一株死谷芽孢杆菌及其应用的制作方法

本发明涉及生物
技术领域：
，特别是一株死谷芽孢杆菌WMOO5（BacillusvallismortisWM005）及其在防治西瓜枯萎病中的应用
背景技术：
：枯萎病(Blight)是西瓜的一种毁灭性病害，在世界各西瓜产区分布广泛。随着我国农业产业结构的调整，西瓜种植面积越来越大，连作障碍已成为制约西瓜生产的重要因素。西瓜枯萎病是西瓜连作障碍的主要病害之一，其病原菌是尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusariumoxyporumf.sp.niveum)。随着西瓜逐年连作和重茬，西瓜枯萎病发生日趋严重，造成西瓜大量减产，一般病田间减产30%～40%，重病田则可减产80%以上甚至绝产，造成严重的经济损失，严重限制了西瓜生产。虽然可以从筛选抗性品种、加强栽培等措施进行综合防治西瓜枯萎病，但目前化学药剂防治是控制西瓜枯萎病的重要而有效方法。目前国内已筛选出了一些有效的药剂，如25%咪鲜胺EC、70%恶霉灵WP、50%多•霉威WP、50%异菌脲WP、50%咪鲜胺锰盐WP、32.5%苯甲嘧菌酯SC以及30%苯甲丙环唑EC等药剂对西瓜枯萎病的有较好的防治效果。但长期使用化学杀菌剂不仅造成西瓜枯萎病菌的抗药性逐年增加，同时也会产生农药残留等问题，随着现代社会的发展，人们对环境保护和自身健康的关注，生防微生物以其低毒、对人类健康安全等优势，已越来越多的应用于农业植物病害防治。生物防治是植物病虫害综合治理的重要手段，对实现农业的可持续发展具有重大意义，而分离与筛选高效生防微生物则是实现生物防治的前提。芽孢杆菌(Bacillussp.)是人类发现最早的细菌之一，分布广泛，其抑制病原菌的范围很广、抗性强、无毒副作用，在动植物的生物防治中，应用比较广泛。芽孢杆菌可产生肽类、脂肽类、磷脂类、多烯类、氨基酸类、核酸类等抗菌物质，不同种类的抗菌物质有不同的生物学活性，因此芽孢杆菌所分泌的胞外抗菌物质能抑制真菌、细菌、病毒等多种致病因子。目前芽孢杆菌用于植物土传病害的例子很多，例如在美国获得环保局商品化或有限商品化生产应用许可的枯草芽孢杆菌的生防菌株中，GBO3、FZB24都可以用于枯萎病的防治；王雅平用分离至丝瓜土壤的枯草芽孢杆菌（B.subtilus）TG26浸根处理西瓜和烟草幼苗，对西瓜枯萎病和烟草青枯病的田间防效分别73.1%和79.6%，并有明显的增产效应；死谷芽孢杆菌(Bacillusvallismortis)是枯草芽孢杆菌的近亲，可以对多种植物病害菌株产生拮抗作用。林英等报道的一株死谷芽孢杆菌菌株CZ（“一株死谷芽孢杆菌的分离、鉴定及抗病促生效果初探”，北方园艺）具有广谱的抑菌效果，通过平板对峙法研究表明，该菌株对立枯丝核菌、香瓜枯萎病、水稻恶苗病、苹果炭疽病原菌都具较强的拮抗作用，对西瓜枯萎病菌、黄瓜枯萎病、小麦赤霉病有较好的抑制作用，该CZ菌株扫描电镜观察菌体为杆状，端圆，无鞭毛。16SrDNA序列分析该菌株属于芽孢杆菌属，系统进化树分析结果表明CZ与已知菌Bacillusmojavensis的亲缘关系最近在同一分支上。经生理生化鉴定初步确定为死谷芽孢杆菌（BacillusvallismortisCZ），对西瓜枯萎病菌有一定的抑制作用，但该菌抑菌直径在2-5mm之间，抑菌圈较小，抑菌能力较弱，很难满足农业生产需求。技术实现要素：本发明提供一株死谷芽孢杆菌WMOO5，能够有效的防治在防治西瓜枯萎病，本发明是这样实现的：一株死谷芽孢杆菌WMOO5（BacillusvallismortisWM005），其保藏号为CCTCCNO:M2016020；所述死谷芽孢杆菌WMOO5为革兰氏阳性菌株，菌体呈杆状，无鞭毛，两端钝圆，产生椭圆形芽孢，该菌株在LB培养基上菌落呈乳白色，边缘不规则，表面干涩易起皱，易挑起。保藏号为CCTCCNO:M2016020的死谷芽孢杆菌WMOO5在防治西瓜枯萎病中的应用。进一步，本发明所述保藏号为CCTCCNO:M2016020的死谷芽孢杆菌WMOO5在防治西瓜枯萎病中的应用，具体为：在西瓜苗定植大田后，向西瓜苗根部灌死谷芽孢杆菌WMOO5菌液，400mL/株，用以防治西瓜枯萎病。进一步，本发明所述死谷芽孢杆菌WMOO5菌液的制备方法为：（1）挑取保藏号为CCTCCNO:M2016020的死谷芽孢杆菌WM005至菌种保藏培养基，30℃连续划线、挑单菌落培养两次后，挑取单菌落在菌种活化培养基中，于30℃，150-200rpm摇床振荡培养12-24h；（2）向含有种子培养基的发酵罐中，按照体积比1:9的接种量接种菌株，于25-38℃，通空气培养16-24h，得到液体种子；（3）按体积比10%的接种量向种子培养基中接种液体种子，于30-35℃，150rpm摇床振荡下避光培养24h，得到活菌体培养物；（4）取活菌体培养物于4℃、5000rpm条件下离心15min，取沉淀用0.85%的无菌生理盐水冲洗3次，调节至菌含量为1010cfu/mL，即获得死谷芽孢杆菌WMOO5菌液。本发明获得的保藏编号为CCTCCNO:M2016020的菌株对西瓜枯萎病菌具有强烈的拮抗作用，PDA平板平板对峙实验中该菌株对西瓜枯萎病菌的抑菌带直径4.0cm，抑菌率为80.0%，以该菌株制备的菌剂浓度在107-108cfu/mL左右时，能够在土壤和西瓜植株中稳定定植并有效防止西瓜枯萎病的发生，与对照相比发病率下降69.5%。大田试验结果表明，生防菌WM005对西瓜枯萎病的防效（86.7%）显著高于化学药剂多菌灵的防效（73.3%），具有极高的应用推广价值。附图说明图1为菌株WM005电镜图片。图2为菌株WM005的16SrDNA序列的邻接系统发育树示意图。图3为菌株WM05在PDA培养基上对西瓜枯萎病菌的抑制作用示意图。图4为菌株WM05对西瓜枯萎病的室内防治试验效果示意图。具体实施方式本发明技术方案生产的对植物内生菌剂能够高效防治西瓜枯萎病菌引起的枯萎病。以下通过具体实施例详细说明本发明的实施，目的在于帮助读者更好地理解本发明的精神实质，但不作为对本发明实施范围的限定。实施例涉及的培养基：LB固体培养基（菌种保藏培养基）：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，琼脂20g，加水至1L，pH7.0-7.5；LB培养液（菌种活化培养基）：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，加水至1L，pH7.0-7.5；种子培养基（液体，1L）：K2HPO44.8g，KH2PO43.5g，（NH4）2SO42g，MgCl20.16g，CaCl20.02g，Na2MoO4.2H2O0.0024g，FeCl30.0018g，MnCl2.2H2O0.0015g，pH=7.0。绿豆汤培养基：300g绿豆于水中煮沸10分钟，用4层纱布过滤去渣后，定容至1000mL，高压121℃灭菌20min。以上培养基均在121℃灭菌15-30min。LB平板：配制100ml上述LB固体培养基，高压灭菌后，将融化的LB固体培养基置于55℃的水浴中，待培养基温度降到55℃时倒板，10mlLB固体培养基倒入一个灭菌培养皿中，打开盖子，在紫外灯下照10-15分钟，冷却后用封口膜密封并倒置放于4℃冰箱中，备用。PDA平板：马铃薯去皮200g切成小块放入锅中，加入1000ml水，加热煮沸持续20-30min，4层纱布趁热过滤去渣，加入20g琼脂粉，待琼脂融化，加入20g葡萄糖，加水补足1000ml，在121℃灭菌15-30min后，取出冷却至55℃，每10mlLB培养基倒入一个灭菌培养皿中，打开盖子，在紫外灯下照10-15分钟，冷却后用封口膜密封并倒置放于4℃冰箱中备用。实施例中使用的西瓜枯萎病菌（Fusariumoxyporumf.sp.Niveum）由江苏农科院食检所产地环境研究室保存；西瓜种子为苏蜜五号，购于江苏省江蔬种苗科技有限公司。实施例1菌株采集及菌剂的制备1、菌株的获得：(1)样品采集：采集江苏省南京市江苏省农业科学院蔬菜基地大棚内的番茄植株根部适量新鲜植株样本，用自来水将其表面附带灰尘泥土冲洗干净，自然风干，然后将植株根部组织进行表面消毒：然后依次用75%酒精浸泡1min和8%NaClO浸泡4min进行表面消毒处理，无菌水洗4次；(2)分离筛选：将根茎叶用无菌剪刀剪开，根和茎切成1cm左右的小段，放置于LB平板上；根加水研磨至糊状，静置10min后涂布LB平板，均放置于30℃培养48h；(3)纯化：待有培养物长出后，采用平板划线分离法纯化，挑取在最高浓度下生长的菌落在富集培养基上划线，直到分离获得纯培养物。申请人将分离获得的菌株自命名为WM005，该菌株为革兰氏阳性菌株，其电镜照片如图1所示，菌体呈杆状，无鞭毛，两端钝圆，能够产生椭圆形芽孢。该菌株在LB培养基上其菌落呈乳白色，边缘不规则，表面干涩易起皱，易挑起。能在25-40℃的温度下生长，最适生长温度为32℃；生长pH范围为4.0-9.0；最适pH为6.5，其具体理化特性如表1所示：表1菌株WM05的生理生化特性测试项目Testitem结果Results测试项目Testitem结果Results菌株形态Morphology杆状rod葡萄糖酸盐Gluconate+革兰氏反应Gramreaction+丙二酸盐Malonate-接触酶Catalase+氧化酶Oxidase+V-P试验+M.R试验+硝酸盐还原Nitratereduction+柠檬酸盐Simmon’scitrate+石蕊牛奶+明胶液化gelatinliquefaction-吲哚Indole+淀粉水解+*+代表反应呈阳性，-代表反应呈阴性（+positivereaction,-negativereaction）WM005菌株的16SrDNA系统发育分析如图2所示，利用其16SrDNA基因序列在Genbank（网址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上用BLAST程序与已登录细菌菌株的16SrDNA基因序列进行比较，结果表明与死谷芽孢杆菌Bacillusvallismortis.相似性最高，可以达到99%以上。申请人于2016年1月7日将该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址为中国武汉市武汉大学，邮编为430072，该菌保藏为死谷芽孢杆菌WM005，Bacillusvallismortis.WM005，保藏编号为CCTCCNO:M2016020。2、WM005菌液制备（1）挑取WM005至菌种保藏培养基，30℃连续划线、挑单菌落培养两次后，挑取单菌落在菌种活化培养基中，于30℃，150-200r/min摇床振荡培养12-24h；（2）向装有高温灭菌的种子培养基的发酵罐中，按照1:9（V/V）的接种量接种振荡培养后的WM005菌株，于25-38℃，通空气培养16-24h，得到液体种子；（3）向装有高温灭菌的种子培养基中，接种液体种子（以体积比10%的接种量），于30-35℃，150r/min下摇床振荡避光培养24h（至对数生长期），得到活菌体培养物；（4）取活菌体培养物于4℃、5000r/min下离心15min，取沉淀用0.85%的无菌生理盐水冲洗3次，加入适量种子培养基调节菌含量至1010cfu/mL左右，即为WM005菌液；然后加入体积分数为50%的甘油，灌装保藏，使用时稀释500-1000倍。实施例2菌株WM005对西瓜枯萎病菌的抑制作用试验（1）将西瓜枯萎病菌接种于PDA平板上，28℃培养长满平板后，用直径5mm的打孔器制成菌饼，将菌饼接种于PDA平板的中央，同时在距中心30mm左右的四个角点上点接实施例获得的WM005菌液（浓度108cfu/mL，100μL），同时以只接病原真菌的平板作对照组，每个处理3重复；（2）将PDA平板置于28℃培养7d，待对照组病原真菌菌落长满平板，测量病原真菌菌落直径，并按如下公式计算抑菌率：抑菌率（%）=[(A-B)/(A-5)]*100%；（注：A为对照组病原真菌菌落直径，B为处理组病原真菌菌落直径）。（3）抑菌结果如图3所示，其中，图3A为实验组，图3B为对照组，由图可见，WM005菌株对西瓜枯萎病菌的抑菌带直径4.0cm，抑菌率为80.0%。实施例3WM005菌株在土壤和西瓜菌株定植试验向LB平板中加入1μg/mL利福平，然后接入WM005菌株，逐步增加利福平的浓度至300μg/mL，筛选出能稳定生长且生理特性与原始菌株一致的突变体菌株；在LB平板上转接10代，观察菌落形态，然后转接至含有300μg/mL利福平的LB培养基中标记。1、WM005在土壤中定植(1)将用300μg/mL利福平标记过的菌株WM005接种于LB培养液，于32℃，180r/min，摇床振荡24h，制成含菌量约为108cfu/mL的标记菌株菌悬液；(2)分别把自然土（取自南京，江苏省农业科学院实验田）及灭菌土装于花盆中，每盆1kg土，向土壤中注入100mL标记菌株菌悬液拌匀；(3)室温下放置，每隔7天分离土壤内的细菌，土壤先经梯度稀释后，取10-3、10-4、10-5的土壤稀释液涂布平板，计算含菌量；(4)检测结果：28天后自然土和灭菌土中wm005的定殖量均能达到104cfu/g土以上，表明WM005菌株在土壤中具有较强的定殖能力。2、菌株WM005在西瓜植株中定植试验(1)选取饱满一致的西瓜种子，依次用75%酒精浸泡3min和8%NaClO浸泡5min，对种子进行表面消毒处理，以最后一次清洗的无菌水涂板检验消毒结果；(2)50℃无菌水浸泡2h后将种子置于铺有滤纸的培养皿内，以10mL/皿加入利福平标记后的WM005菌株，浸泡种子24h，同时以生理盐水为对照。(3)出芽后将移入营养钵内生长，定期取样检测菌株在西瓜根和茎内的定殖情况；(4)结果表明，28天后西瓜植株的根和茎内均能检测到WM005的定殖，根内定殖量较高，能达到104cfu/g，茎内的定殖量能达到103cfu/g以上，这说明WM005菌株在西瓜中具有较强的定殖能力。实施例4WM005防治西瓜枯萎病盆栽试验西瓜枯萎病菌孢子悬浮液制备：西瓜枯萎病菌在PDA平板上培养6-7d，用孔径为20mm的打孔器在培养基上打孔，取10片带菌培养基加入200mL灭菌绿豆汤培养基中，于28℃，180r/min，摇床振荡培养7d，用灭菌纱布（4层）过滤去渣，滤液于4℃、5000r/min下离心10min，去上清液取沉淀物（西瓜枯萎病菌分生孢子），用液体马铃薯培养基重悬后，用灭菌去离子水稀释使孢子浓度1×106个/mL，28℃孵育60min，备用。盆栽试验在江苏省农业科学院日光温室内进行，供试西瓜品种为苏蜜五号。设3个处理：A.WM005菌液，B.西瓜枯萎病菌，C.WM005菌液+西瓜枯萎病菌，每处理3重复，每重复12株小苗。试验具体步骤为：(1)将种子表面消毒后，无菌水浸泡过夜，32℃恒温2d催芽。露白后播种于穴盘，待小苗长至2片真叶时，移栽至内径10cm，高15cm，内装300g灭菌土壤的塑料杯中。(2)移栽一周后，在处理组A与处理组C中根灌30ml108cfu/mL生防菌菌液。(3)一周后，在处理组B、处理组C接种西瓜枯萎病菌孢子悬浮液（每塑料杯接种50mL）。接种病害真菌后，调查植物发病情况，待只接病原真菌组60%的小苗出现发病症状（叶片或茎蔓萎蔫面积超过整株的1/4既为发病）后，结束试验。试验结果如图4所示，其中图4A为只喷施WM005菌液处理效果；图4B为只接种枯萎病菌处理结果；图4C为喷施WM005菌液和枯萎病菌处理结果；可见，C处理中接种WM005菌液后的西瓜植株后能够有效防止西瓜枯萎病的发生，与对照（B）相比发病率下降69.5%详见表2。表2WM005防治西瓜枯萎病盆栽试验结果处理发病株数发病率（%）处理A00处理B36100处理C1130.5实施例5WM005防治西瓜枯萎病大田试验田间小区试验在江苏省农业科学院试验区温室大棚进行，首先将消毒的西瓜种子催芽后种植于灭菌穴盘中，待西瓜苗长出3-4片真叶时定植到大田。待西瓜苗定植7d后，每株西瓜苗根部浇灌400mL西瓜枯萎病菌孢子悬浮液（孢子浓度1×106个/mL）。试验设4个处理，同时以多菌灵（50%多菌灵可湿性粉剂800倍液）、实施例1获得的WM005菌液（1×108cfu/mL）和对照空白培养液（灭菌后的种子培养基），每处理30株西瓜苗，3次重复。在浇灌西瓜枯萎病菌孢子悬浮液的第2d每个处理分别在西瓜苗根部浇灌400mL。20d后调查发病情况（叶片或茎蔓萎蔫面积超过整株的1/4既为发病），计算发病率和防效，结果详见表3。表3WM005防治西瓜枯萎病大田试验结果处理发病株数发病率（%）防效（%）对照8594.4-多菌灵2426.773.3WM0051213.386.7由表3可见，生防菌WM005对西瓜枯萎病的防效（86.7%）显著高于化学药剂多菌灵的防效（73.3%），对西瓜枯萎病具有明显的防治价值。当前第1页1 2 3