。在本领域中已经确定了具有类似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有以下各项的氨基酸：碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)，不带电极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，β-支链的侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，例如，本发明的caar的胞外区域内的一个或多个氨基酸残基可以被具有相似侧链或电荷的其他氨基酸残基替换，并且可以使用本文所述的功能测定来测试改变的caar结合自身抗体的能力。

“共刺激配体”，如本文所用的术语，包括特异性结合t细胞上的同源共刺激分子的抗原呈递细胞(例如aapc、树突细胞、b细胞等)上的分子，从而提供除了由例如tcr/cd3复合物与负载有肽的mhc分子的结合提供的初级信号之外的信号，该信号介导t细胞应答，这些t细胞应答包括但不限于增殖、活化、分化等。

“共刺激分子”是指t细胞上的同源结合伴侣，其与共刺激配体特异性结合，从而介导通过t细胞的共刺激应答，如但不限于增殖。共刺激分子包括但不限于mhci类分子、btla和toll配体受体。

“桥粒芯蛋白1”或“dsg1”是指钙结合跨膜糖蛋白，其是在上皮细胞之间的细胞-细胞连接中发现的桥粒的组分。示例性dsg1序列包括在genbank登录号nm_001942和np_001932处发现的人dsg1或其片段，和在nm_010079或np_034209处发现的小鼠dsg1序列或其片段。

“桥粒芯蛋白3”或“dsg3”是指钙结合跨膜糖蛋白，其是在上皮细胞之间的细胞-细胞连接中发现的桥粒的组分。示例性dsg3序列包括在genbank登录号nm_001944和np_001935(p32926)处发现的人dsg3或其片段，和在nm_030596或np_085099处发现的小鼠dsg3序列或其片段。

“编码”是指用作在具有核苷酸的限定序列(即，rrna、trna和mrna)或氨基酸的限定序列的生物过程中合成其他聚合物和大分子的模板的多核苷酸(如基因、cdna或mrna)中核苷酸的特定序列的固有性质，及由其产生的生物学性质。因此，如果对应于该基因的mrna的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则基因编码蛋白质。编码链(其核苷酸序列与mrna序列相同并且通常在序列表中提供)和非编码链(其用作基因或cdna转录的模板)都可以称为编码该基因或cdna的蛋白质或其他产物。

除非另有说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此是简并版本并且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质和rna的核苷酸序列可以包括内含子。

“有效量”或“治疗有效量”在本文中可互换使用，并且是指如本文所述有效实现特定生物学结果的化合物，配制品，材料或组合物的量。这样的结果可以包括但不限于：通过本领域任何合适的手段确定的病毒感染的抑制。

如本文所用，“内源性”是指来自生物体、细胞、组织或系统内的或在生物体、细胞、组织或系统内产生的任何材料。

如本文所用，术语“外源”是指从生物体、细胞、组织或系统外引入或生物体、细胞、组织或系统外产生的任何材料。

本文使用的术语“表达”定义为由启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。

“表达载体”是指包括重组多核苷酸的载体，该重组多核苷酸包括可操作地连接至待表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包括用于表达的足够的顺式作用元件；用于表达的其他元件可以由宿主细胞或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域已知的所有那些，如掺入重组多核苷酸的粘粒，质粒(例如，裸露的或包含在脂质体中的)，反转录转座子(例如，背驮式，睡美人)和病毒(例如，慢病毒，逆转录病毒，腺病毒和腺相关病毒)。

本文所用的“同源的”是指两个聚合物分子之间，例如，两个核酸分子之间，如，两个dna分子或两个rna分子，或两个多肽分子之间的亚基序列一致性。当两个分子两者中的亚基位置被相同的单体亚基占据时；例如，如果两个dna分子的每一个中的位置被腺嘌呤占据，则它们在该位置是同源的。两个序列之间的同源性是匹配或同源位置数目的直接函数；例如，如果两个序列中的位置的一半(例如，长度为十个亚基的聚合物中的五个位置)是同源的，则这两个序列是50％同源的；如果90％的位置(例如，10个中的9个)匹配或同源，则两个序列是90％同源的。

本文所用的“一致性”是指两个聚合物分子之间，特别是两个氨基酸分子之间，如两个多肽分子之间的亚基序列一致性。当两个氨基酸序列在相同位置处具有相同的残基时；例如，如果两个多肽分子的每一个中的位置被精氨酸占据，则它们在该位置是一致的。两个氨基酸序列在比对中在相同位置具有相同残基的一致性或程度通常表示为百分比。两个氨基酸序列之间的一致性是匹配或相同位置数量的直接函数；例如，如果两个序列中位置的一半(例如，长度为十个氨基酸的聚合物中的五个位置)是一致的，则这两个序列是50％一致的；如果90％的位置(例如，10个中的9个)匹配或一致，则两个氨基酸序列是90％一致的。

如本文所用，“指导(教学，instructional)材料”包括可用于传达本发明的组合物和方法的有用性的出版物，记录，图表或任何其他表达媒介。本发明的试剂盒的说明材料可以，例如，附于包含本发明的核酸、肽和/或组合物的容器中，或者与包含核酸、肽和/或组合物的容器一起装运。可替代地，指导材料可以与容器分开装运，目的是指导材料和化合物由接受者协同使用。

“胞内结构域”是指位于细胞内的分子的部分或区域。

“分离的”意指从天然状态改变或除去。例如，天然存在于活动物中的核酸或肽不是“分离的”，但是从其天然状态的共存物质部分或完全分离的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以以基本上纯的形式存在，或可以存在于非天然环境像例如宿主细胞中。

在本发明的上下文中，使用通常出现的核酸碱基的以下缩写。“a”是指腺苷，“c”是指胞嘧啶，“g”是指鸟苷，“t”是指胸苷，并且“u”是指尿苷。

除非另有说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此是简并版本并且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质或rna的短语核苷酸序列还可包括内含子，其程度使得编码蛋白质的核苷酸序列在一些形式中可包含内含子(一个或多个)。

本文所用的“慢病毒”是指逆转录病毒科的属。慢病毒在逆转录病毒中是独特的，能够感染非分裂细胞；它们可以将大量的遗传信息递送到宿主细胞的dna中，因此它们是基因递送载体的最有效的方法之一。hiv、siv和fiv都是慢病毒的实例。源自慢病毒的载体提供在体内实现显著水平的基因转移的手段。

术语“可操作地连接”是指调节序列和异源核酸序列之间的功能性键联，导致后者的表达。例如，当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能关系时，将第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子可操作地连接于编码序列。通常，可操作连接的dna序列是连续的，并且在必要时，在相同的阅读框中，连接两个蛋白质编码区。

免疫原性组合物的“肠胃外”给予包括，例如，皮下(s.c.)，静脉内(i.v.)，肌内(i.m.)或胸骨内注射或输注技术。

本文使用的术语“多核苷酸”定义为核苷酸链。此外，核酸是核苷酸的聚合物。因此，本文所用的核酸和多核苷酸是可互换的。本领域技术人员具有核酸是多核苷酸的常识，这些多核苷酸可以水解成单体“核苷酸”。单体核苷酸可以水解成核苷。如本文所用，多核苷酸包括但不限于：通过本领域可用的任何手段获得的所有核酸序列，包括但不限于：重组手段，即，使用普通克隆技术和pcr^tm等，以及通过合成手段，从重组文库或细胞基因组克隆核酸序列。

如本文所用，术语“肽”，“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并且是指由通过肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白质或肽必须包含至少两个氨基酸，并且对可以包括蛋白质或肽序列的氨基酸的最大数量没有限制。多肽包括包括通过肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白质。如本文所用，该术语是指短链，其在本领域中通常还称为，例如，肽、寡肽和寡聚体，并且是指较长链，其在本领域中通常称为蛋白质，其中有许多类型。“多肽”包括，例如，生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同源二聚体、异源二聚体、多肽变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或其组合。

术语“促炎细胞因子”是指促进炎症或炎症应答的细胞因子或因子。促炎细胞因子的实例包括但不限于：趋化因子(ccl、cxcl、cx3cl、xcl)，白介素(例如il-1、il-2、il-3、il-5、il-6、il-7、il-9、il10和il-15)，干扰素(ifnγ)和肿瘤坏死因子(tnfα和tnfβ)。

本文使用的术语“启动子”定义为由启动多核苷酸序列的特异性转录所需的细胞合成机制或引入的合成机制识别的dna序列。

如本文所用，术语“启动子/调节序列”意指表达与启动子/调节序列可操作地连接的基因产物所需的核酸序列。在一些情况下，该序列可以是核心启动子序列，并且在其他情况下，该序列还可以包括增强子序列和表达基因产物所需的其他调节元件。启动子/调节序列可以是例如以组织特异性方式表达基因产物的启动子/调节序列。

“组成型”启动子是当与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，使得基因产物在细胞的大多数或所有生理条件下在细胞中产生的核苷酸序列。

“诱导型”启动子是当与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，使得基本上仅当对应于启动子的诱导子存在于细胞中时在细胞中产生基因产物的核苷酸序列。

“组织特异性”启动子是当与由基因编码或指定的多核苷酸可操作地连接时，使得基本上仅在细胞是对应于启动子的组织类型的细胞时在细胞中产生基因产物的核苷酸序列。

“信号传导途径”是指在将信号从细胞的一部分传递到细胞的另一部分中发挥作用的多种信号传导分子之间的生化关系。短语“细胞表面受体”包括能够接收信号并跨细胞膜传递信号的分子和分子复合物。

“信号传导结构域”是指响应于活化信号而募集并与特异性蛋白质相互作用的分子的部分或区域。

术语“受试者”旨在包括可引起免疫应答的活生物体(例如，哺乳动物)。

如本文所用，“基本上纯的”细胞是基本上不含其他细胞类型的细胞。基本上纯化的细胞还指已经从通常与其天然存在状态相关的其他细胞类型分离的细胞。在一些情况下，基本上纯的细胞群体是指同源的细胞群体。在其他情况下，该术语简单地指已经从与其天然状态天然相关的细胞分离的细胞。在一些实施方式中，细胞在体外培养。在其他实施方式中，细胞不在体外培养。

本文所用的术语“治疗的”是指治疗和/或预防。通过抑制，缓解或根除疾病状态获得治疗效果。

如本文所用的术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指将外源核酸转移或引入宿主细胞的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经用外源核酸转染、转化或转导的细胞。细胞包括原代受试细胞及其后代。

“跨膜结构域”是指跨越脂双层膜的分子的部分或区域。

如本文所用的短语“在转录控制下”或“可操作地连接”意指启动子相对于多核苷酸处于正确的位置和取向，以控制rna聚合酶的转录的启动和多核苷酸的表达。

“载体”是包括分离的核酸并且可以用于将分离的核酸递送至细胞内部的物质的组合物。许多载体是本领域已知的，包括但不限于线性多核苷酸，与离子或两亲化合物相关的多核苷酸，质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制质粒或病毒。该术语还应解释为包括促进核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，如，例如聚赖氨酸化合物，脂质体等。病毒载体的实例包括但不限于：腺病毒载体，腺相关病毒载体，逆转录病毒载体，慢病毒载体等。

本文所用的术语“特异性结合”意指识别并结合样品中存在的同源结合伴侣(cognatebindingpartner)蛋白(例如，存在于t细胞上的刺激和/或共刺激分子)的抗体、或配体，但是该抗体或配体基本上不识别或结合该样品中的其它分子。

术语“刺激”意指通过刺激分子(例如，tcr/cd3复合物)与其同源配体结合从而介导信号传导事件而诱导的初级应答，该信号传导事件如但不限于：通过tcr/cd3复合物的信号传导。刺激可介导某些分子的改变的表达，例如tgf-β的下调，和/或细胞骨架结构的重新组织等。

本文所用的术语“刺激分子”意指与在抗原呈递细胞上存在的同源刺激配体(cognatestimulatoryligand)特异性结合的t细胞上的分子。

本文所用的“刺激配体”意指当存在于抗原呈递细胞(例如aapc，树突细胞，b细胞等)上时可与t细胞上的同源结合伴侣特异性结合，从而通过t细胞介导初级应答的配体(在本文中称为“刺激分子”)，该初级应答包括但不限于：活化，免疫应答的启动，增殖等。刺激配体是本领域公知的，并且尤其涵盖装载有肽的mhci类分子，抗cd3抗体，超级激动剂抗cd28抗体和超级激动剂抗cd2抗体。

范围：贯穿本披露，本发明的各个方面可以以范围格式呈现。应当理解，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应被解释为对本发明的范围的不灵活的限制。因此，范围的描述应当被认为已经具体披露了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，如从1至6的范围的描述应当被认为已经具体披露了子范围，如从1至3，从1至4，从1至5，从2至4，从2至6，从3至6等，以及该范围内的单个数字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。无论范围的宽度为多少，此均适用。

嵌合自身抗体受体(caar)

本发明部分基于嵌合自身抗体受体可用于靶向引起自身免疫性疾病的自身抗体的发现。本发明包括包含对自身抗体特异的至少一种嵌合自身抗体受体(caar)的组合物，包括其的载体，包括包装在病毒颗粒中的caar载体的组合物，和包括caar的重组t细胞或其它效应细胞。本发明还包括制备表达caar(caart)的遗传修饰的t细胞的方法，其中所表达的caar包括桥粒芯蛋白胞外结构域。

已经描述了许多自身抗体介导的疾病的抗原。本发明包括用于治疗自身抗体介导的疾病的技术。特别地，靶向最终产生自身抗体并在其细胞表面上显示自身抗体的b细胞的技术将这些b细胞标记为用于治疗性干预的疾病特异性靶。因此，本发明包括通过使用抗原特异性(例如，桥粒芯蛋白3)嵌合自身抗体受体(或caar)靶向引起疾病的b细胞而有效靶向和杀伤自身免疫性疾病中的致病性b细胞的方法。在本发明的一个实施方式中，只有表达特异性抗dsg3自身抗体的b细胞被杀伤，从而留下保护免受感染的完整的有益b细胞和抗体。

本发明涵盖重组dna构建体，该重组dna构建体包括编码胞外结构域的核酸序列，该胞外结构域包括自身抗原或其片段，在一方面，人dsg1、dsg3或其片段，其中自身抗原或其片段的序列可操作地连接于胞内信号传导结构域的核酸序列。胞内信号传导结构域或其它细胞质结构域包括共刺激信号传导区。共刺激信号传导区域是指包括共刺激分子的胞内结构域的caar的部分。共刺激分子是有效t细胞活化所需的细胞表面分子。

在一方面，本发明包括编码嵌合自身抗体受体(caar)的分离的核酸序列，其中该分离的核酸序列包括包含自身抗原或其片段的胞外结构域，跨膜结构域的核酸序列和胞内信号传导结构域的核酸序列。

自身抗原部分

在一个示例性实施方式中，基因工程化的嵌合自身抗体受体包括在t细胞的细胞表面上的主要的寻常性天疱疮自身抗原，桥粒芯蛋白3(dsg3)或其片段。在该实施方式中，caar包括前肽，如人桥粒芯蛋白3前肽(人桥粒芯蛋白3的氨基酸24-49)：elrietkgqydeeemtmqqakrrqkr(seqidno：2)。人dsg3前肽防止dsg3蛋白在细胞的合成途径内粘附于其自身，并被晚高尔基体中的弗林蛋白酶或弗林蛋白酶样肽酶切掉。在一个实施方式中，编码caar的分离的核酸序列包括dsg3的前肽的核酸序列。在另一个实施方式中，dsg3的前肽编码包括seqidno：2的氨基酸序列。在又另一个实施方式中，caar包括dsg3的前肽。在仍另一个实施方式中，caar包括包含seqidno：2的dsg3的前肽，如：

a)人桥粒芯蛋白3胞外结构域1-5(人桥粒芯蛋白3的氨基酸50-615，uniprotp32926。dsg3的胞外结构域提供了自身免疫dsg3特异性b细胞的靶。

ewvkfakpcregednskrnpiakitsdyqatqkityrisgvgidqppfgifvvdkntgdinitaivdreetpsflitcralnaqgldvekpliltvkildindnppvfsqqifmgeieensasnslvmilnatdadepnhlnskiafkivsqepagtpmfllsrntgevrtltnsldreqassyrlvvsgadkdgeglstqcecnikvkdvndnfpmfrdsqysarieenilssellrfqvtdldeeytdnwlavyfftsgnegnwfeiqtdprtnegilkvvkaldyeqlqsvklsiavknkaefhqsvisryrvqstpvtiqvinvregiafrpasktftvqkgisskklvdyilgtyqaidedtnkaasnvkyvmgrndggylmidsktaeikfvknmnrdstfivnktitaevlaideytgktstgtvyvrvpdfndncptavlekdavcssspsvvvsartlnnrytgpytfaledqpvklpavwsittlnatsallraqeqippgvyhislvltdsqnnrcemprsltlevcqcdnrgicgtsypttspgtrygrphsgr(seqidno：3)。

b)与a)相同，但仅具有ec1-2结构域(人桥粒芯蛋白3的氨基酸50-268，p32926)。(seqidno：4)。

c)与a)相同，但仅具有ec1-3结构域(人桥粒芯蛋白3的氨基酸50-383，p32926)。(seqidno：5)。

d)与a)相同，但仅具有ec1-4结构域(人桥粒芯蛋白3的氨基酸50-499，p32926)。(seqidno：6)。

e)与a)相同，但仅具有ec2-3结构域(人桥粒芯蛋白3的氨基酸159-383，p32926)。(seqidno：7)。

f)与a)相同，但仅具有ec3-4结构域(人桥粒芯蛋白3的氨基酸269-499，p32926)。(seqidno：8)。

g)与a)相同，但仅具有ec4-5结构域(人桥粒芯蛋白3的氨基酸386-615，p32926)。(seqidno：9)。

h)与a)相同，但仅具有ec2-4结构域(人桥粒芯蛋白3的氨基酸159-499，p32926)。(seqidno：10)。

i)与a)相同，但仅具有ec3-5结构域(人桥粒芯蛋白3的氨基酸269-615，p32926)。(seqidno：11)。

k)与a)相同，但仅具有ec2-5结构域(人桥粒芯蛋白3的氨基酸159-615，p32926)。(seqidno：12)。

在一个实施方式中，dsg3胞外结构域的核酸序列编码选自下列的氨基酸序列：seqidno：3、seqidno：4、seqidno：5、seqidno：6、seqidno：7、seqidno：8、seqidno：9、seqidno：10、seqidno：11、和seqidno：12。在另一个实施方式中，caar包括dsg3胞外结构域，该dsg3胞外结构域包括选自以下的氨基酸序列：seqidno：3、seqidno：4、seqidno：5、seqidno：6、seqidno：7、seqidno：8、seqidno：9、seqidno：10、seqidno：11、和seqidno：12。

在一个实施方式中，核酸序列与本文所述的任何核酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性或同源性。在另一个实施方式中，氨基酸序列与本文所述的任何氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性或同源性。

在另一方面，本文所述的构建体包括包含自身抗原或其片段的胞外结构域。在一个实施方式中，自身抗原选自：dsg1、dsg3及其片段。

在一个实施方式中，本发明的caar包括另外称为自身抗原的自身抗体结合结构域或其片段。用于本发明的自身抗原的选择取决于所靶向的自身抗体的类型。例如，可以选择自身抗原，因为它识别与特定疾病状态(例如，自身免疫性疾病)相关的靶细胞(如b细胞)上的自身抗体。

在一些情况下，有利的是自身抗体结合结构域源自其中caar最终将被使用的相同物种。例如，为了用于人，可能有益的是caar的自身抗体结合结构域包括结合自身抗体或其片段的自身抗原。因此，在一个实施方式中，自身抗体结合结构域部分包括结合自身抗体的自身抗原的表位。表位是被自身抗体特异性识别的自身抗原的部分。

跨膜结构域

在一个实施方式中，caar包括跨膜结构域，如但不限于：人t细胞表面糖蛋白cd8α链铰链和/或跨膜结构域(人t细胞表面糖蛋白cd8α链的氨基酸136-203)。kptttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvit(seqidno：13)。人cd8链铰链和/或跨膜结构域提供嵌合自身抗体受体的细胞表面呈递。

关于跨膜结构域，在各种实施方式中，caar包括融合至caar的胞外结构域的跨膜结构域。在一个实施方式中，caar包括天然与caar中的结构域之一关联的跨膜结构域。在一些情况下，通过氨基酸取代来选择或修饰跨膜结构域，以避免结合相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域，以便使与受体复合物的其它成员的相互作用最小化。

跨膜结构域可以源自天然来源或源自合成来源。当来源是天然的时，结构域可以源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。在一个实施方式中，跨膜结构域可以是合成的，在这种情况下，它将主要包括疏水性残基，如亮氨酸和缬氨酸。在一方面，苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体将在合成跨膜结构域的每个末端发现。任选地，长度为2至10个氨基酸之间的短寡肽或多肽接头可以形成caar的跨膜结构域和细胞质信号传导结构域之间的键联。甘氨酸-丝氨酸双联体提供特别合适的接头。

在一些情况下，还可以使用多种人类铰链，包括人ig(免疫球蛋白)铰链。

铰链和/或跨膜结构域的实例包括但不限于：t细胞受体的α、β或ζ链的铰链和/或跨膜结构域，cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154、kir、ox40、cd2、cd27、lfa-1(cd11a、cd18)、icos(cd278)、4-1bb(cd137)、gitr、cd40、baffr、hvem(lightr)、slamf7、nkp80(klrf1)、cd160、cd19、il2rβ、il2rγ、il7rα、itga1、vla1、cd49a、itga4、ia4、cd49d、itga6、vla-6、cd49f、itgad、cd11d、itgae、cd103、itgal、cd11a、lfa-1、itgam、cd11b、itgax、cd11c、itgb1、cd29、itgb2、cd18、lfa-1、itgb7、tnfr2、dnam1(cd226)、slamf4(cd244、2b4)、cd84、cd96(触觉的(tactile))、ceacam1、crtam、ly9(cd229)、cd160(by55)、psgl1、cd100(sema4d)、slamf6(ntb-a、ly108)、slam(slamf1、cd150、ipo-3)、blame(slamf8)、selplg(cd162)、ltbr、pag/cbp、nkp44、nkp30、nkp46、nkg2d、和/或nkg2c。

在一个实施方式中，跨膜结构域的核酸序列编码cd8α链铰链和/或跨膜结构域。在另一个实施方式中，cd8α链铰链和/或跨膜结构域的核酸序列编码包括seqidno：13的氨基酸序列。

在又另一个实施方式中，跨膜结构域包括cd8α链铰链和/或跨膜结构域。

胞质域

本发明的caar的细胞质结构域或其它胞内信号传导结构域负责其中已经放置caar的免疫细胞的至少一种正常效应子功能的活化。

术语“效应子功能”是指细胞的特化功能。

例如，t细胞的效应子功能可以是溶细胞活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。因此，术语“胞内信号传导结构域”是指蛋白质的一部分，其转导效应子功能信号并指导细胞进行特化功能。虽然可以使用整个胞内信号传导结构域，但在许多情况下，不必使用整个结构域。就使用胞内信号传导结构域的截短部分来说，此类截短部分可用于代替完整结构域，只要其转导效应子功能信号即可。

因此，术语“胞内信号传导结构域”意在包括足以转导效应子功能信号的胞内结构域的任何截短部分。

用于本发明的caar中的胞内信号传导结构域的实例包括但不限于：t细胞受体(tcr)和共同受体的细胞质部分(其一致作用以在抗原受体结合后开始信号传导)，以及这些元件的任何衍生物或变体以及具有相同功能能力的任何合成序列。

众所周知，通过单独的tcr产生的信号不足以完全活化t细胞，并且还需要次级或共刺激信号。因此，t细胞活化可以说是由两种不同类型的细胞质信号传导序列介导：通过tcr起始抗原依赖性初级活化的那些(初级细胞质信号传导序列)和以抗原非依赖性方式起作用以提供次级或共刺激信号的那些(次级细胞质信号传导序列)。

原代细胞质信号传导序列以刺激方式或以抑制方式调节tcr复合物的初级活化。以刺激方式起作用的原代细胞质信号传导序列可以包含已知作为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或itam的信号传导基序。

胞内信号传导结构域的实例包括来自一个或多个分子或受体的片段或结构域，包括但不限于：cd3ζ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd86、常见的fcrγ、fcrβ(fcεr1b)、cd79a、cd79b、fcγriia、dap10、dap12、t细胞受体(tcr)、cd27、cd28、4-1bb(cd137)、ox40、cd30、cd40、pd-1、icos、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、light、nkg2c、b7-h3、与cd83特异性结合的配体、cds、icam-1、gitr、baffr、hvem(lightr)、slamf7、nkp80(klrf1)、cd127、cd160、cd19、cd4、cd8α、cd8β、il2rβ、il2rγ、il7rα、itga4、vla1、cd49a、itga4、ia4、cd49d、itga6、vla-6、cd49f、itgad、cd11d、itgae、cd103、itgal、cd11a、lfa-1、itgam、cd11b、itgax、cd11c、itgb1、cd29、itgb2、cd18、lfa-1、itgb7、tnfr2、trance/rankl、dnam1(cd226)、slamf4(cd244、2b4)、cd84、cd96(触觉的(tactile))、ceacam1、crtam、ly9(cd229)、cd160(by55)、psgl1、cd100(sema4d)、cd69、slamf6(ntb-a、ly108)、slam(slamf1、cd150、ipo-3)、blame(slamf8)、selplg(cd162)、ltbr、lat、gads、slp-76、pag/cbp、nkp44、nkp30、nkp46、nkg2d，本文所述的其它共刺激分子，其任何衍生物，变体或片段，具有相同功能能力的共刺激分子的任何合成序列，及其任何组合。

在优选的实施例中，caar的胞内信号传导结构域包括cd3-ζ信号传导结构域自身或与本发明的caar背景中有用的任何其它所希望的细胞质结构域(一个或多个)组合的cd3-ζ信号传导结构域。例如，caar的胞内信号传导结构域可以包括cd3ζ链部分和共刺激信号传导区。共刺激信号传导区域是指包括共刺激分子的胞内结构域的caar的部分。共刺激分子是除了淋巴细胞对抗原有效应答所需的抗原受体或其配体以外的细胞表面分子。

在又另一个实施方式中，胞内信号传导结构域编码cd137胞内结构域。在又另一个实施方式中，cd137胞内结构域包括seqidno：15，如人t细胞表面糖蛋白cd3ζ链亚型3胞内结构域(人cd247，氨基酸52-163)rvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(seqidno：16)。人胞内cd3ζ结构域当与胞外自身抗原(如dsg1、dsg3或其片段)结合时提供刺激胞内信号传导，无hla限制。

在另一个实施方式中，胞内信号传导结构域的核酸序列包括编码cd3ζ信号传导结构域的核酸序列。在另一个实施方式中，cd3ζ信号传导结构域的核酸序列编码包括seqidno：16的氨基酸序列。

在又另一个实施方式中，胞内信号传导结构域包括cd3ζ信号传导结构域。在又另一个实施方式中，cd3ζ信号传导结构域包括seqidno：16。

其它结构域

在另一个实施方式中，caar和编码caar的核酸包括人t细胞表面糖蛋白cd8α链信号肽(t细胞表面糖蛋白cd8α链的氨基酸1-21)：malpvtalllplalllhaarp(seqidno：1)。人cd8α信号肽负责受体向t细胞表面的易位。在一个实施方式中，编码caar的分离的核酸序列包括cd8α链信号肽的核酸序列。在另一个实施方式中，cd8α链信号肽编码包括seqidno：1的氨基酸序列。在又另一个实施方式中，caar包括cd8α链信号肽。

在仍另一个实施方式中，跨膜结构域包括包含seqidno：13的cd8α链铰链和跨膜结构域，如在桥粒芯蛋白3的ec结构域和cd8跨膜结构域之间的被由如下氨基酸组成的肽接头替换的a)中提及的铰链区：sggggsggggssg(seqidno：14)。

在一个实施方式中，编码caar的分离的核酸序列包括肽接头的核酸序列。在另一个实施方式中，肽接头的核酸序列编码包含seqidno：14的氨基酸序列。在另一个实施方式中，caar的胞内信号传导结构域内的细胞质信号传导序列可以以随机或指定的顺序彼此连接。任选地，短的寡肽或多肽接头，例如长度在2至10个氨基酸之间的接头可以形成键联。甘氨酸-丝氨酸双联体是特别合适的接头。

在又另一个实施方式中，caar包括肽接头。在仍另一个实施方式中，肽接头包括seqidno：14，如人肿瘤坏死因子受体超家族成员9(还称为cd137或4-1bb配体受体)胞内结构域(人肿瘤坏死因子受体超家族成员9的氨基酸214-255)：krgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcel(seqidno：15)。人胞内cd137结构域当与胞外自身抗原(如dsg1、dsg3或其片段)结合时提供共刺激胞内信号传导，而不需要其原始配体。

可以通过pcr或本领域已知的任何其它手段扩增caar、载体和启动子的任何结构域和/或片段。

包括caar的载体

本文所述的包括人桥粒芯蛋白3的胞外部分的不同部分的所有载体应被解释为与人桥粒芯蛋白1胞外部分的使用同样相容。因此，通过使用桥粒芯糖蛋白3来例示本文所述的载体的使用，但是应当被解释为关于人桥粒芯蛋白1的使用同样披露。

为了证明关于特异性和功能的概念，第3代自失活慢病毒载体质粒是有用的，其中表达在人延伸因子1α启动子(例如，prrlsin.cppt.ef1a.dsg3caar.wpre)下进行调节。这导致在宿主t细胞中的稳定(永久)表达。作为替代方法，可以将编码mrna电穿孔到宿主细胞中，这将实现与病毒转导的t细胞相同的治疗效果，但不是永久的，因为mrna将随着细胞分裂而稀释。

在一个方面，本发明包括载体，该载体包括编码嵌合自身抗体受体(caar)的分离的核酸序列，其中分离的核酸序列包括包含自身抗原或其片段的胞外结构域的人核酸序列，跨膜结构域的核酸序列和胞内信号传导结构域的核酸序列。在一个实施方式中，载体包括编码如本文所述的caar的任何分离的核酸序列。在另一个实施方式中，载体包括质粒载体、病毒载体、反转录转座子(例如，背负式，睡美人)，定点插入载体(例如，crispr，zn指核酸酶，talen)或自杀表达载体或本领域其它已知载体。

上述包含不同自身抗原及其片段的所有构建体都能够与第3代慢病毒载体质粒，其它病毒载体或批准用于人类细胞的rna一起使用。在一个实施方式中，载体是病毒载体，如慢病毒载体。在另一个实施方式中，载体是rna载体。

caar的产生可以通过测序来验证。可以使用免疫印迹，免疫组织化学，流式细胞术或本领域熟知和可获得的其它技术来验证全长caar蛋白的表达。

本发明还提供了其中插入编码本发明的caar的dna的载体。载体，包括源自逆转录病毒如慢病毒的载体，是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期稳定整合及其在子细胞中的增殖。慢病毒载体相对于源自致癌逆转录病毒(如鼠白血病病毒)的载体具有附加优点，因为它们可以转导非增殖细胞，如肝细胞。它们还具有在引入它们的受试者中导致低免疫原性的附加优点。

简而言之，编码caar的天然或合成核酸的表达通常通过将编码caar多肽或其部分的核酸与启动子可操作地连接，并将该构建体掺入表达载体中来实现。载体是通常能够在哺乳动物细胞中复制，和/或还能够整合到哺乳动物的细胞基因组中的载体。典型的载体包含转录和翻译终止子，起始序列和用于调节所希望的核酸序列的表达的启动子。

核酸可以克隆到任何数量的不同类型的载体中。例如，可以将核酸克隆到载体中，载体包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特别感兴趣的载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。

表达载体可以以病毒载体的形式提供给细胞。病毒载体技术是本领域众所周知的，并且描述于例如萨姆布鲁克(sambrook)等人，2012，分子克隆：实验室手册(molecularcloning：alaboratorymanual)，第1-4卷，冷泉港实验室出版社，纽约州)，以及在其他病毒学和分子生物学手册中。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含在至少一种生物体中有功能的复制起点、启动子序列、方便的限制性内切核酸酶位点和一个或多个选择性标记(例如，wo01/96584；wo01/29058；和美国专利号6,326,193)。

另外的启动子元件，例如，增强子，调节转录起始的频率。通常，这些位于起始位点上游30-110bp的区域，尽管最近已经显示许多启动子还包括起始位点的功能元件下游。启动子元件之间的间隔通常是灵活的，这样使得当元件相对于彼此反转或移动时保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可以在活性开始下降之前增加至相隔50bp。根据启动子，似乎个别元件可以协同或独立地发挥作用以活化转录。

启动子的实例是即时早期巨细胞病毒(cmv)启动子序列。该启动子序列是能够驱动与其可操作地连接的任何多核苷酸序列的高水平表达的强组成型启动子序列。然而，也可以使用其他组成型启动子序列，包括但不限于：猿猴病毒40(sv40)早期启动子，小鼠乳腺瘤病毒(mmtv)，人免疫缺陷病毒(hiv)长末端重复序列(ltr)启动子，momulv启动子，禽白血病病毒启动子，埃-巴二氏病毒即时早期启动子，劳斯肉瘤病毒启动子，延长因子-1α启动子，以及人基因启动子，如但不限于：肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。此外，本发明不应限于使用组成型启动子。诱导型启动子也被认为是本发明的部分。诱导型启动子的使用提供了能够启动多核苷酸序列的表达的分子开关，当期望这种表达时，其可操作地连接，或者当不需要表达时关闭表达。诱导型启动子的实例包括但不限于：金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。

为了评估caar多肽或其部分的表达，待导入细胞中的表达载体还可以包含选择性标记基因或报告基因或两者，以便于从试图通过病毒载体转染或感染的细胞群体中鉴定和选择表达细胞。在其它方面，选择性标记可以携带在单独的dna片段上并用于共转染程序。选择标记和报道基因两者都可以侧接(侧翼有，flankedwith)适当的调节序列以使得能够在宿主细胞中表达。有用的选择性标记包括例如，抗生素抗性基因，如neo等。

报告基因用于鉴定潜在转染的细胞和用于评估调节序列的功能性。通常，报道基因是不存在于接受者生物体或组织中或者不是由受体生物体或组织表达并且编码多肽的基因，该多肽的表达通过一些容易检测的性质例如酶活性来表现。在将dna引入接受者细胞后的合适时间评估报告基因的表达。合适的报道基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌的碱性磷酸酶的基因，或绿色荧光蛋白基因(例如，佑伊-泰伊(ui-tei)等人，2000，欧洲生化学会联合会快报(febsletters)479：79-82)。合适的表达系统是公知的，并且可以使用已知技术制备或经商业获得。通常，具有显示报道基因的最高水平表达的最小5′侧翼区的构建体被鉴定为启动子。这样的启动子区域可以连接到报道基因，并用于评估调节启动子驱动的转录的能力的试剂。

将基因引入和表达进入细胞的方法是本领域已知的。在表达载体的上下文中，可以通过本领域中的任何方法容易地将载体引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞中。例如，表达载体可以通过物理、化学或生物学手段转移到宿主细胞中。

用于将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。用于产生包括载体和/或外源核酸的细胞的方法是本领域众所周知的。参见，例如，萨姆布鲁克等人，2012，分子克隆：实验室手册，第1-4卷，冷泉港实验室出版社，纽约州。

用于将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用dna和rna载体。rna载体包括具有rna启动子和/或用于产生rna转录物的其他相关结构域的载体。病毒载体，并且特别是逆转录病毒载体，已成为用于将基因插入哺乳动物，例如人细胞中最广泛使用的方法。其它病毒载体可以源自慢病毒，痘病毒，单纯疱疹病毒，腺病毒和腺相关病毒等。参见，例如，美国专利号5,350,674和5,585,362。

用于将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠和基于脂质的系统，包括水包油乳剂，胶束，混合胶束和脂质体。用作体外和体内递送载体的示例性胶体系统是脂质体(例如，人工膜囊泡)。

在使用非病毒递送系统的情况下，示例性递送载体是脂质体。考虑使用脂质配制品将核酸引入宿主细胞(体外，离体或体内)。在另一个方面，核酸可以与脂质缔合。与脂质缔合的核酸可以包封在脂质体的水性内部，散布在脂质体的脂质双层内，通过与脂质体和寡核苷酸缔合的连接分子附接到脂质体，包封在脂质体中，与脂质体复合，分散在包含脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质组合，作为脂质中的悬浮液包含，包含胶束或与胶束复合，或以其它方式与脂质缔合。脂质，脂质/dna或脂质/表达载体缔合的组合物不限于溶液中的任何特定结构。例如，它们可以以双层结构，作为胶束或以“塌陷”结构存在。它们还可以简单地散布在溶液中，可能形成尺寸或形状不均匀的聚集体。脂质是可以是天然存在的脂质物质或合成脂质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪液滴以及包含长链脂族烃及其衍生物如脂肪酸，醇，胺，氨基醇和醛的化合物类。

适合使用的脂质可以从商业来源获得。例如，二肉豆蔻基磷脂酰胆碱(“dmpc”)可以从西格玛(sigma)，圣路易斯，密苏里州获得；磷酸二鲸蜡酯(“dcp”)可以从k&k实验室(普莱恩维尤，纽约州)获得；胆固醇(“choi”)可以从calbiochem-behring获得；二肉豆蘧酰磷脂酰甘油(“dmpg”)和其他脂质可以从阿凡提极性脂质公司(伯明翰，阿拉巴马州)获得。脂质在氯仿或氯仿/甲醇中的储备溶液可储存在约-20℃。氯仿用作唯一的溶剂，因为它比甲醇更容易蒸发。“脂质体”是涵盖通过产生封闭的脂质双层或聚集体形成的多种单层和多层脂质载体的通用术语。脂质体可以表征为具有带有磷脂双层膜和内部水性介质的囊泡结构。多层脂质体具有通过水性介质分离的多个脂质层。当磷脂悬浮在过量的水溶液中时，它们自发形成。脂质组分在形成闭合结构之前经历自我重排并且在脂质双层之间捕获水和溶解的溶质(高希(ghosh)等人，1991，糖生物学(glycobiology)5：505-10)。然而，还涵盖在溶液中具有与正常囊泡结构不同的结构的组合物。例如，脂质可以呈现胶束结构或仅作为脂质分子的不均匀聚集体存在。还考虑脂质体-核酸复合物。

包括caar的细胞

在另一个方面，本发明包括遗传修饰的细胞，如辅助t细胞、细胞毒性t细胞、记忆t细胞、调节性t细胞、γδt细胞、天然杀伤细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞、其细胞系和其它效应细胞，这些细胞包括嵌合自身抗体受体(caar)，其中caar包括包含自身抗原或其片段的胞外结构域，跨膜结构域和胞内信号传导结构域。在一个实施方式中，遗传修饰的细胞包括本文所述的caar。

在另一个实施方式中，细胞表达caar。在该实施方式中，细胞对在b细胞上表达的自身抗体具有高亲和力。结果，细胞可以诱导表达自身抗体的b细胞的杀伤。在又另一个实施方式中，细胞对结合fc受体的抗体具有低亲和力。

在另一个实施方式中，遗传修饰的细胞是t细胞。在该实施方式中，t细胞表达dsg3caar。在该实施方式中，自身抗原包括dsg3或其片段，并且t细胞对在b细胞上表达的dsg3自身抗体具有高亲和力。结果，t细胞可以诱导表达dsg3自身抗体的b细胞的杀伤。在又另一个实施方式中，自身抗原包括dsg3，并且t细胞对结合fc受体的dsg3抗体具有低亲和力。

针对t细胞对健康细胞具有有限的毒性和对表达自身抗体的细胞具有特异性也是有用的。这种特异性预防或减少了脱靶毒性，该脱靶毒性在对自身抗体不具特异性的目前治疗中普遍存在。在一个实施方式中，t细胞对健康细胞具有有限的毒性。

本发明包括t细胞，如原代细胞，源自原代t细胞的扩增t细胞，源自体外分化的干细胞的t细胞，t细胞系如jurkat细胞，t细胞的其它来源，其组合和其它效应细胞。例如，具有nfat应答元件，随后是gfp的转导的jurkat细胞系可用于检测并分离dsg3特异性b细胞，并以全面和无偏性方式克隆dsg3特异性抗体谱。相互作用的b和jurkat细胞可以检测为gfp阳性双联体，并通过流式细胞术分选。b细胞受体编码基因的表达克隆将提供关于天疱疮(如寻常性天疱疮、副肿瘤天疱疮和落叶型天疱疮)中的自身免疫和自身抗体和其它自身免疫性疾病如何发展的进一步信息。

caar结合自身抗体和血清(例如但不限于寻常性天疱疮血清)的功能性能力已在jurkat报道细胞系中进行评估，其取决于通过结合至自身抗体活化caar(响应于此，由于其中包含的nfat-gfp报道构建体，活化的细胞发出绿色荧光)。这样的方法是针对功能结合能力的有用并可靠的定性测量。在细胞表面上自身抗原的适当处理也是重要的，并且可以使用单克隆抗体测量。例如，如本文所述，抗dsg3杂交瘤细胞(ak23)的连续稀释显示转导的jurkat细胞对展示dsg3自身抗体的杂交瘤的剂量依赖性应答，并且没有通过非dsg3特异性或健康原代人b细胞的活化。此外，用caar转导的原代t细胞展示ak23的特异性杀伤。此外，基于主要疾病表位的dsg3的截短也是有用的并且包括在本文中。使用较小铰链区的截短形式也是有用的。关于安全性，优选预防或降低转导的细胞之间或趋向角质细胞的可能的嗜血性和嗜异性相互作用和活化(例如，dsg3-dsg3)。

caar的功效和安全性的进一步评估可以例如如下进行：

构建体可以瞬时转染到人细胞中，例如293t/17。表面表达可以用针对上述胞外结构域1、2、3、4、5、结构域之间的接头或caar中包括的其它结构特异的单克隆抗体(igg或scfv)来检测。结合可以用特异性第二抗体验证并通过流式细胞术定量。

本文描述了igm和igg1同种型的人抗桥粒芯蛋白3抗体的膜表达构建体的产生，其在mhci阴性k562细胞(atccccl-243)中表达。这些细胞可以用作测试不同dsg3-caar的靶细胞。

上述caar构建体与vsv-g假型hiv-1衍生的慢病毒颗粒相容，并且可以使用慢病毒转导在来自健康供体的原代人t细胞中永久表达。杀伤效力可以在基于铬的细胞裂解测定或本领域已知的任何类似测定中确定。

如果需要，可以通过在k562细胞表面上表达人单克隆抗体来产生另外的靶细胞系。

如上所述的类似方法可以应用于桥粒芯蛋白1，针对该桥粒芯蛋白1的抗体在寻常性天疱疮或落叶型天疱疮的粘膜皮肤形式中发现。类似的方法也可应用于bp180(xvii型胶原)的nc16a结构域，其是大疱性类天疱疮中自身抗体的初级抗原靶标；vii型胶原的nc1和nc2结构域，其被后天性大疱性表皮松解症中的自身抗体进行靶向；或组织型转谷氨酞胺酶/麦醇溶蛋白肽/表皮转谷氨酰胺酶，其由乳糜泻和疱疹样皮炎中的自身抗体复合物进行靶向。

自身免疫性疾病

本发明还提供了用于预防、治疗和/或控制与表达自身抗体的细胞相关的障碍(例如，自身免疫性疾病)的方法。这些方法包括向对其有需要的受试者给予与表达自身抗体的细胞结合的本发明caart细胞。在一个方面，受试者是人。与表达自身抗体的细胞相关的障碍的非限制性实例包括自身免疫性障碍(如寻常性天疱疮，副肿瘤天疱疮或落叶型天疱疮)。

本发明还提供了用于预防、治疗和/或控制与表达自身抗体的细胞相关的自身免疫性疾病的方法。这些方法包括向有需要的受试者给予与表达自身抗体的细胞结合的本发明caart细胞。在一个实施方式中，受试者经历血浆去除术或另一种临床治疗以除去或减少受试者血清中的抗体。除去或减少血清抗体如自身抗体的方法可以包括本领域已知的化学或其它方法。治疗方法可以是对自身抗体具有特异性的或被概括用于任何抗体。在一个实施方式中，受试者是人。与表达自身抗体的细胞相关的疾病的非限制性实例包括桥粒芯蛋白3自身抗体等。

在治疗方法中，可以修饰从受试者分离的t细胞以表达适当的caar，离体扩增，并且然后再输注到受试者中。修饰的t细胞识别靶细胞，如dsg3特异性b细胞，并被活化，导致自身免疫靶细胞的杀伤。

复发也可发生在患有自身免疫性疾病的患者中，例如在天疱疮患者中。在用利妥昔单抗治疗的患者中，复发可以由相同自身抗体b细胞克隆的持久性介导，而缓解与这些克隆的消失相关。通过输注caart细胞，自身免疫细胞被耗尽以诱导长期缓解，可能是由于不再出现caart细胞和/或自身抗原反应性克隆的寿命(即，在寻常性天疱疮、副肿瘤天疱疮或落叶型天疱疮中，耐受性的打破是一次性错误)。

为了在体外、原位或体内监测表达caar的细胞，caar细胞可进一步表达可检测标记。当caar结合靶标时，可检测标记被活化并且表达，其可以通过本领域已知的测定如流式细胞术进行检测。在一个实施方式中，dsg3-caar包括nfat应答元件和可检测标记，如绿色荧光蛋白(gfp)，以检测和定量表达dsg3-caar的细胞。

t细胞的来源

在扩增和遗传修饰之前，从受试者获得t细胞。受试者的实例包括人、狗、猫、小鼠、大鼠和其转基因物种。t细胞可以从许多来源获得，包括皮肤、外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在本发明的某些实施方式中，可以使用本领域可用的任何数量的t细胞系。在本发明的某些实施方式中，t细胞可以使用本领域技术人员已知的任何数量的技术，如ficoll^tm分离，从受试者收集的血液单位获得。在一个优选的实施方式中，来自个体的循环血液的细胞通过单采术获得。单采术产物通常包含淋巴细胞，这些淋巴细胞包括t细胞、单核细胞、粒细胞、b细胞、其它有核白细胞、红细胞和血小板。在一个实施方式中，可以洗涤通过单采术收集的细胞以除去血浆级分并将细胞置于适当的缓冲液或培养基中用于随后的处理步骤。在本发明的一个实施方式中，用磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗涤细胞。在替代实施方式中，洗涤溶液缺乏钙并且可缺少镁或可缺少许多(如果不是全部二价阳离子)。再次，令人惊讶地，在不存在钙的情况下的初始活化步骤导致放大的活化。如本领域普通技术人员将容易理解的，洗涤步骤可以通过本领域技术人员已知的方法实现，如通过使用半自动“流通”离心机(例如，cobe2991细胞处理器，baxtercytomate或haemonetics细胞回收器5)根据制造商的说明书进行。洗涤后，可以将细胞重悬浮在多种生物相容缓冲液中，如无ca、无mg的pbs，勃脉力a(plasmalytea)或具有或不具有缓冲液的其它盐溶液。可替代地，可以除去单采术样品的不期望的组分，并将细胞直接重悬浮在培养基中。

在另一个实施方式中，通过裂解红细胞和耗尽单核细胞，例如，通过percolltm梯度离心或通过逆流离心淘析从外周血淋巴细胞分离t细胞。可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离t细胞的特定亚群，如cd3⁺、cd28⁺、cd4⁺、cd8⁺、cd45ra⁺、和cd45ro⁺t细胞。例如，在一个实施方式中，通过与抗cd3/抗cd28(即，3x28)共轭珠(如m-450cd3/cd28t)孵育足以对所需t细胞进行阳性选择的时间段来分离t细胞。在一个实施方式中，时间段为约30分钟。在另一个实施方式中，时间段范围为30分钟至36小时或更长，以及其间的所有整数值。在另一个实施方式中，所述时间段为至少1、2、3、4、5或6小时。在又另一个优选的实施方式中，该时间段为10至24小时。在一个优选的实施方式中，孵育时间段为24小时。为了从患有白血病的患者中分离t细胞，使用更长的孵育时间，如24小时，可以增加细胞产量。在与其它细胞类型相比较少t细胞的任何情况下，如来自肿瘤组织或来自免疫受损个体的分离的肿瘤浸润淋巴细胞(til)中，可以使用更长的孵育时间来分离t细胞。此外，使用更长的孵育时间可以增加捕获cd8+t细胞的效率。因此，通过简单地缩短或延长时间，允许t细胞结合至cd3/cd28珠，和/或通过增加或减少珠与t细胞的比例(如本文进一步描述的)，可以为了或针对在培养开始时或在过程中的其它时间点优先选择t细胞亚群。另外，通过增加或降低珠或其它表面上的抗cd3和/或抗cd28抗体的比例，可以为了或针对在培养起始或在其它所需的时间点优先选择t细胞亚群。技术人员将认识到，多轮选择也可以用于本发明的上下文中。在某些实施方式中，可能期望执行选择程序并在活化和扩展过程中使用“未选择的”细胞。“未选择的”细胞还可以经历另外轮的选择。

通过阴性选择富集t细胞群体可以使用针对对阴性选择的细胞特有的表面标志物的抗体的组合来实现。一种方法是通过负磁性免疫粘附或流式细胞术的细胞分选和/或选择，该方法使用针对存在于阴性选择的细胞上的细胞表面标志物的单克隆抗体的混合物。例如，为了通过阴性选择来富集cd4⁺细胞，单克隆抗体混合物通常包括针对cd14、cd20、cd11b、cd16、hla-dr和cd8的抗体。在某些实施方式中，可能需要富集或阳性选择通常表达cd4⁺、cd25⁺、cd62l^hi、gitr⁺、和foxp3⁺的调节性t细胞。可替代地，在某些实施方式中，通过抗c25共轭的珠或其它类似的选择方法耗尽t调节细胞。

为了通过阳性或阴性选择分离所期望的细胞群体，可以改变细胞和表面(例如，颗粒如珠)的浓度。在某些实施方式中，可能期望显著降低珠和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞的浓度)，以确保细胞和珠的最大接触。例如，在一个实施方式中，使用20亿个细胞/ml的浓度。在一个实施方式中，使用10亿个细胞/ml的浓度。在另一个实施方式中，使用大于1亿个细胞/ml。在另一个实施方式中，使用1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5千万个细胞/ml的细胞浓度。在又另一个实施方式中，使用从7.5、8、8.5、9、9.5千万或1亿个细胞/ml的细胞浓度。在另外的实施方式中，可以使用1.25或1.50亿个细胞/ml的浓度。使用高浓度可以导致增加的细胞产量，细胞活化和细胞扩增。此外，使用高细胞浓度允许更有效地捕获可能弱表达感兴趣靶抗原的细胞，如cd28阴性t细胞，或来自存在许多肿瘤细胞的样品(即，白血病血液，肿瘤组织等)的细胞。这样的细胞群体可以具有治疗价值并且希望获得。例如，使用高浓度的细胞允许更有效地选择通常具有较弱cd28表达的cd8⁺t细胞。

在相关实施方式中，可能需要使用较低浓度的细胞。通过显著稀释t细胞和表面的混合物(例如，颗粒如珠)，使颗粒和细胞之间的相互作用最小化。这选择表达大量与颗粒结合的所期望抗原的细胞。例如，cd4⁺t细胞表达较高水平的cd28，并且在稀释浓度下比cd8⁺t细胞更有效地被捕获。在一个实施方式中，所用细胞的浓度为5×10⁶/ml。在其它实施方式中，所用的浓度可以为从约1×10⁵/ml至1×10⁶/ml，以及其间的任何整数值。

在其它实施方式中，细胞可以在旋转器上在2℃-10℃或室温下以变化的速度孵育不同长度的时间。

用于刺激的t细胞还可在洗涤步骤后进行冷冻。不希望受理论束缚，冷冻和随后的解冻步骤通过除去细胞群体中的粒细胞和一定程度的单核细胞而提供更均匀的产物。在除去血浆和血小板的洗涤步骤后，可以将细胞悬浮在冷冻溶液中。虽然许多冷冻溶液和参数是本领域已知的并且在本文上下文中将是有用的，一种方法涉及使用包含20％dmso和8％人血清白蛋白的pbs，或包含10％右旋糖酐40％和5％右旋糖，20％人血清白蛋白和7.5％dmso，或31.25％勃脉力a，31.25％右旋糖5％，0.45％nacl，10％右旋糖酐40％和5％葡萄糖，20％人血清白蛋白和7.5％dmso，或包含例如羟乙基淀粉和勃脉力a的其它合适的细胞冷冻培养基的培养基，然后将细胞以1°/分钟的速率冷冻至-80℃，并储存在液氮储罐的气相中。可以使用受控制的冷冻的其它方法，以及立即在-20℃下或在液氮中的不受控制的冷冻。

在某些实施方式中，如本文所述解冻和洗涤冷冻保存的细胞，并使其在使用本发明的方法在活化之前在室温下静置一小时。

在本发明的上下文中还考虑在可能需要本文所述的扩增细胞之前的时间段从受试者收集血液样品或单采术(apheresis)产物。因此，可以在任何需要的时间点收集待扩增的细胞的来源，并分离和冷冻所期望的细胞，如t细胞，用于随后在针对任何数量的疾病或状况的t细胞治疗中，这些疾病或病症将受益于t细胞治疗，如本文所述的那些。在一个实施方式中，从通常健康的受试者获取血液样品或单采术产物。在某些实施方式中，血液样品或单采术产物取自处于发展疾病的风险但是尚未发展疾病的一般健康的受试者，并且分离感兴趣的细胞并冷冻用于以后使用。在某些实施方式中，t细胞可以扩增，冷冻并在以后使用。在某些实施方式中，在诊断本文所述的特定疾病以后不久但在任何治疗之前从患者收集样品。在另一个实施方式中，在任何数目的相关治疗形式之前，从来自受试者的血液样品或单采术产物(apheresis)中分离细胞，这些相关治疗形式包括但不限于用以下的治疗：试剂(如那他珠单抗，依法珠单抗)，抗病毒剂，化疗，放射，免疫抑制剂(如环孢菌素，硫唑嘌呤，甲氨蝶呤，霉酚酸和fk506)，抗体，或其它免疫消除剂(如campath，抗cd3抗体，细胞毒素，氟达拉滨，环孢菌素，fk506，雷帕霉素，霉酚酸，类固醇，fr901228和照射)。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶钙调神经磷酸酶(环孢菌素和fk506)或抑制对生长因子诱导的信号传导重要的p70s6激酶(雷帕霉素)。(liu等人，细胞(cell)66：807-815，1991；亨德森(henderson)等人，免疫(immun.)73：316-321，1991；比勒(bierer)等人，免疫学的当前意见(curr.opin.immun.)5：763-773，1993)。在另一个实施方式中，为患者分离细胞，并冷冻用于以后与骨髓或干细胞移植，使用化疗剂例如氟达拉滨、外束放射治疗(xrt)、环磷酰胺，或抗体例如okt3或campath的t细胞去除治疗联合(例如，之前、同时、或之后)使用。在另一个实施方式中，在使用前分离细胞，并且可以冷冻用于随后用于b细胞去除治疗之后的治疗，例如，利妥昔单抗。

在本发明的另一个实施方式中，紧随治疗后，从患者获得t细胞。在这方面，已经观察到，在患者通常将从治疗中恢复的期间，在治疗后不久进行某些癌症治疗(特别是用破坏免疫系统的药物治疗)后，所获得的t细胞的质量可能是最佳的或可以改进其离体扩增能力。同样，在使用本文所述的方法的离体操作之后，这些细胞可以处于增强植入和体内扩增的优选状态。因此，在本发明的上下文中，考虑在该恢复期期间收集血细胞，包括t细胞、树突细胞或造血谱系的其它细胞。此外，在某些实施方式中，动员(例如，用gm-csf动员)和调节方案可用于在受试者中产生状况，其中特定细胞类型的再增殖，再循环，再生和/或扩增是有利的，特别是在治疗后的确定的时间窗口期间。说明性细胞类型包括t细胞、b细胞、树突细胞和免疫系统的其它细胞。

t细胞的活化和扩增

通常使用例如在美国专利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；和美国专利申请公开号20060121005中所述的方法活化和扩增t细胞。

通常，本发明的t细胞通过与其上附接有试剂(该试剂刺激cd3/tcr复合物相关的信号)和配体(该配体刺激t细胞表面上的共刺激分子)的表面接触而扩增。特别地，可以如本文所述刺激t细胞群体，如通过与固定在表面上的抗cd3抗体、或其抗原结合片段或抗cd2抗体接触，或通过和与钙离子载体联合的蛋白激酶c活化剂(例如，苔藓抑素)接触。对于辅助分子在t细胞表面上的共刺激，使用结合辅助分子的配体。例如，可以在适于刺激t细胞增殖的条件下，使t细胞群体与抗cd3抗体和抗cd28抗体接触。为了刺激cd4⁺t细胞或cd8⁺t细胞的增殖，抗cd3抗体和抗cd28抗体。抗cd28抗体的实例包括可以如本领域通常已知的其它方法那样使用的9.3、b-t3、xr-cd28(diaclone，法国)(伯格(berg)等人，移植进展(transplantproc.)30(8)：3975-3977，1998；哈能(haanen)等人，实验医学杂志(j.exp.med.)190(9)：13191328，1999；加兰(garland)等人，免疫学方法杂志(j.immunolmeth.)227(1-2)：53-63，1999)。

在某些实施方式中，t细胞的主要刺激信号和共刺激信号可以通过不同的方案提供。例如，提供每个信号的试剂可以在溶液中或偶联到表面。当偶联到表面时，试剂可偶联到同一表面(即，以“顺式”形式)或单独的表面(即，以“反式”形式)。可替代地，一种试剂可以偶联到溶液中的表面上和另一种试剂。在一个实施方式中，提供共刺激信号的试剂结合到细胞表面，并且提供初级活化信号的试剂在溶液中或偶联到表面上。在某些实施方式中，两种试剂可以在溶液中。在另一个实施方式中，试剂可以处于可溶形式，并且然后交联到表面，如表达fc受体的细胞或将结合试剂的抗体或其它结合剂。在这方面，参见例如，针对人工抗原呈递细胞(aapc)的美国专利申请公开号20040101519和20060034810，这些人工抗原呈递细胞被考虑用于活化和扩增本发明中的t细胞。

在一个实施方式中，将两种试剂固定在珠上，在相同的珠上，即“顺式”，或单独的珠，即“反式”。举例来说，提供初级活化信号的试剂是抗cd3抗体或其抗原结合片段，并且提供共刺激信号的试剂是抗cd28抗体或其抗原结合片段；并且两种试剂以相等的分子的量共同固定在相同的珠上。在一个实施方式中，使用1∶1比例的与用于cd4⁺t细胞扩增和t细胞生长的珠结合的每种抗体。在本发明的某些方面，使用与珠结合的抗cd3∶cd28抗体的比例，这样使得与使用1∶1的比例观察到的扩增相比，观察到t细胞扩增的增加。在一个具体实施方式中，与使用1∶1比例观察到的扩增相比，观察到从约1至约3倍的增加。在一个实施方式中，结合珠的cd3∶cd28抗体的比例范围从100∶1至1∶100和其间的所有整数值。在本发明的一个方面，与抗cd3抗体相比，更多的抗cd28抗体结合到颗粒上，即，cd3∶cd28的比例小于1。在本发明的某些实施方式中，结合至珠的抗cd28抗体与抗cd3抗体的比例大于2∶1。在一个具体实施方式中，使用1∶100比例的与珠结合的cd3∶cd28抗体。在另一个实施方式中，使用1∶75比例的与珠结合的cd3∶cd28抗体。在另一个实施方式中，使用1∶50比例的与珠结合的cd3∶cd28抗体。在另一个实施方式中，使用1∶30比例的与珠结合的cd3∶cd28抗体。在一个优选的实施方式中，使用1∶10比例的与珠结合的cd3∶cd28抗体。在另一个实施方式中，使用1∶3比例的与珠结合的cd3∶cd28抗体。在又另一个实施方式中，使用3∶1比例的与珠结合的cd3∶cd28抗体。

可以使用从1∶500至500∶1及其间的任何整数值的比例的颗粒与细胞来刺激t细胞或其它靶细胞。如本领域普通技术人员可以容易地理解的，颗粒与细胞的比例可以取决于相对于靶细胞的颗粒大小。例如，小尺寸珠只能结合几个细胞，而较大珠可以结合许多细胞。在某些实施方式中，细胞与颗粒的比例范围从1∶100至100∶1以及其间的任何整数值，并且在另外的实施方式中，比例包括1∶9至9∶1以及其间的任何整数值，也可以用来刺激t细胞。导致t细胞刺激的抗cd3和抗cd28偶联颗粒与t细胞的比例可以如上所述变化，然而，某些优选值包括1∶100、1∶50、1∶40、1∶30、1∶20、1∶10、1∶9、1∶8、1∶7、1∶6、1∶5、1∶4、1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1、10∶1、和15∶1，其中一个优选的比例为至少1∶1的颗粒/t细胞。在一个实施方式中，使用1∶1或更小的颗粒与细胞的比例。在一个具体实施方式中，优选的颗粒∶细胞比例为1∶5。在另外的实施方式中，颗粒与细胞的比例可以根据刺激的天数而变化。例如，在一个实施方式中，颗粒与细胞的比例在第一天为1∶1至10∶1，并且每天或每隔一天将另外的颗粒添加到细胞中，其后多至10天，最终比例为从1∶1至1∶10(基于添加当天的细胞计数)。在一个具体实施方式中，在刺激的第一天，颗粒与细胞的比例为1∶1，并且在刺激的第三和第五天调整至1∶5。在另一个实施方式中，在每天或每隔一天的基础上添加颗粒至在第一天的最终比例为1∶1，并且在刺激的第三和第五天为1∶5。在另一个实施方式中，在刺激的第一天，颗粒与细胞的比例为2∶1，并且在刺激的第三和第五天调整至1∶10。在另一个实施方式中，在每天或每隔一天的基础上添加颗粒至在第一天的最终比例为1∶1，并且在刺激的第三和第五天为1∶10。本领域技术人员将理解，多种其他比例可适用于本发明。特别地，比例将根据颗粒尺寸和细胞尺寸和类型而变化。

在本发明的另外的实施方式中，细胞(如t细胞)与试剂包被的珠组合，随后分离珠和细胞，并且然后培养细胞。在一个替代性实施方式中，在培养之前，试剂包被的珠和细胞不分离，而是一起培养。在另一个实施方式中，首先通过施加力(如磁力)浓缩珠和细胞，导致细胞表面标志物的连接增加，从而诱导细胞刺激。

举例来说，可以通过使附着有抗-cd3和抗-cd28的顺磁珠(3×28个珠)与t细胞接触来连接细胞表面蛋白。在一个实施方式中，将细胞(例如，10⁴至10⁹个t细胞)和珠(例如，比例为1∶1的m-450cd3/cd28t顺磁珠)在缓冲液中合并，例如pbs(不含二价阳离子如钙和镁)。同样，本领域普通技术人员可以容易地理解，可以使用任何细胞浓度。例如，靶细胞在样品中可能是非常罕见的，并且仅占样品的0.01％，或整个样品(即100％)可以包括感兴趣的靶细胞。因此，任何细胞数量在本发明的上下文内。在某些实施方式中，可能期望显著降低颗粒和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞的浓度)，以确保细胞和颗粒的最大接触。例如，在一个实施方式中，使用约20亿细胞/ml的浓度。在另一个实施方式中，使用大于1亿个细胞/ml。在另一个实施方式中，使用1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5千万个细胞/ml的细胞浓度。在又另一个实施方式中，使用从7.5、8、8.5、9、9.5千万或1亿个细胞/ml的细胞浓度。在另外的实施方式中，可以使用1.25或1.50亿个细胞/ml的浓度。使用高浓度可以导致增加的细胞产量，细胞活化和细胞扩增。此外，使用高细胞浓度允许更有效地捕获可能弱表达感兴趣的靶抗原的细胞，如cd28阴性t细胞。这样的细胞群体可以具有治疗价值，并且在某些实施例中希望获得。例如，使用高浓度的细胞允许更有效地选择通常具有较弱cd28表达的cd8+t细胞。

在本发明的一个实施方式中，可以将混合物培养若干小时(约3小时)至约14天或其间的任何小时整数值。在另一个实施方式中，可以将混合物培养21天。在本发明的一个实施方式中，将珠和t细胞一起培养约8天。在另一个实施方式中，将珠和t细胞一起培养2-3天。也可能需要若干个刺激周期，这样使得t细胞的培养时间可以是60天或更长。适合于t细胞培养的条件包括可以包含增殖和存活所必需的因子的合适培养基(例如，基本成分培养基或rpmi培养基1640或x-vivo15，(龙沙公司(lonza)))，这些因子包括血清(例如，胎牛或人血清)、白介素-2(il-2)、胰岛素、ifn-γ、il-4、il-7、gm-csf、il-10、il-12、il-15、tgfβ和tnf-α或本领域技术人员已知的用于细胞生长的任何其它添加剂。用于细胞生长的其它添加剂包括但不限于：表面活性剂、人血浆蛋白粉和还原剂，如n-乙酰基半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可以包括rpmi1640，aim-v，dmem，mem，α-mem，f-12，x-vivo15，和x-vivo20，optimizer，具有添加的氨基酸、丙酮酸钠、和维生素，无血清或补充适量的血清(或血浆)，或确定组的激素，和/或足以用于t细胞生长和扩增的一定量的细胞因子(一种或多种)。抗生素，例如青霉素和链霉素，仅包括在实验培养物中，而不包括在待被输注到受试者的细胞的培养物中。靶细胞保持在支持生长所需的条件下，例如适当的温度(例如，37℃)和大气(例如，空气加5％co2)。

已经暴露于不同刺激时间的t细胞可以表现出不同的特征。例如，典型的血液或分离的外周血单核细胞产物具有大于细胞毒性或抑制性t细胞群体(tc，cd8⁺)的辅助t细胞群体(th，cd4⁺)。通过刺激cd3和cd28受体的t细胞的离体(exvivo)扩增产生在约第8-9天之前主要由th细胞组成的t细胞群体，而在约第8-9天后，t细胞群体包括越来越大的tc细胞群体。因此，根据治疗的目的，用主要包括th细胞的t细胞群体输注受试者可能是有利的。类似地，如果已经分离了tc细胞的抗原特异性亚组，则可以有利地更大程度地扩增该亚组。

此外，除了cd4和cd8标志物，其它表型标志物显著变化，但在很大程度上，在细胞扩增过程的过程中可重复地变化。因此，这种再现性使得能够为特定目的定制活化的t细胞产物。

治疗应用

在一个方面，本发明包括用于治疗受试者中自身免疫性疾病的方法。该方法包括：向受试者给予有效量的遗传修饰的t细胞，该t细胞包括编码嵌合自身抗体受体(caar)的分离的核酸序列，其中该分离的核酸序列包括包含自身抗原或其片段的胞外结构域的核酸序列，跨膜结构域的核酸序列和胞内信号传导结构域的核酸序列，从而治疗该受试者中的该自身免疫性疾病。

在一个实施方式中，自身免疫性疾病选自寻常性天疱疮、副肿瘤天疱疮或落叶型天疱疮。在另一个实施方式中，受试者是人。

不希望受任何特定理论的束缚，由caar修饰的t细胞引发的抗自身抗体免疫应答可以是主动或被动免疫应答。在又另一个实施方式中，修饰的t细胞靶向b细胞。例如，表达自身抗体的b细胞可能易受caar重定向t细胞的间接破坏，这些caar重定向t细胞先前已经对相邻的表达自身抗体的细胞反应。

在一个实施方式中，本发明的完全人caar遗传修饰的t细胞可以是用于在哺乳动物中进行离体免疫和/或体内治疗的疫苗类型。在一个实施方式中，哺乳动物是人。

关于离体免疫，在将细胞给予哺乳动物之前，在体外发生以下中的至少一种：i)扩增细胞，ii)将编码caar的核酸引入细胞，或iii)冷冻保存细胞。

离体程序在本领域是众所周知的，并且在下文中更充分地讨论。简而言之，将细胞从哺乳动物(例如，人)分离，并且用在此披露的表达caar的载体遗传修饰(即，体外转导或转染)。可以将caar修饰的细胞给予哺乳动物接受者以提供治疗益处。哺乳动物接受者可以是人，并且关于接受者，caar修饰的细胞可以是自体的。可替代地，关于接受者，细胞可以是同种异体，同基因或异种的。

用于体外扩增造血干细胞和祖细胞的程序描述于通过引用并入本文的美国专利号5,199,942，该程序可以应用于本发明的细胞。其他合适的方法是本领域已知的，因此本发明不限于细胞离体扩增的任何特定方法。简言之，t细胞的离体培养和扩增包括：(1)从哺乳动物从外周血采集物或骨髓外植体的收集cd34+造血干细胞和祖细胞；和(2)离体扩增这样的细胞。除了在美国专利号5,199,942中描述的细胞生长因子以外，在美国专利5,199,942中，其他因子如flt3-l、il-1、il-3和c-kit配体可用于细胞的培养和扩增。

除了在离体免疫方面使用基于细胞的疫苗之外，本发明还包括用于体内免疫以引发针对患者中的抗原的免疫应答的组合物和方法。

通常，如本文所述活化和扩增的细胞可用于治疗和预防在免疫受损的个体中出现的疾病。特别地，本发明的caar修饰的t细胞用于治疗与自身抗体的表达相关的疾病，障碍和状况。在某些实施方式中，本发明的细胞用于治疗处于发展与自身抗体表达相关的自身免疫性疾病、障碍和状况的风险的患者。因此，本发明提供了用于治疗或预防与自身抗体的表达相关的自身免疫性疾病、障碍和状况的方法，包括向对其有需要的受试者给予治疗有效量的本发明的caar修饰的t细胞。

本发明的caar修饰的t细胞可以单独给予，或作为与稀释剂和/或与其它组分如il-2或其它细胞因子或细胞群体组合的药物组合物给予。简言之，本发明的药物组合物可以包括与一种或多种药学上或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合的本文所述的靶细胞群体。这样的组合物可以包括缓冲剂，如中性缓冲盐水，磷酸缓冲盐溶液等；碳水化合物如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或右旋糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂如edta或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。在一个方面，本发明的组合物被配制用于静脉内给予。

本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式给予。给予的量和频率将通过如患者的状况，患者疾病的类型和严重性等因素来确定，尽管适当的剂量可以通过临床试验来确定。

当指示“免疫有效量”，“抗自身抗体有效量”，“自身免疫性疾病抑制有效量”或“治疗量”时，待给予的本发明组合物的精确量可以由医生考虑年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移程度和患者(受试者)的状况的个体差异来确定。通常可以指出，包含本文所述t细胞的药物组合物可以以10⁴至10⁹个细胞/kg体重的剂量给予，在一些情况下为10⁵至10⁶个细胞/kg体重，包括那些范围内的所有整数值。t细胞组合物也可以按这些剂量多次给予。可以通过使用在免疫治疗中通常已知的输注技术来给予细胞(参见，例如，罗森伯格(rosenberg)等人，新英格兰医学杂志(neweng.j.ofmed.)319：1676，1988)。对于特定患者的最佳剂量和治疗方案可以容易地由医学领域的技术人员通过监测患者的疾病指征并相应地调整治疗来确定。

在某些实施方式中，向受试者给予活化的t细胞。给予后，再次抽血或者进行单采术，并使用本文所述的方法从其中活化和扩增t细胞，并且然后再输注回患者体内。该过程可以每几周进行多次。在某些实施方式中，可以从10cc至400cc的所抽血液来活化t细胞。在某些实施方式中，从20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或100cc的所抽血液来活化t细胞。不受理论束缚，使用这种多次抽血/多次再输注方案，可以选出某些t细胞群体。

本发明的细胞的给予可以使用任何方便的手段进行，包括通过雾化吸入，注射，摄取，输注，植入或移植。本文所述的组合物可以经动脉、皮下、皮内、肿瘤内、淋巴结内、髓内、肌肉内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内向患者给予。在一个实施方式中，将本发明的t细胞组合物通过皮内或皮下注射向患者给予。在另一个实施方式中，将本发明的t细胞组合物通过静脉内注射给予。t细胞的组合物可以直接注射到肿瘤，淋巴结或感染部位。

在本发明的某些实施方式中，将使用本文所述的方法或本领域已知的将t细胞扩增至治疗水平的其它方法活化和扩增的细胞与任何数量的相关治疗方式(例如，在之前，同时或之后)联合向患者给予，这些治疗方式包括但不限于用试剂的治疗如抗病毒治疗，西多福韦和白介素-2，阿糖胞苷(还称为ara-c)或针对ms患者的那他珠单抗治疗或针对银屑病患者的依法利珠单抗治疗或针对pml患者的其它治疗。在另外的实施方式中，本发明的t细胞可以与化疗，放射，免疫抑制剂如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯和fk506，抗体或其它免疫消除剂如campath，抗cd3抗体或其它抗体治疗，细胞毒素，氟达拉滨，环孢菌素，fk506，雷帕霉素，霉酚酸，类固醇，fr901228，细胞因子和照射组合使用。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶钙调神经磷酸酶(环孢菌素和fk506)或抑制对生长因子诱导的信号传导重要的p70s6激酶(雷帕霉素)。(liu等人，细胞(cell)66：807-815，1991；亨德森(henderson)等人，免疫(immun.)73：316-321，1991；比勒(bierer)等人，免疫学的当前意见(curr.opin.immun.)5：763-773，1993)。在另外的实施方式中，将本发明的细胞组合物与骨髓移植，使用化疗剂例如氟达拉滨、外束放射治疗(xrt)、环磷酰胺，或抗体例如okt3或campath的t细胞去除治疗(例如，之前、同时、或之后)联合向患者给予。在另一个实施方式中，本发明的细胞组合物在b细胞去除治疗(如与cd20反应的试剂，例如利妥昔单抗)后给予。例如，在一个实施方式中，受试者可以经受用高剂量化疗随后进行外周血干细胞移植的标准治疗。在某些实施方式中，在移植后，受试者接受本发明的扩增的免疫细胞的输注。在另一个实施方式中，在手术之前或之后给予扩增的细胞。

给予患者的上述治疗的剂量将随被治疗状况和治疗的接受者的确切性质而变化。可以根据本领域接受的实践进行针对人给予的剂量的按比例缩放(scaling)。对于成年患者，campath的剂量，例如，通常在1至约100mg的范围内，通常每天给予持续1至30天的时间。优选的每日剂量为每天1至10mg，但在一些情况下可以使用每天高达40mg的更大剂量(在美国专利号6,120,766中描述的)。

实验实施例

通过参考以下实验实例进一步详细描述本发明。提供这些实例仅仅是为了说明的目的，并且不旨在是限制，除非另有说明。因此，本发明决不应被解释为限于以下实例，而是应被解释为涵盖因为本文提供的教导而变得显而易见的任何和所有变化方案。

无需进一步描述，人们认为本领域的普通技术人员可使用前述说明和以下说明性实例完成且利用本发明的这些化合物并实施所要求保护的方法。因此，以下工作实例具体指出了本发明的优选实施例，并且不应被解释为以任何方式限制本披露的其余部分。

现在描述在实施本文披露的实验中使用的材料和方法。

caar结构

利用特异性引物，通过pcr扩增从人cdna克隆桥粒芯蛋白3(dsg3)caar

a)对于人cd8α的信号肽(片段a)(正向：5’ctagcaggatccgccaccatggccttaccagtgaccg(seqidno：17)(添加kozak序列和bamhi限制性位点)，反向：5’tctattcgcaattccggcctggcggcg(seqidno：18)，重叠到人dsg3的前肽中)，

b)人cd8铰链和跨膜区的信号肽(片段c)(正向：5′ctcagggaggaagcccaccacgacgccagcgccgc(seqidno：19)(来自人dsg3的ec5的5’重叠)，反向：5′ccccgtttggtgataaccagtgacaggagaagg(seqidno：20)(进入人cd137信号传导结构域的5′重叠))，

c)人cd137信号传导结构域(片段d)(正向：5′ctggttatcaccaaacggggcagaaagaaactcc(seqidno：21)，反向：5′ttcactctcagttcacatcctccttcttcttcttctgg(seqidno：22)(重叠到人cd247(akacd3ζ)信号传导结构域中))，

d)和人cd3ζ信号传导结构域(片段e)(正向：5’gatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgc(seqidno：23)，反向：5’ggttgattgtcgacgcggatcttagcgagggggc(seqidno：24)(在taa终止密码子后添加sali位点))，

e)为了在非慢病毒载体质粒中表达，用xhoi位点替换bamhi位点，并且用bamhi位点替换sali位点。

利用引物正向5’ccaggccggaattgcgaatagagactaaagg(seqidno：25)和反向5’cgtggtgggcttcctccctgagtgcggcc(seqidno：26)从质粒dn653(来自阿玛盖(amagai)教授，庆应大学，东京的惠赠)扩增人dsg3的外显子编码序列(片段b)，这样使得与cd8的信号肽的5′定位序列和3′定位cd8铰链的的重叠成为可能。

在验证pcr产物的正确大小后，纯化片段(普洛麦格(promega)wizardsv)并进行延伸重叠pcr，将片段a与b以及c与d连接。连接的片段cd用另外的重叠-延伸pcr与片段e一起延伸，并且最后将片段ab和cde进行pcr结合。根据制造商的建议，用q5热启动聚合酶(新英格兰生物实验室)进行所有pcr反应。将最终的2.5kb长的pcr产物进行凝胶纯化并用bamhi-sali(克隆到慢病毒载体质粒)或xhoi-bamhi(克隆到非慢病毒表达质粒，即pcep4，生命科技公司(lifetechnologies))进行消化。

为了促进在淋巴样细胞中不易于沉默的强的人启动子下的组成型表达，将dsg3caar克隆到第3代基于hiv1的慢病毒载体质粒，即prrlsin.cppt.pgk-gfp.wpre(addgene12252)中。由于先前的研究已显示相比于pgk启动子的在ef1α下的有利表达，我们使用引物正向5’ggatcctgctagactcacgacacctgaaatggaag(seqidno：27)和反向5’gaggaggtcgacattcgtgaggctccggtgcccgtc(seqidno：28)pcr扩增来自人基因组dna的ef1α启动子。通过用sali和bamhi消化pcr产物并用xhoi和bamhi消化质粒，来将pgk启动子用ef1α启动子替换。sali和xhoi的相容性末端导致xhoi和sali位点的缺失，这样使得质粒保留侧接有通过消化和连接用dsg3caar替代的gfp的独特的bamhi和sali位点。

使用bamhi和sali，将缩短形式的dsg3caar克隆到相同的质粒主链中。为了促进高表面表达，使用基于密码子适应指数的算法(geneart，生命科技公司)对缩短的形式进行密码子优化，并合成为双链dna片段(geneart，生命科技公司)。在这些构建体中，将cd8铰链区用13个氨基酸长的柔性gs-接头替换，提供了可用于在kozak序列(具有bamhi)和gs-接头(具有nhei)之间插入不同dsg3编码片段的独特nhei位点。将完整的胞外dsg3克隆到该克隆位点中，并从衍生的质粒，用以下引物产生各种版本的dsg3：

bamhi-cd8信号肽-dsg3ec1-5-nhei：

bamhi.cd8.正向：gaggaggagggatccgccacc(seqidno：29)

ec5.nhei.反向：cctccgccgccgctagctctgcc(seqidno：30)

bamhi-cd8信号肽-dsg3ec1-4-nhei

bamhi.cd8.正向：gaggaggagggatccgccacc(seqidno：29)

ec4.nhei.反向：cctccgccgccgctagccttttccagcacggcgg(seqidno：31)

bamhi-cd8信号肽-dsg3ec1-3-nhei：

bamhi.cd8.正向：gaggaggagggatccgccacc(seqidno：29)

ec3.nhei.反向：tctcctcgctagcgaaggcaatgccc(seqidno：32)

bamhi-cd8信号肽-dsg3ec1-2-nhei：

bamhi.cd8.正向：gaggaggagggatccgccacc(seqidno：29)

ec2.nhei.反向：tccgccgccgctagcccggaacatagggaagttgtcg(seqidno：33)

为了克隆呈现dsg3的ec2-3的caar，将ec3.nhei.反向引物与ec2的5′序列的引物(5′aagcggcggcagaaacgcatcctggacatcaacgacaacc)(seqidno：34)组合使用；将所得ec2-3序列与cd8信号肽进行pcr结合(之前用重叠反向引物5′gatgcgtttctgccgccgcttggcctgctgcattgtc(seqidno：35)和bamhi.cd8正向引物扩增(见上文))。完整的ec1-5caar构建体的序列如下：atggctctgcctgtgacagctctgctgctgcctctggccctgctgctgcatgtgccagacctggctccgagctgcggatcgagacaaagggccagtacgacgaggaagagatgacaatgcagcaggccaagcggcggcagaaacgcgagtgggtcaagttcgccaagccctgcagagagggcgaggacaacagcaagcggaaccctatcgccaagatcaccagcgactaccaggccacccagaagatcacctaccggatcagcggcgtgggcatcgaccagccccctttcggcatcttcgtggtggacaagaacaccggcgacatcaacatcaccgccatcgtggacagagaggaaacccccagcttcctgatcacctgtcgggccctgaatgcccagggcctggacgtggaaaagcccctgatcctgaccgtgaagatcctggacatcaacgacaacccccccgtgttcagccagcagatcttcatgggcgagatcgaggaaaacagcgccagcaacagcctcgtgatgatcctgaacgccaccgacgccgacgagcccaaccacctgaatagcaagatcgccttcaagatcgtgtcccaggaacccgccggaacccccatgttcctgctgagcagaaataccggcgaagtgcggaccctgaccaacagcctggatagagagcaggccagcagctaccggctggtggtgtctggcgctgacaaggatggcgagggcctgagcacacagtgcgagtgcaacatcaaagtgaaggacgtgaacgacaacttccctatgttccgggacagccagtacagcgcccggatcgaagagaacatcctgagcagcgagctgctgcggttccaagtgaccgacctggacgaagagtacaccgacaactggctagccgtgtacttcttcaccagcggcaacgagggcaattggttcgagatccagaccgacccccggaccaatgagggcatcctgaaggtcgtgaaggccctggactacgagcagctgcagagcgtgaagctgtctatcgccgtgaagaacaaggccgagttccaccagtccgtgatcagccggtacagagtgcagagcacccccgtgaccatccaagtgatcaacgtgcgcgagggcattgccttcagacccgccagcaagaccttcaccgtgcagaagggcatcagcagcaagaaactggtggactacatcctgggcacctatcaggccatcgacgaggacaccaacaaagccgcctccaacgtgaaatacgtgatgggccggaacgacggcggctacctgatgatcgattccaagaccgccgagatcaagttcgtgaagaatatgaaccgggactccaccttcatcgtgaacaagaccatcacagccgaggtgctggccatcgatgagtataccggcaagaccagcaccggcaccgtgtacgtgcgggtgcccgacttcaacgataactgccctaccgccgtgctggaaaaggacgccgtgtgtagcagcagccccagcgtggtggtgtccgccagaaccctgaacaaccggtacaccggcccctacaccttcgccctggaagatcagcctgtgaagctgcc

cgccgtgtggtccatcaccacactgaatgccaccagcgccctgctgagagcccaggaacagattccccctggcgtgtaccacatcagcctggtgctgaccgacagccagaacaacagatgcgagatgccccggtccctgaccctggaagtgtgccagtgcgacaacagaggcatctgcggcaccagctaccctaccacctctcccggcaccagatacggcagacctcacagcggcagagctagcggcggcggaggaagcggaggcggaggatctagcggcatctacatctgggcccctctggccggaacatgcggagtgctgctgctgagcctcgtgatcaccctgtactgcaagagaggccggaagaagctgctgtacatcttcaagcagcccttcatgcggcccgtgcagaccacccaggaagaggacggctgcagctgtcggttccccgaggaagaagaaggcggctgcgaactgagagtgaagttcagcagaagcgccgacgcccctgcctaccagcagggacagaaccagctgtacaacgagctgaacctgggcagacgggaagagtacgacgtgctggacaagcggagaggcagggaccctgagatgggcggcaagcccagaagaaagaacccccaggaaggcctgtataacgaactgcagaaagacaagatggccgaggcctacagcgagatcggaatgaagggcgagcggagaagaggcaagggccacgacggactgtaccagggactgagcaccgccaccaaggacacctacgacgccctgcacatgcaggccctgccccctagataa(seqidno：36)。

使用特异性引物通过pcr扩增从人cdna克隆桥粒芯蛋白1(dsg1)caar。

完整caar构建体的序列如下：

dsg1caarec1-3核苷酸序列(胞外部分直到gs-接头，跨膜和胞质结构域与dsg3caar相同)

atggcacttccagtgaccgctctgctcctgccactggccctgctgctccacgctgcccgcccgggcagcgagttcaggatccaagtcagggattataatactaaaaacggtaccatcaagtggcattccatacgcaggcagaaaagggagtggattaagtttgctgccgcgtgccgggagggtgaagacaatagcaaacggaatcccattgcaaagatacatagcgattgcgctgccaatcagcaggttacatatcgaatctccggcgtggggattgaccagcctccttatggcattttcgtcattaaccaaaagactggcgagataaatatcacatcaattgtggaccgggaagtgacgccgttttttatcatctactgtagagctctgaactccatgggccaggatctggaaaggccactggagctgagggtcagggtccttgacatcaatgacaatccccccgtcttttccatggccacgttcgccggacagattgaggaaaatagcaatgccaatacactggtgatgatcctgaacgctaccgacgctgacgagccgaataatctgaacagtaaaattgcttttaagatcattcggcaggagccatcagacagcccaatgtttatcattaacagaaacaccggagagatccgcacaatgaacaatttcctggatagggaacagtatggacagtatgcactcgctgttcggggctccgaccgggacggtggagctgatggcatgagtgccgagtgcgagtgcaatatcaagatactcgacgtaaatgataatattccatacatggaacagagctcttacactatcgagatccaggagaatactctcaactctaatcttcttgaaattagagtgattgatctcgacgaggaattttctgccaattggatggctgtcatcttctttattagtggtaacgagggtaactggttcgagatagaaatgaatgaaaggacaaatgtgggaatcttgaaggtggttaaaccactggactacgaagcaatgcaatcactccagctgtcaataggcgtcagaaataaggcggagttccatcactccattatgtcccagtataaattgaaagccagtgccataagcgtaaccgtgttgaacgtgatagaagggcctgtttttgcatccgga(seqidno：37)

dsg1caarec1-3氨基酸序列(胞外部分直到gs-接头，跨膜和胞质结构域与dsg3caar相同)

malpvtalllplalllhaarpgsefriqvrdyntkngtikwhsirrqkrewikfaaacregednskrnpiakihsdcaanqqvtyrisgvgidqppygifvinqktgeinitsivdrevtpffiiycralnsmgqdlerplelrvrvldindnppvfsmatfagqieensnantlvmilnatdadepnnlnskiafkiirqepsdspmfiinrntgeirtmnnfldreqygqyalavrgsdrdggadgmsaececnikildvndnipymeqssytieiqentlnsnlleirvidldeefsanwmaviffisgnegnwfeiemnertnvgilkvvkpldyeamqslqlsigvrnkaefhhsimsqyklkasaisvtvlnviegpvfasg(seqidno：38)

dsg1caarec1-4核苷酸序列(胞外部分直到gs-接头，跨膜和胞质结构域与dsg3caar相同)

atggcacttccagtgaccgctctgctcctgccactggccctgctgctccacgctgcccgcccgggcagcgagttcaggatccaagtcagggattataatactaaaaacggtaccatcaagtggcattccatacgcaggcagaaaagggagtggattaagtttgctgccgcgtgccgggagggtgaagacaatagcaaacggaatcccattgcaaagatacatagcgattgcgctgccaatcagcaggttacatatcgaatctccggcgtggggattgaccagcctccttatggcattttcgtcattaaccaaaagactggcgagataaatatcacatcaattgtggaccgggaagtgacgccgttttttatcatctactgtagagctctgaactccatgggccaggatctggaaaggccactggagctgagggtcagggtccttgacatcaatgacaatccccccgtcttttccatggccacgttcgccggacagattgaggaaaatagcaatgccaatacactggtgatgatcctgaacgctaccgacgctgacgagccgaataatctgaacagtaaaattgcttttaagatcattcggcaggagccatcagacagcccaatgtttatcattaacagaaacaccggagagatccgcacaatgaacaatttcctggatagggaacagtatggacagtatgcactcgctgttcggggctccgaccgggacggtggagctgatggcatgagtgccgagtgcgagtgcaatatcaagatactcgacgtaaatgataatattccatacatggaacagagctcttacactatcgagatccaggagaatactctcaactctaatcttcttgaaattagagtgattgatctcgacgaggaattttctgccaattggatggctgtcatcttctttattagtggtaacgagggtaactggttcgagatagaaatgaatgaaaggacaaatgtgggaatcttgaaggtggttaaaccactggactacgaagcaatgcaatcactccagctgtcaataggcgtcagaaataaggcggagttccatcactccattatgtcccagtataaattgaaagccagtgccataagcgtaaccgtgttgaacgtgatagaagggcctgtttttcgccctgggtccaaaacctacgttgtgacaggaaacatgggatccaacgacaaagtcggcgacttcgtcgcaacagacctggacaccggtcgcccttccacaactgtgcggtacgtgatgggaaacaatccagccgacttgttggcagtcgatagcaggacagggaagctgacccttaaaaacaaggttacaaaagaacaatataacatgctgggcggcaaatatcagggaaccattttgtcaatcgacgacaacctgcagcgcacgtgcacggggacgatcaacatcaacatccagagctttgggaatgacgatagaaccaacacagagcccaacgctagcgga(seqidno：39)

dsg1caarec1-4氨基酸序列(胞外部分直到gs-接头，跨膜和胞质结构域与dsg3caar相同)

malpvtalllplalllhaarpgsefriqvrdyntkngtikwhsirrqkrewikfaaacregednskrnpiakihsdcaanqqvtyrisgvgidqppygifvinqktgeinitsivdrevtpffiiycralnsmgqdlerplelrvrvldindnppvfsmatfagqieensnantlvmilnatdadepnnlnskiafkiirqepsdspmfiinrntgeirtmnnfldreqygqyalavrgsdrdggadgmsaececnikildvndnipymeqssytieiqentlnsnlleirvidldeefsanwmaviffisgnegnwfeiemnertnvgilkvvkpldyeamqslqlsigvrnkaefhhsimsqyklkasaisvtvlnviegpvfrpgsktyvvtgnmgsndkvgdfvatdldtgrpsttvryvmgnnpadllavdsrtgkltlknkvtkeqynmlggkyqgtilsiddnlqrtctgtininiqsfgnddrtntepnasg(seqidno：40)

dsg1caarec1-5核苷酸序列(胞外部分直到gs-接头，跨膜和胞质结构域与dsg3caar相同)

gaagaagaagggtcagccactatggcacttccagtgaccgctctgctcctgccactggccctgctgctccacgctgcccgcccgggcagcgagttcaggatccaagtcagggattataatactaaaaacggtaccatcaagtggcattccatacgcaggcagaaaagggagtggattaagtttgctgccgcgtgccgggagggtgaagacaatagcaaacggaatcccattgcaaagatacatagcgattgcgctgccaatcagcaggttacatatcgaatctccggcgtggggattgaccagcctccttatggcattttcgtcattaaccaaaagactggcgagataaatatcacatcaattgtggaccgggaagtgacgccgttttttatcatctactgtagagctctgaactccatgggccaggatctggaaaggccactggagctgagggtcagggtccttgacatcaatgacaatccccccgtcttttccatggccacgttcgccggacagattgaggaaaatagcaatgccaatacactggtgatgatcctgaacgctaccgacgctgacgagccgaataatctgaacagtaaaattgcttttaagatcattcggcaggagccatcagacagcccaatgtttatcattaacagaaacaccggagagatccgcacaatgaacaatttcctggatagggaacagtatggacagtatgcactcgctgttcggggctccgaccgggacggtggagctgatggcatgagtgccgagtgcgagtgcaatatcaagatactcgacgtaaatgataatattccatacatggaacagagctcttacactatcgagatccaggagaatactctcaactctaatcttcttgaaattagagtgattgatctcgacgaggaattttctgccaattggatggctgtcatcttctttattagtggtaacgagggtaactggttcgagatagaaatgaatgaaaggacaaatgtgggaatcttgaaggtggttaaaccactggactacgaagcaatgcaatcactccagctgtcaataggcgtcagaaataaggcggagttccatcactccattatgtcccagtataaattgaaagccagtgccataagcgtaaccgtgttgaacgtgatagaagggcctgtttttcgccctgggtccaaaacctacgttgtgacaggaaacatgggatccaacgacaaagtcggcgacttcgtcgcaacagacctggacaccggtcgcccttccacaactgtgcggtacgtgatgggaaacaatccagccgacttgttggcagtcgatagcaggacagggaagctgacccttaaaaacaaggttacaaaagaacaatataacatgctgggcggcaaatatcagggaaccattttgtcaatcgacgacaacctgcagcgcacgtgcacggggacgatcaacatcaacatccagagctttgggaatgacgatagaaccaacacagagcccaacacaaagatcaccaccaatactggccgacaagaatccacctccagcacaaactatgatacgtccactaccagtacagactccagtcaggtttacagcagtgaacccggtaatggtgccaaggatctcctgagtgataatgttcattttggacccgctagcgga(seqidno：41)

dsg1caarec1-5氨基酸序列(胞外部分直到gs-接头，跨膜和胞质结构域与dsg3caar相同)

malpvtalllplalllhaarpgsefriqvrdyntkngtikwhsirrqkrewikfaaacregednskrnpiakihsdcaanqqvtyrisgvgidqppygifvinqktgeinitsivdrevtpffiiycralnsmgqdlerplelrvrvldindnppvfsmatfagqieensnantlvmilnatdadepnnlnskiafkiirqepsdspmfiinrntgeirtmnnfldreqygqyalavrgsdrdggadgmsaececnikildvndnipymeqssytieiqentlnsnlleirvidldeefsanwmaviffisgnegnwfeiemnertnvgilkvvkpldyeamqslqlsigvrnkaefhhsimsqyklkasaisvtvlnviegpvfrpgsktyvvtgnmgsndkvgdfvatdldtgrpsttvryvmgnnpadllavdsrtgkltlknkvtkeqynmlggkyqgtilsiddnlqrtctgtininiqsfgnddrtntepntkittntgrqestsstnydtsttstdssqvyssepgngakdllsdnvhfgpasg(seqidno：42)

通过用sali和bamhi消化来证实质粒中构建体编码序列的存在。通过sanger测序验证所有构建体，并且以更大规模纯化质粒，除去内毒素(凯杰公司(qiagen)endofreemaxiprep)。

瞬时表达

为了测试caar构建体的表达，使用聚乙烯亚胺(pei，jetpei，polyplus)以1∶2的dna∶pei比例瞬时转染293t/17细胞。在lsrii流式细胞仪(bd)上36小时后，用抗dsg3ec1-igg1(克隆：px43)和抗人fc-pe(克隆hp6017)通过流式细胞术验证表达。

基于hiv-1的自身失活慢病毒的生产

为了促进caar构建体的稳定表达，使用第3代包装系统生产vsv-g假型慢病毒颗粒。简言之，用prrlsin.cppt.ef1a-dsg3caar的混合物转染处于90％的融合的293t/17细胞(atcccrl-11268)。与lipofectamine2000(生命科技公司)的复合的wpre质粒，包膜质粒pmd2.g(addgene12252)，包装质粒prsvrev(addgene12253)和pmdlgm/prre(addgene12251)。在24、48和72小时后收获含有慢病毒的上清，通过0.4微米膜过滤，在4℃下以12000g浓缩12小时，并储存在-80℃直至进一步使用。

用nfat-gfpjurkatt细胞的报道基因测定

使用rpmi1640，hepes10mm，青霉素/链霉素1％和10％的fbs在完全湿润的环境中在37℃下用5％co2培养jurkat细胞。杂交瘤培养基另外补充有1％非必需氨基酸，1％丙酮酸钠和0.5mmbme。为了通过caar靶相互作用测试信号传导，将caar构建体在已经选择(g418)用于在nfat应答元件下控制的gfp的稳定表达的jurkat报道基因细胞系中进行表达，促进caar接合后的gfp表达，以及plcγ和ip3介导的细胞内钙释放。jurkat细胞系是由arthurweiss(ucsf)提供的。将jurkat细胞用caar慢病毒以5-10的感染复数(multiplicity)转导，并且在＞72小时后用抗ec5-dsg3小鼠igg1(克隆：5g11)和抗小鼠igg1-apc(克隆：a85-1，bdpharmingen公司)通过流式细胞术验证caar构建体的表达。为了产生靶结构，根据制造商的建议，用针对dsg3特异的单克隆人或小鼠igg1或用间皮素(阴性对照)装载甲苯磺酰基活化的dynabead(生命科技公司)。此外，将来自pv患者和非pv个体的血清装载到珠上。ak23杂交瘤细胞系(us7550562b2)用作分泌抗dsg3抗体并且对这些抗体是表面阳性的细胞靶标。作为阴性对照，我们使用分泌针对人vh3-15框架区(bk-2；us5738847a)的抗体的另一种杂交瘤细胞系。为了表征caar-靶相互作用，将caarjurkat细胞与珠以3∶1的珠∶细胞比例孵育4小时，或者在37℃下以递增浓度与靶细胞孵育4小时。通过流式细胞术验证gfp表达。除了珠和靶细胞外，使用来自非pv个体和原代人角质细胞(由sdrc，核心(core)b，宾夕法尼亚大学，提供)的人b细胞来测试脱靶效应。

原代人t细胞的刺激和扩增

将原代人t细胞在补充有1％青霉素/链霉素的rpmi1640、10％fbs和10mmhepes中进行培养。从自愿健康供体分离t细胞，并由人免疫学核心(宾夕法尼亚大学)提供。用抗cd3和抗cd28珠(dynabead，生命科技公司)以3∶1的珠∶细胞比例刺激大批t细胞(cd4+和cd8+)。当仅使用cd8细胞时，培养基补充150-300iu/mlil2。刺激后24小时，用caar构建体或模拟品对照以5-10的moi转导10⁶个t细胞。作为模拟品对照，我们使用针对人cd19或人间皮素的基于scfv的嵌合抗原受体。监测t细胞的扩增8-14天，前6天每2天分析细胞密度和细胞体积，之后每天分析。使用库尔特粒度仪(coultercounter)(贝克曼库尔特公司(beckmancoulter))分析细胞体积和细胞密度。以约400fl的细胞体积进行杀伤测定。使用抗-dsg3抗体(克隆：px43(igg1)、px44(igg1)、f779(scfv)、ak23(小鼠igg1))和针对人igg-fc的检测抗体(克隆：hp6017)，小鼠igg1(克隆：a85-1)或ha肽(克隆：3f10)通过流式细胞术验证caar构建体的细胞表面表达。用多克隆驴抗人igg(重链和轻链)或山羊抗小鼠igg检测基于scfv的嵌合抗原受体。

体外杀伤测定

使用51cr释放测定测试体外杀伤。将5×105靶细胞用50microci的na251cro4(珀金埃尔默公司(perkin-elmer))装载90分钟，洗涤两次并重悬浮于含有5％fbs的无酚红的培养基中。将caar或模拟品转导的t细胞与装载的靶细胞在各种效应子：靶标比率下共同培育4和24小时，并且使用microbeta2平板计数器(珀金埃尔默公司)测量释放进入上清中的铬。当仅使用cd8细胞时，在75iu/mlil2存在下进行测定。仅在相同体积中分析通过靶细胞的自发释放，并通过用2.5％终浓度的sds处理靶细胞来评估最大释放。为了测试重定向的fc受体介导的裂解，在浓度为5微克/ml的人单克隆抗dsg3igg1(克隆：pv2b7)或相同浓度的抗人cd3(okt3)的存在下，将cd32阳性的k562细胞与caart细胞一起孵育。

特异性裂解分析如下：

百分比特异性溶解：[(实验释放-自发释放)/(最大释放-自发释放)]*100

caart细胞的体内功效测试

如本文所述扩增caar或对照car转导的t细胞。对于体内实验，将caar或对照cart细胞调节至3×10⁷个细胞/ml的浓度，并与gfp-叩头虫红色或绿色转导的ak18、19或23杂交瘤细胞(以10⁶个细胞/ml)混合，导致t细胞与靶的比例为30。将细胞保持在冰上，并且将200μl的细胞混合物注射到nsg小鼠的尾静脉中，导致每只小鼠3×10⁶个t细胞和10⁵个靶细胞。静脉注射后，对nsg小鼠以300mg/kg体重的剂量注射d-萤光素单钾盐溶液。

用perkinelmerivis频谱临床前体内成像系统定量生物发光。在注射后第3、7、13、17/18、26和35天进行通过生物发光的肿瘤负荷的额外评估。使用livingimage软件4.4进行分析。为了分析，从小鼠的头部到中部的尾部建立了具有相同面积的感兴趣的矩形区域。在背景发光减除后计算以光子/秒计的总通量。使用10⁸光子/秒的生物发光来宣布小鼠死亡，因为这表示初始肿瘤负荷的约100倍扩增，并指示肿瘤对照的丧失。

根据批准的iacuc方案处死小鼠。将脾和骨髓样品保存在补充有10％fbs的rpmi培养基中，直到进一步处理。通过心脏穿刺获得来自处死小鼠的血液样品，并用edta抗凝。通过使细胞通过100um细胞过滤器获得来自脾脏和冲洗的骨髓样品的单细胞悬浮液。在室温下用抗人cd3(克隆okt3)，抗人cd45(克隆hi30或2d1)和抗人dsg3(克隆px44，没有通过edta变性的结合损失)将10⁶个细胞染色25分钟，用bdfacslyse进行固定，在4℃下储存，并在bdlsrii流式细胞仪上分析。

现在描述实验的结果。

寻常性天疱疮(pv)是抗体介导的自身免疫性疾病，其引起皮肤和粘膜的潜在致命的起疱。由于营养不良、感染和脱水，它可能危及生命。pv是模型组织特异性抗体介导的自身免疫性疾病，因为自身抗原dsg3(桥粒芯蛋白3)是明确定义的，并且抗桥粒芯蛋白抗体是必需的并且足以在动物和人皮肤模型中引起特征性基底水疱。

自身抗体由自身反应性b淋巴细胞合成和分泌，并且主要靶向dsg3的胞外ec1-3结构域，其中反式和顺式粘附残基位于其中。pv中最有效的治疗策略靶向b淋巴细胞并且包括全身性皮质类固醇、硫唑嘌呤、霉酚酸酯和环磷酰胺以抑制淋巴细胞增殖。利妥昔单抗用作通过b淋巴细胞特异性表面分子的抗cd20b细胞清除机制。然而，没有仅靶向与所有b细胞相反的自身反应性细胞的治疗。这导致当前的治疗策略具有严重的副作用，包括致命感染和继发性癌症。

最近，已经发现表达针对b细胞表面标志物cd19的嵌合抗原受体(car)的遗传工程化t细胞(dl波特(porter)等人，nejm2011；sa格鲁普(grupp)等人，nejm2013)特异性靶向和杀伤cd19+b细胞，并且可以诱导患有难治性b细胞恶性肿瘤患者的持久缓解。

如本文所述，t细胞可以通过表达重组嵌合t细胞抗原受体来工程化以杀伤靶细胞而不依赖于mhc和共刺激信号，该重组嵌合t细胞抗原受体具有特异性识别靶抗原的胞外结构域和在抗原结合后足以活化信号传导的胞内结构域(嵌合抗原受体，或car)。嵌合抗原受体由定制的细胞表面受体(通常是针对靶细胞上的特定细胞表面分子的抗体)，跨膜结构域和相同蛋白质中共刺激信号传导受体的胞内结构域组成。

使用car的益处包括针对几乎所有已知抗原的能力，car独立于靶细胞的mhc表达起作用，并且car与其靶抗原结合导致t细胞的活化，而不依赖于来自靶细胞的共刺激信号。用于pv处理的工程t细胞依赖于基因工程化t细胞的完美靶标，该基因工程化t细胞在所有靶细胞之间共享，并且对于靶细胞是独特(唯一的，unique)的。例如，pv中的自身反应性b细胞表达结合桥粒芯蛋白3的表面ig。

针对pv的基因工程化t细胞的设计最佳地包括具有靶向特异性自身抗体的高亲和力抗体结合部分的典型嵌合抗原受体(car)。在自身免疫性疾病如pv中，致病细胞(b细胞)已经在其细胞表面上表达高亲和力自身抗体。因此，用于自身抗体介导的疾病的基因工程化t细胞应当在其细胞表面上表达抗原而不是抗体，即嵌合自身抗体受体(caar)。在pv的情况下，这是dsg3。

图1是描述所提出的嵌合自身抗体受体(caar)如何不同于所有先前开发的技术的示意图。图的左半部分显示了效应细胞上的嵌合抗原受体(car)(患者自身的t细胞)，其靶向在b细胞淋巴瘤上特异性表达的抗原(cd19)。使pv自身反应性b细胞独特于所有其它b细胞的是它们在其细胞表面上表达对疾病自身抗原——桥粒芯蛋白3(dsg3)——特异性的自身抗体。因此，pvcaar是自身抗原(dsg3)，其靶向在自身反应性pvb细胞的表面上表达的dsg3-自身抗体。图2说明了工程化嵌合t细胞受体和靶dsg3特异的b细胞之间的相互作用比cd19或cd20靶向治疗对pv更具有特异性。与cd19或cd20靶向治疗不同，在dsg3靶向治疗的情况下，不应发生广义免疫抑制。工程化t细胞比基于单克隆抗体的治疗更可持续，因为t细胞响应于抗原而增殖并形成记忆性t细胞。此外，靶向dsg特异的b细胞的工程化嵌合t细胞受体除去记忆和短寿命抗体分泌b细胞(图3)。

桥粒芯蛋白是嵌合自身抗体受体(caar)的理想的自身抗原，因为它们由可以被截短的模块化胞外结构域组成。此外，caar功效受t细胞及其靶标之间的膜间距离影响，参见图4。

图5-6说明了从外周血单核细胞的cdna扩增dsg3(图5)和cd137(图6)的单个结构域的能力。图7进一步显示了来自质粒dn653的dsg3和dsg3caar的扩增。

在还原条件下在293t细胞的转化和细胞裂解后48小时通过免疫印迹分析dsg3caar蛋白(图8)。dsg3e-his杆状病毒上清液是阳性对照，未转染的hek293t细胞是阴性对照。未糖基化蛋白的预期大小为96kda，其通常由于糖基化以约112kd迁移。

为了评估dsg3caar的细胞毒性，确定在原代人t细胞中表达的dsg3caar杀伤表达抗dsg3表面自身抗体的靶细胞的能力(效力测试)和dsg3caar杀伤可表达表面fc受体的脱靶细胞的潜力，其可以结合pv自身抗体并导致非预期的重定向裂解(安全性测试)。

在裂解测定中测试dsg3caar对预期和非预期靶标的特异性。预期dsg3caart细胞将杀伤作为预期靶标的抗dsg3b细胞，这是因为在dsg3caar和抗dsg3自身抗体之间的高亲和力相互作用(图9的左侧)。而dsg3caart细胞和表达具有fc受体的抗dsg3的细胞(角质细胞)之间的弱嗜血性相互作用将不会导致由dsg3caart细胞造成的杀伤(图9的右侧)。

如预期的，dsg3caarjurkat细胞没有显示强的重定向裂解。用抗体包被的珠以3∶1的比例(珠∶细胞)刺激表达dsg3-caar的nfat-gfpjurkat细胞。图10中所示的流式细胞术图表明在暴露于pv靶抗体后在dsg3caarjurkat细胞中存在信号传导。ak23、pv4b3和pv2b7是dsg3特异性mab，其如果结合至caarjurkat细胞，则应该触发诱导gfp表达的信号传导。ef1a启动子比pgk启动子更好地起作用，并导致特异性信号传导。ss1＝将抗间皮素car用作阳性对照并具有基线阳性活性。使用非转导细胞作为阴性对照，并且没有检测到gfp信号。

在暴露于多克隆寻常性天疱疮(pv)患者血清igg后，在dsg3caarjurkat细胞中诱导低水平但特异性的信号传导(反映了dsg3特异性的总igg的低总体百分比)(图11)。dsg3caarjurkat细胞还以剂量依赖性方式对细胞(ak23杂交瘤)上的低数量的表面igg反应。当dsg3caarjurkat细胞暴露于表达dsg3的角质细胞时，不诱导信号传导，表明dsg3与角质细胞上的桥粒钙粘素的相互作用不应当导致皮肤或粘膜毒性。

为了测试dsg3caar效应细胞的安全性，提出了不同的情况用于测试针对表达抗dsg3表面自身抗体的靶细胞和表达表面fc受体的脱靶细胞的细胞毒性，所述表面fc受体可结合血清pv自身抗体，导致非预期的重定向裂解。图14左侧的细胞显示作为预期靶标的抗dsg3b细胞的预期杀伤。图14右侧的细胞显示可能通过重定向裂解表达fc受体的细胞的非预期杀伤。

将dsg3caar效应细胞暴露于表达预先装载有pv抗dsg3mab(pv2b7)的表面fc受体的k562细胞系。在与fc受体结合的pvmab的情况下，没有观察到重定向裂解(图15中的左图)，因为其表现类似于阴性对照和非转导细胞(图15中的右图)。

tcr活化(并因此杀伤)取决于效应细胞和靶细胞之间的距离(理想距离为14-15nm)。较短或较长的距离将导致tcr活化的损失。dsg3caar的靶标(表面igg)为约8.4nm。桥粒芯蛋白3大致为12.5-18nm长。桥粒间隙为约40nm。桥粒芯蛋白3由5个ig样结构域组成，每个大小约为3.5nm。当通过ec2顺式相互作用相互作用时，反式和顺式相互作用约为24.5nm。

为了确定dsg3的仅仅部分的表达是否可以导致增强的caar激活，由于免疫突触的最佳细胞间距离，使用不同的dsg3ec结构域构建体(分子间粘附结构域包含在ec1-2中)。还可以使用其它ec-结构域构建体，并在本披露中详述。图16a是电泳凝胶的图像，显示不同的dsg3胞外结构域(ec2-3、ec1-2、ec1-3、ec1-4和ec1-5)的扩增(图16b)，其被构建以优化dsg3caar细胞毒性，因为caar介导的细胞毒性的功效取决于效应细胞和靶细胞之间的距离。

dsgec1-3、ec1-4、ec1-5caar在原代人t细胞中表达，并且由3种不同的pv抗dsg3mab、ak23、px44和f779识别(图17)。ec1-2没有有效表达。

dsg3caar针对抗-dsg3igg小鼠杂交瘤的功效(意在模拟在细胞表面上显示抗dsg3igg的pv特异性人记忆b细胞或浆母细胞)显示于图18中。dsg3caar在原代人t细胞的表面上表达，并且与阴性对照bk2相比，在4小时后在铬释放测定中观察到ak23(抗dsg3杂交瘤)的特异性体外杀伤。

进一步显示dsg3caart细胞在铬-51释放测定中特异性杀伤ak23杂交瘤的功效。在24小时后在铬释放测定中，ak23杂交瘤的dsg3caar杀伤随时间增加(图19)。基本上，在16小时后用dsg3ec1-3和ec1-4caar观察到约100％的杀伤。caar的杀伤效力与caar大小相关(越短越好ec1-3＞ec1-4＞ec1-5)。人cd19不在靶杂交瘤细胞上表达，因为抗人cd19car是模拟品对照。不表达dsg3-自身抗体的对照杂交瘤(bk2)在24小时内表现出通过dsg3caar细胞的一些杀伤，可能是由于人-小鼠同种异体反应性。

dsg3caart细胞杀伤靶向广泛范围的表位f779(抗ec1)和pvb28(抗ec2)的抗dsg3细胞。dsg3ec1-4caar(ec1-4bbz)杀伤抗ec1、抗ec2和抗ec3b细胞，参见图20。dsg3ec1-4caar也不杀伤k562野生型(wt)细胞(图21)，以及非转导的t细胞不杀伤f779/pvb28k562细胞。表达f779或pvb28表面免疫球蛋白的k562细胞还表达cd19和间皮素。将未转导(ntd)t细胞用作阴性对照。

为了确定抗体密度在杂交瘤和记忆b细胞之间是否相当，在杂交瘤细胞、ak18、ak19和ak23以及人b细胞上进行抗dsg表面igg的定量。通过荧光/蛋白(f/p)比例测量杂交瘤上igg的密度。考虑到细胞之间的大尺寸差异，杂交瘤细胞约567.5um²和人b细胞约160.3um²，杂交瘤的表面积是人记忆b细胞的约3.54倍。因此，荧光/蛋白质(f/p)比例需要考虑表面积。在约ak18：1130，ak19：5300，ak23：1765和人b细胞：3570下，计算归一化的表面igg密度，参见图22。

进一步测试dsg3caart细胞以确定抗体亲和力是否影响功效。由在本文所述的杀伤测定中使用的杂交瘤、ak18、ak19和ak23分泌的靶免疫球蛋白的相对亲和力，显示在图23中。这三种抗体具有不同的亲和力，并且dsg3caart细胞对所有三种都有效。

为了进一步测试dsg3caart细胞的功效，将可溶性阻断抗dsg3抗体添加到杀伤测定中。dsg3caart细胞表现出特异性杀伤，甚至在增加浓度的可溶性抗体的存在下(图24)。在来自相同克隆的杂交瘤和可溶性抗体的存在下进行杀伤测定。图24表明dsg3caart细胞靶向细胞，甚至在所有所测试条件的可溶性阻断抗dsg3抗体的存在下。

为了测试dsg3caart细胞的脱靶杀伤，检查了潜在的情况。表达结合血清抗dsgigg的fc受体的细胞可被表达dsgcaar的t细胞杀伤。然而，膜间距离可能太大而不允许有效杀伤。血清抗dsg3igg通常还仅存在少数(约1％)的总血清igg，表明毒性应该是最小的。表达桥粒钙粘素(桥粒芯蛋白和桥粒胶蛋白)的角质细胞理论上可以与dsgcaar相互作用并被杀伤。然而，针对杀伤，膜间距离可能不是最佳的，并且相互作用的亲和力太低(μm范围)。

在逆向抗体依赖性细胞毒性(radcc)测定中测试带有dsg3的t细胞，以确定dsg3caart细胞是否靶向表达fc受体的细胞(图25中的上图)。将表达fcgri的k562细胞(cd64+k562)与pv血清中的caart细胞共孵育8小时。靶细胞对表面igg为100％阳性，但未被dsg3caart细胞杀伤。使用在正常培养基中表达pvb28igg4的k562细胞作为阳性对照，以显示相同的caart细胞实际上是功能性的(图25中的下图)，即特异性杀伤的靶细胞。

将dsg3caart细胞与在含钙培养基中生长的原代人表皮角质细胞一起孵育以诱导桥粒装配。在dsg3ec1-4caart细胞的情况下，未观察到杀伤(图26)。相比之下，由针对dsg3和dsg1的mab组成的cart细胞有效地杀伤角质细胞。

dsg3caart细胞还在体内有效控制分泌igg的杂交瘤细胞。图27显示了ak19杂交瘤细胞，并且将dsg3ec1-4caart细胞或对照cart细胞共同移植到nsg小鼠中。在指定的时间点，通过生物发光成像量化肿瘤负荷。使用生物发光＞10e8(总通量[p/s])来宣布小鼠‘死亡’。

在逃逸小鼠(4只caar处理的小鼠，其具有延迟的ak19的向外生长)中，回收的ak19细胞大部分是表面免疫球蛋白阴性，表明有效消除靶(抗dsg3igg+)细胞(图28)。在体内注射前，将ak19杂交瘤用gfp和叩头甲虫绿色萤光素酶标记，这允许确定ak19细胞是否保持sig+。将1e6个骨髓细胞用饱和量的抗小鼠igg1-apc进行染色。41.6+49.6＝91.2％的培养的ak19杂交瘤细胞是sig+(左图)。6/8的共注射的小鼠显示出像9382的图式，几乎没有可检测的gfp+细胞。9406和9407(逃逸小鼠)显示具有减少的或无表面igg表达的gfp+细胞。

dsg3caart细胞进一步植入并维持长期caar表达(图29)。事实上，与对照cart细胞相比，观察到细胞的显著扩增。小鼠骨髓(bm)中人t细胞的百分比：对照car对dsg3caar

图30a-c显示了植入不同免疫区室，血液(图30a)，骨髓(图30b)和脾脏(图30c)中的dsg3caart细胞的存在。

图31中显示的是在caar注射后35天来自7只caar处理的小鼠的全血计数。未检测到具有fc受体的细胞的耗尽(ne＝嗜中性粒细胞，mo＝单核细胞)。显示了针对ak23(抗ec1)的dsg3ec1-4caar和dsg3ec1-3caar的体内功效。

dsg3ec1-3caar通过生物发光进一步降低ak23肿瘤负荷(图32a)并且增加生存期(图32b)。潜在地类似于ak19，针对阴性表面免疫球蛋白ak23细胞，可选择逃避dsg3ec1-3caar的小鼠。图33-35进一步显示dsg3ec1-4caart细胞显示出针对广泛体内靶标——包括ak18(抗ec3)，ak19(抗ec2)和ak23(抗ec1)——的功效，如通过在dsg3caart对对照cart处理的小鼠中的生物发光减少和dsg3caart处理的小鼠的生存期增加所证明的。

总之，已经开发了显示出表达表面抗dsg3igg的细胞的特异性结合，活化和杀伤的dsg3caar(功效)。dsg3caar不响应于表达dsg3的角质细胞或表达可结合血清抗dsg3igg的fc受体的细胞而活化(安全性)。此外，dsg3caar是一种新颖的和具体的策略，仅靶向pv中的自身反应性b细胞，并且可以用作caar在其它自身抗体介导的疾病中的治疗用途的原理的证据。

为了测试caar细胞是否可以用dsg1工程化并且与dsg3caar细胞一样在杀伤方面有效，产生包括dsg1的caar构建体(图36)。基于优化dsg3caar的结果，构建由针对caar胞外结构域的dsg1的ec1-5结构域构成的dsg1caar。k562细胞被工程化以表达具有dsg1ec1或dsg1ec2特异性的单克隆表面igg。在⁵¹铬释放测定中16小时后，dsg1caar细胞有效地杀伤抗ec1和抗ec2b细胞，参见图37a，但不杀伤野生型k562细胞或表达抗dsg3抗体的k562细胞(图37b)。

为了测试用kir结构域工程化的dsg1或dsg3caar是否有效杀伤靶细胞，产生包括kir跨膜和胞质结构域的caar构建体(图38)。基于优化dsg3caar的结果，构建了由具有kir跨膜和胞质结构域的dsg3的ec1-3或ec1-4结构域组成的dsg3kircaar。pvb28细胞表达抗dsg3抗体。在⁵¹铬释放测定中16小时后，dsg3kircaar细胞有效地杀伤抗-ec2b细胞(图39a)而不是对照细胞(不表达抗-dsg3抗体)(图39b)。

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