本发明涉及一种乳酸的制备方法，更详细地，涉及一种通过生化方法来生产d型乳酸的方法。
背景技术：
乳酸作为食品、医药领域的原料被广泛使用，并且作为生物塑料材料的多重乳酸的单体来使用[1)c.akerberg，k.hofvendahl，g.zacchi，b.hahn-hagerdal，appl.microbiol.biotechnol.1998，49，682-690；2)k.hofvendahl，b.hahn-hagerdal，enzymemicrob.technol.2000，26，87-107.]。最近，随着对生物塑料的需求急剧增加，环保塑料备受瞩目，其中，多重乳酸因具有生物降解性及作为脱石油高分子而格外受到瞩目。通过使用多重乳酸作为原材料，可以制备汽车、家电、房屋及一次性塑料容器等生物降解性塑料，并且可以根据乳酸异构体的比例来调节塑料的加工性和机械性强度。随着多重乳酸的使用性的增加，对作为其单体的乳酸的合成方面也正在展开积极的研究。
乳酸可以通过化学方法和生物化学方法来制备。具代表性的化学方法为通过乳腈的水解反应来制备乳酸[1)r.datta，s.p.tsai，p，bonsignore，s.h.moon，j.r.frank，femsmicrobiol.rev.1995，16，221-231；2)y.j.wee，j.n.kim，h.w.ryu，foodtechnolo.biotechnol.2006，44，163-172]。在碱催化剂的作用下通过氰化氢和乙醛的加成反应，在10分钟内，以99％以上的转换率来合成得到乳腈。合成的乳腈通过蒸馏来完成分离和提纯过程后，通过使用硫酸催化剂的水解反应来转换成乳酸。此时，虽然转换率为99％以上，但是生成的乳酸是外消旋乳酸，所述外消旋乳酸混合有相同量的下述两种异构体(d型乳酸和l型乳酸)。
另一种化学方法为使用将铁或钴等的金属吸附于硅胶支撑体上的催化剂，在乙醛和一氧化碳，以及水的存在下制备乳酸的方法[s.k.bhattacharyya，s.k.palit，a.r.das，ind.eng.chem.prod.res.develop.1970，1，92-95.]。使用13g的催化剂，使5.5g的乙醛进行反应3小时后，虽然以44％的转换率生成了乳酸，但是需要在高温高压条件(230℃，350气压)下进行反应，而且还需要使用价格昂贵的金属催化剂作为催化剂，因此，在经济方面存在局限性。
化学方法虽然有反应简单、时间比较短等优点，但是对于商业性的使用来说，在经济方面受到限制，并且作为生成物只能制备出混合有相同的量的两个异构体的外消旋乳酸。
生物化学方法为通过使用细菌或霉菌等的微生物的碳水化物的发酵过程来制备乳酸，其中，使用的碳水化物为蔗糖、乳糖、淀粉及糊精等，非常多样。如果通过生物化学方法来制备乳酸，可以根据使用的微生物或碳水化物来分别得到纯的d型乳酸和l型乳酸。[1)y.j.wee，j.n.kim，h.w.ryu，foodtechnol.biotechnol.2006，44，163-172]。
通常，制备乳酸时主要使用细菌发酵方法。在现有技术中，公开有利用由德氏乳酸杆菌ld0025(lactobacillusdelbrueckii)和ld0028生产的淀粉酶(α-amylase、β-amylase)及支链淀粉酶(pullulanase)等的酶的水解作用来使大米粉(ricepowder)发酵，从而生产高纯度的d型乳酸的方法[k.fukushima，k.sogo，s.miura，y.kimura，macromol.biosci.2004，4，1021-1027]。另外，还公开有在l型乳酸脱氢酶基因(l-lactatedehydrogenasegene)消失的植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)中导入解读牛链球菌148(streptococcusbovis148)的α型淀粉酶(α-amylase)的质粒，并通过光学方法来从玉米淀粉中制备纯的d型乳酸的方法[k.okano，q.zhang，s.shinkawa，s.yoshida，t.tanaka，h.fukuda，a.kondo，appl.environ.microbiol.2009，75，462-467]。还报道有德氏乳酸杆菌nbrc3534(lactobacillusdelbrueckii)菌株将经过蒸汽处理的甘蔗渣作为碳源来使用，从而制备大量的d型乳酸的方法[c.sasaki，r.okumura，a.asakawa，c.asada，y.nakamura，j.phys.conf.ser.2012，352-361]。
l型乳酸也可以像d型乳酸一样通过使用多种菌株来制备出纯的l型乳酸。报道有以废糖蜜作为底物，通过使用粪肠球菌(enterococcusfaecalis)的发酵过程来制备具有高的光学纯度的l型乳酸的方法[y.j.wee，j.n.kim，j.s.yun，h.w.ryu，enzymemicrob.technol.2004，35，568-573.]，还报道有通过使用牛链球菌148(streptococcusbovis148)的生淀粉的发酵过程来制备l型乳酸的方法[j.narita，s.nakahara，h.fukuda，a.kondo，j.biosci.bioeng.2004，97，423-425.]。另外，提出有不仅是使用细菌，而且还通过使用根霉菌(rhizopusspecies)中的米根霉(rhizopusoryzae)作为霉菌从葡萄糖中生产l型乳酸的方法。其通过调查营养成分对l型乳酸生产所带来的效果，从而提出了用于大量生产l型乳酸所需的适当的条件。并且，还公开了开发纤维状生物反应器，并利用在棉块儿上固定霉菌菌丝来进行发酵的方法，并通过米根霉(rhizopusoryzae)来从葡萄糖和玉米淀粉中生产l型乳酸的方法[1)y.zhou，j.m.dominguez，n.cao，j.du，g.t.tsao，appl.biochem.biotechnol.1999，78，401-407；.2)a.tay，s.t.yang，biotechnol.bioeng.2002，80，1-12；3)y.kosakai，y.s.park，m.okabe，biotechnol.bioeng.1999，55，461-470]。最近，为了减少生产成本，开发了一种通过基因操作细菌来生产l-乳酸的方法，所述基因操作细菌为可利用价格便宜的甘油作为培养原料的细菌。[s.mazumdar，m.d.blankschien，j.m.clomburg，r.gonzalez，microb.cellfact.2013，12，1-7]。另外，报道有在铅离子(二价)催化剂的作用下，由自然中存在最多的生物质-纤维素来合成乳酸的方法已获得一部分成功的内容[y.wang，w.deng，b.wang，q.zhang，x.wan，z.tang，y.wang，c.zhu，z.cao，g.wang，h.wan，naturecommun.，2013，7，doi:10.1038/ncomms3141]。
生物化学方法虽然有可以通过光学方法制备纯的乳酸的优点，但是反应过程与化学方法相比较为复杂，并且还存在反应时间长的问题。另外，使用的细菌或霉菌为厌氧性时，由于反应过程对氧敏感，因此需要注意。并且，在反应过程中，由于作为细菌的营养素而必需使用的酵母提取物或蛋白胨的价格昂贵，因此在经济方面存在局限性[a.w.schepers，j.thibault，c.lacroix，enzymemicrob.technol.2002，30，176-186.]。
技术实现要素：
要解决的技术问题
本发明要解决的技术问题为提供一种d型乳酸的制备工序，所述制备工序的反应时间短，反应条件简单，反应条件容易实现，并且可以以高的收率得到乳酸，而且能够得到光学纯度高的乳酸。
本发明要解决的另一技术问题为提供一种分析d-乳酸的含量的方法。
本发明要解决的又一技术问题为提供一种用于制备d型乳酸的酶。
技术方案
为了解决上述问题，本发明的特征为，在利用乙醛和氰化盐来制备乳酸的反应中，利用酶来使它们进行反应。
在本发明中，所述酶的特征为，其可以使乙醛和氰化盐进行反应而形成的乳腈的腈基进行水解，即，所利用的酶为具有腈基水解能力的酶。
从理论上来说虽然不做限定，但是所述酶起到使乙醛和氰化盐进行反应而生成的乳腈发生水解反应的水解反应催化剂的作用，并且所述氰化盐可以为钙、钠或氢。
在本发明中，所述酶为具有腈基水解能力的酶，而且通过水解反应，使得d-乳酸的生成量高于l-乳酸。
在本发明中，所述酶使得在生产的全部乳酸中的d-乳酸的比例优选为60摩尔％以上，更优选为65摩尔％以上，进一步优选为70摩尔％以上，最优选为80摩尔％以上。
在本发明中，所述酶可以为来源于微生物、植物或动物的酶。术语酶不仅表示酶本身，还应理解为其包括酶经过表达的细胞、酶经过表达的细胞的破碎物或由此纯化分离得到的酶，以及其遗传学上的处理物。作为一例，可以为通过重组dna技术，在大肠杆菌等的宿主中，利用生产酶的遗传学上的生成物。
在本发明的实施方式中，所述酶可以通过对菌体的培养液进行离心分离而获得细胞体后，将细胞体破碎，然后通过离心分离来获得上清液，然后对其进行冷冻干燥而得到。
在本发明的另一实施方式中，可以通过以下方法来获得所述酶：利用反相色谱法对经过提纯的酶进一步进行提纯，从而确定蛋白质的氨基酸序列，并基于该氨基酸序列来制备探针，然后从菌体的dna片段中克隆出编码腈基水解酶的活性主体的dna。接着，通过聚合酶链反应(pcr)对其进行扩增来制备重组质粒，并插入于大肠杆菌中，然后对该大肠杆菌等进行培养，从而可以获得所需的酶。
在本发明中，所述酶从yc6258(kccm43015)中提取，并且使用提取的酶，进行了如下述反应式1所示的乳腈(lactonitrile)的水解反应，其中，所述yc6258为从盐生植物糙叶薹草中分离的菌株。可以在一天内，以75％的分离收率来制备出d型异构体的比例高的乳酸([α]26＝-1.14(在水中c＝1.0)，参考值：l型乳酸，[α]21-22＝+2.60(在水中c＝2.5))。
在本发明中，从辣椒溶杆菌(lysobactercapsici)yc5194t(kctc22007t＝dsm19286t)、martelellaendophyticayc6887t(kccm43011t＝nbrc109149t)或hoefleasuaedaeyc6898t(kacc14911t＝nbrc107700t)中提取所述其它酶。
在本发明的实施方式中，反应温度可以为25℃和40℃，优选地，在25℃下进行反应。
在本发明的实施方式中，新型酶在ph6、7、8下维持高的活性，优选地，ph8时有利于乳酸的制备。
在本发明中，作为生成物的d型乳酸和l型乳酸具有化学式(1)的结构，可以通过本反应方法来调节d型乳酸和l型乳酸的比例，从而制备出生成物。
在本发明的实施方式中，通过使用透析膜，可以重复使用所述酶5次以上。
在一方面，本发明提供一种分析方法，所述分析方法是将包含d型乳酸和l型乳酸的乳酸混合物转换成乳酸苄酯(benzyllactate)，并利用高效液相色谱仪(hplc)来进行分析的。
在本发明中，根据如下述反应式(2)来实施所述乳酸苄酯的合成。
在本发明中，d型乳酸苄酯和l型乳酸苄酯具有化学式(2)所示的结构，并且通过使用手性柱的高效液相色谱仪(hplc)来分别计算d型乳酸苄酯和l型乳酸苄酯的面积比，并由此来计算出所制备的乳酸的光学纯度。
有益效果
通过利用本发明的酶的乳酸的制备方法，可以在容易实现的反应条件下，通过简单的反应过程来制备d型异构体为占优势的乳酸。
通过利用本发明的酶的乳酸的制备方法来调节反应时间，从而能够调节所制备的乳酸的d型异构体和l型异构体的比例。
通过本发明的酶的重复使用方法，在本反应中，可以将酶重复使用最少5次以上，从而可以用低成本来制备乳酸。
附图说明
图1为本发明实施例2中制备乳酸的流程图。
具体实施方式
实施例1.制备yc6258菌株和其它菌株的酶液的方法
在大量培养用液体培养基(1g的蔗糖、2g的酵母提取物、5g的酪蛋白、4g的mgso4、2g/l的mgcl2)中，在28℃，120rpm的条件下，振荡培养新型菌株yc625872小时。以8000rpm对培养液进行离心分离20分钟，从而获得细胞体，然后用ph6.5的50mm磷酸缓冲液进行悬浮。将悬浮液置于冰中，并在该状态下进行超声波处理，从而将细胞破碎后，在12000rpm下进行离心分离30分钟，从而获得上清液。对上清液进行冷冻干燥处理，并在各反应中使用。制备yc5194t、yc6887t、yc6898t的酶液的方法同上述的制备yc6258的方法。不同点在于，制备yc5194t、yc6887t、yc6898t时的培养基分别使用了50％的大豆肉汤(tryticsoybroth)、m10broth(10g的酵母提取物、4g的mgso4、2g的mgcl2、5g的nacl、1g的k2hpo4、10g/l的蔗糖)及海生菌肉汤(marinebroth)来进行培养。
实施例2.使用了新型酶的多种d型/l型比例的乳酸的制备
在100ml的圆底烧瓶中加入2.0m的氰化钾水溶液(1.0当量，50ml，ph8)，并加入新型酶yc6258(200-500mg)后，添加乙醛(100mmol)，并在常温下搅拌。加入1当量浓度的氯化氢溶液(2.5当量)而使溶液酸化后，用异丙醚连续提取24小时后，去除有机溶剂，从而获得液体生成物。根据图1所示的[反应式3]制备了乳酸。
为了确认制备的乳酸的光学纯度，进行了[反应式2]所示的乳酸苄酯的合成反应。在4ml的玻璃瓶中加入制得的乳酸(1.0mmol)和甲醇(0.5ml)，并滴加1,8-二氮杂双环十一碳-7-烯(1,8-diazabicycloundec-7-ene；dbu)(1.0当量)后，在常温下搅拌30分钟。之后去除甲醇，并加入二甲基甲酰胺(dimethylformamide；dmf)(0.5ml)，然后滴加氯化苄(1当量)后，在常温下搅拌24小时。去除有机溶剂，然后用乙酸乙酯提取并浓缩后，利用乙酸乙酯和己烷(1:4体积比)，并通过柱色谱法来获得液体生成物(134mg，74％收率)。使用高效液相色谱仪(hplc)来测定合成的乳酸苄酯的光学纯度(分析条件；柱：chiralcel-od，展开溶剂：己烷/异丙醇＝98/2，流速＝1.0ml/分钟，uv＝217nm，滞留时间：16.2分钟(l型乳酸苄酯)，17.5分钟(d型乳酸苄酯))。结果如下述表1中所示。
表1
本发明中的乳酸转换率是通过由核磁共振(nmr)来测定的反应物中所生成的乳腈与乳酸的面积比来计算得到的。分离收率是通过以下方式计算得到的。测定通过连续提取来提纯后所得到的乳酸的重量，并根据所使用的乙醛的量的生成物的理论上的获得量来计算出。
制得的乳酸的d型/l型乳酸的比例是通过以下方式计算得到的。将乳酸转换成乳酸苄酯后，使用高效液相色谱仪来测定d型乳酸苄酯和l型乳酸苄酯的面积比，并通过考虑乳酸转换率来计算得到。乳酸的光学纯度是通过数学式((d型乳酸苄酯面积比-l型乳酸苄酯面积比)/(d型乳酸苄酯面积比+l型乳酸苄酯面积比)×100)来计算得到的。
通过改变使用的新型酶的量和反应时间来测定生成的乳酸的光学纯度。其结果为，乳酸转换率越低，显示出的生成的乳酸的光学纯度越高。通过本方法，可以以41％的分离收率来生成最高具有84％的光学纯度的d型乳酸，并且可以以最高75％的分离收率来生成具有40％的光学纯度的d型乳酸。
在使用氰化钠来代替氰化钾时，在相同的反应条件下，也以73％的分离收率生成了具有39％的光学纯度的d-乳酸。
实施例3.使用了多种新型酶的乳酸的制备
在100ml的圆底烧瓶中加入2.0m的氰化钾水溶液(1.0当量，50ml，ph8)，并加入新型酶(500mg)后，添加乙醛(100mmol)，并在常温下搅拌3小时。加入1当量浓度的氯化氢溶液(2.5当量)而使溶液酸化后，用异丙醚连续提取24小时后，去除有机溶剂，从而获得液体生成物。结果如下述表2中所示。
表2
使用从多种菌株中提取的新型酶来进行反应的结果为，多种新型酶对本反应的反应性类似。通过进行3小时的反应，以51-57％的转换率生成乳酸，并且对所生成的乳酸测定光学纯度的结果为，显示出了64-68％，并且生成了整体上d型异构体占优势的乳酸。
实施例4.使用了透析膜的新型酶的重复使用
将新型酶(500mg)溶于蒸馏水(5ml)中后，将其加入到截留分子量(molecularweightcut-off)为10,000的透析膜中而制成“酶膜”后，装进100ml的烧杯中，并加入2.0m的氰化钾水溶液(1.0当量，45ml，ph8)和乙醛(100mmol)，并在常温下搅拌24小时。加入1当量浓度的氯化氢溶液(2.5当量)而使溶液酸化后，用异丙醚连续提取24小时后，去除有机溶剂，从而获得液体生成物。结果如下述表3中所示。
表3
用新型酶制备酶膜并重复使用的结果为，确认了酶最少可重复使用5次以上。并且确认到，还一定地维持了反应的乳酸的转换率和收率，并且还维持了所生成的乳酸的光学纯度。
本发明并不限定于上述特定的实施例，本发明所属技术领域的技术人员在不超出本发明的主旨的范围内，可对本发明进行多种变形的实施例。因此，本发明的范围并不局限于上述实施例，并且不仅通过后述的权利要求保护范围而决定，而且应由与该权利要求保护范围等同的内容所决定。