技术领域本发明涉及一种MIM-I-BAR蛋白提取纯化方法，属于蛋白纯化技术领域。
背景技术：
肿瘤的发生、发展和肿瘤细胞间或肿瘤细胞与周围基质细胞间的生物信号传导异常密切相关，其中相关信号通路之一即Hedgehog通路，相关的靶向药物研究也是分子肿瘤学的热点。MIM(Missinginmetastasis，也称MTSS1或BEG4)蛋白是Hedgehog通路的重要响应蛋白，能够促进Gli蛋白转录功能，并调控cillia发生。蛋白-脂质双分子膜相互作用是当前脂质体调控和载药研究的前沿。MIMI-BAR能够通过捆扎F-actin而使膜形成丝状伪足结构。与BAR结构相比，MIMI-BAR的功能则倾向于使膜形成突起而不是形成膜内陷。除了能够与细胞发生相互作用，MIMI-BAR还能结合人造磷脂双分子膜，尤其是富含PI(4,5)P2的磷脂囊泡，并能显著影响其形态，使膜表面形成直径在100nm以内的微的管状网络结构，此时蛋白与管状结构的内侧紧密结合，使磷脂双分子膜凸向囊泡内部。包括与膜结构结合的能力在内，MIMI-BAR的蛋白功能大多都依赖于其自发的二聚化作用。近年来，因MIM蛋白与肿瘤迁移密切相关，而逐渐成为研究热点，对于研究型的蛋白需求扩大，质量上要求却更加严格。MIM-I-BAR在大肠杆菌中主要以包涵体的形式存在，而包涵体的提纯较为复杂。目前，现有技术中尚无针对MIM-I-BAR蛋白的纯化方法。而且，现有技术中包涵体的提纯较为复杂，且纯化效果差。
技术实现要素：
发明目的：为了解决上述技术问题，本发明公开了一种MIM-I-BAR蛋白提取纯化方法，为MIM-I-BAR蛋白的生物功能研究提供高纯度的研究材料。技术方案：为了实现上述发明目的，本发明提供了一种MIM-I-BAR蛋白提取纯化方法，包括以下步骤：(1)选择能够表达MIM-I-BAR蛋白的表达菌进行培养，促使MIM-I-BAR蛋白表达，收集菌体；(2)取上述菌体，用细胞裂解液重悬细胞，-80℃冷冻；(3)解冻，超声破碎，离心取上清，过滤；(4)先平衡层析柱，然后将步骤(3)所得样品上样，洗去杂蛋白，再洗脱目的蛋白，收集蛋白流穿液；(5)平衡脱盐柱，加入步骤(4)所得样品，丢弃流穿液，加入洗脱缓冲液，收集流穿液。(6)将收集的蛋白流穿液超滤离心，去除流穿液，加入PBS离心，得下层沉淀，即为所述MIM-I-BAR蛋白。作为优选，步骤(1)中所述表达菌为BL21(DE3)大肠杆菌，将人工构建的质粒转入表达菌中，促使其表达MIM-I-BAR蛋白。作为另一种优选，步骤(2)中所述细胞裂解液为包含：pH7-8磷酸钠缓冲液，NaCl，咪唑，PMSF，溶菌酶以及蛋白酶抑制剂；-80℃冷冻时间为12-24h。作为另一种优选，步骤(2)中所述细胞裂解液为包含：20mMpH7-8磷酸钠缓冲液，500mMNaCl，5-15mM咪唑，1mMPMSF，0.1-0.5mg/ml溶菌酶，蛋白酶抑制剂按常规用量添加。作为另一种优选，步骤(3)中所述超声破碎条件为：冰浴，功率100-200W，工作3s、间歇2s，全程时间5min；离心条件为：7500-10000r，40min-1h。作为另一种优选，步骤(4)中所述层析柱为Ni2+-NTA亲和层析柱；平衡层析柱用缓冲液A：20mMpH7-8磷酸钠缓冲液，500mMNaCl，5-15mM咪唑；洗去杂蛋白用缓冲液B：20mMpH7-8磷酸钠缓冲液，500mMNaCl，80-100mM咪唑。洗脱目的蛋白用的缓冲液为两种缓冲液，使用顺序依次为缓冲液C1：20mMpH7-8磷酸钠缓冲液，500mMNaCl，110-130mM咪唑；以及缓冲液C2：20mMpH7-8磷酸钠缓冲液，500mMNaCl，140-160mM咪唑。作为进一步优选，所述的缓冲液加入体积为5-10倍柱体积。作为另一种优选，步骤(5)中所述脱盐柱型号为PD-10；平衡脱盐柱用二次超纯水(ddH2O)；洗脱缓冲液为PBS缓冲液(1×)。二次超纯水加入体积约为25ml，一次上样最多2.5ml(若不足2.5ml，用ddH2O补足)，然后用3.5mlPBS洗脱。作为另一种优选，步骤(6)中所述超滤条件：离心速度为3500-5000r，离心30min-1h；超滤管大小为10Kd。作为另一种优选，步骤(6)中所得纯化后的MIM-I-BAR蛋白纯度为85％-93％。技术效果：相对于现有技术，本发明方法简单，并且能够增加蛋白在裂解液中的溶解量，从而避免了包涵体的提取过程；同时大大提高了蛋白的纯化效果。附图说明图1：为改变细胞裂解条件下纯化蛋白SDS-PAGE图：泳道1：PMSF处理后，纯化前；泳道2：本发明细胞裂解液处理后，纯化前；泳道3：PMSF，-80℃处理后，纯化前；泳道4：本发明细胞裂解液，-80℃处理后，纯化前；泳道5：PMSF处理后，纯化后；泳道6：本发明细胞裂解液处理后，纯化后；泳道7：PMSF，-80℃处理后，纯化后；泳道8：本发明细胞裂解液，-80℃处理后，纯化后。图2：为超滤前后电泳图，泳道1为超滤前，泳道2为超滤后。具体实施方式下面结合附图进一步描述本发明的技术解决方案。下文中所述质粒是由以下方法构建：1、载体为pET-14b载体(一种现有技术中常用的大肠杆菌表达载体)2、基因序列如序列表SEQIDNO:1中所示3、引物如下：4、DNA克隆在DH5α细胞中进行实施例1：(1)MIM-I-BAR蛋白的表达将构建好的质粒转入表达菌BL21(DE3)，蛋白表达测试验证有目标蛋白表达后，进行MIM-I-BAR蛋白的大规模表达。氨苄青霉素抗性LB平板筛选阳性克隆，挑取单克隆于含有氨苄青霉素(100μg/ml)的3mlLB培养基中，37℃摇床(200r)培养8h，将培养后菌液加入到150ml含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃摇床(200r)培养3h至OD600达到0.6-0.8，加入IPTG至终浓度为0.4mmol/L，37℃摇床诱导培养3h，离心收集菌体。(2)用细胞裂解液(LysisBuffer)处理菌体取上述菌体，加入到LB培养基中，离心收集菌体后，用用5ml本发明细胞裂解液(20mMpH7.5磷酸钠缓冲液，500mMNaCl，10mM咪唑，1mMPMSF，0.2mg/ml溶菌酶，蛋白酶抑制剂常规用量)重悬细胞，放入-80℃冷藏12h过夜；(3)解冻，冰浴条件下超声粉碎细菌，条件为：工作3s，间歇2s，全程时间5min，功率150W；超声后的裂解液7800r/min，离心40min，取上清；上清用0.22μm滤头过滤。(4)进行Ni2+-NTA亲和纯化，用10ml缓冲液A(20mMpH7.5磷酸钠缓冲液，500mMNaCl，10mM咪唑)平衡柱床，然后将步骤(3)所得样品上载到Ni柱上，用缓冲液B(20mMpH7.5磷酸钠缓冲液，500mMNaCl，97mM咪唑)洗去杂蛋白，丢弃流穿液。依次用缓冲液C1(20mMpH7.5磷酸钠缓冲液，500mMNaCl，126mM咪唑)以及缓冲液C2(20mMpH7.5磷酸钠缓冲液，500mMNaCl，155mM咪唑)洗脱目的蛋白，收集流穿液。将原液和梯度洗脱后的流穿液收集取样进行SDS-PAGE分析。(5)用25mlddH2O平衡脱盐柱，加入2.5ml步骤(4)所得样品(不足2.5ml用ddH2O补满)，丢弃流穿液。加入3.5ml1×PBS缓冲液进行洗脱，收集流穿液。重复后两步直至样品全部脱盐结束。(6)收集蛋白流穿液，加入10kD的超滤管中，3500r超滤40min，去除流穿液。加入1×PBS缓冲液至超滤管刻度，继续超滤40min，此步骤重复三次。收集超滤管内的超滤液，放入程序降温盒中，-80℃保存。所得样品也进行SDS-PAGE分析。超滤前后样品的SDS-PAGE分析结果见附图2，从图中可得，经过超滤后蛋白的浓度显著提高。实施例2：(1)MIM-I-BAR蛋白的表达将构建好的质粒转入表达菌BL21(DE3)，蛋白表达测试验证有目标蛋白表达后，进行MIM-I-BAR蛋白的大规模表达。氨苄青霉素抗性LB平板筛选阳性克隆，挑取单克隆于含有氨苄青霉素(100μg/ml)的3mlLB培养基中，37℃摇床(200r)培养8h，将培养后菌液加入到150ml含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃摇床(200r)培养3h至OD600达到0.6-0.8，加入IPTG至终浓度为0.4mmol/L，37℃摇床诱导培养3h，离心收集菌体。(2)用细胞裂解液(LysisBuffer)处理菌体取上述菌体，加入到LB培养基中，离心收集菌体后，用用5ml本发明细胞裂解液(20mMpH7磷酸钠缓冲液，500mMNaCl，5mM咪唑，1mMPMSF，0.1mg/ml溶菌酶，蛋白酶抑制剂按常规用量添加)重悬细胞，放入-80℃冷藏18h；(3)解冻，冰浴条件下超声粉碎细菌，条件为：冰浴，功率100W，工作3s、间歇2s，全程时间5min；超声后的裂解液7500r，50min，取上清；上清用0.22μm滤头过滤。(4)进行Ni2+-NTA亲和纯化，用10ml缓冲液A(20mMpH7磷酸钠缓冲液，500mMNaCl，10mM咪唑)平衡柱床，然后将步骤(3)所得样品上载到Ni柱上，用缓冲液B(20mMpH7磷酸钠缓冲液，500mMNaCl，90mM咪唑)洗去杂蛋白，丢弃流穿液。依次用缓冲液C1(20mMpH7磷酸钠缓冲液，500mMNaCl，130mM咪唑)以及缓冲液C2(20mMpH7磷酸钠缓冲液，500mMNaCl，140mM咪唑)洗脱目的蛋白，收集流穿液。将原液和梯度洗脱后的流穿液收集取样进行SDS-PAGE分析。(5)用25mlddH2O平衡脱盐柱，加入2.5ml步骤(4)所得样品(不足2.5ml用ddH2O补满)，丢弃流穿液。加入3.5ml1×PBS缓冲液进行洗脱，收集流穿液。重复后两步直至样品全部脱盐结束。(6)收集蛋白流穿液，加入10kD的超滤管中，5000r超滤30min，去除流穿液。加入1×PBS缓冲液至超滤管刻度，继续超滤30min，此步骤重复三次。收集超滤管内的超滤液，放入程序降温盒中，-80℃保存。所得样品也进行SDS-PAGE分析。实施例3：(1)MIM-I-BAR蛋白的表达将构建好的质粒转入表达菌BL21(DE3)，蛋白表达测试验证有目标蛋白表达后，进行MIM-I-BAR蛋白的大规模表达。氨苄青霉素抗性LB平板筛选阳性克隆，挑取单克隆于含有氨苄青霉素(100μg/ml)的3mlLB培养基中，37℃摇床(200r)培养8h，将培养后菌液加入到150ml含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃摇床(200r)培养3h至OD600达到0.6-0.8，加入IPTG至终浓度为0.4mmol/L，37℃摇床诱导培养3h，离心收集菌体。(2)用细胞裂解液(LysisBuffer)处理菌体取上述菌体，加入到LB培养基中，离心收集菌体后，用用5ml本发明细胞裂解液(20mMpH8磷酸钠缓冲液，500mMNaCl，15mM咪唑，1mMPMSF，0.5mg/ml溶菌酶，蛋白酶抑制剂按常规用量添加)重悬细胞，放入-80℃冷藏24h；(3)解冻，冰浴条件下超声粉碎细菌，条件为：冰浴，功率200W，工作3s、间歇2s，全程时间5min；超声后的裂解液10000r，1h，取上清；上清用0.22μm滤头过滤。(4)进行Ni2+-NTA亲和纯化，用10ml缓冲液A(20mMpH8磷酸钠缓冲液，500mMNaCl，5mM咪唑)平衡柱床，然后将步骤(3)所得样品上载到Ni柱上，用缓冲液B(20mMpH8磷酸钠缓冲液，500mMNaCl，100mM咪唑)洗去杂蛋白，丢弃流穿液。依次用缓冲液C1(20mMpH8磷酸钠缓冲液，500mMNaCl，110mM咪唑)以及缓冲液C2(20mMpH8磷酸钠缓冲液，500mMNaCl，160mM咪唑)洗脱目的蛋白，收集流穿液。将原液和梯度洗脱后的流穿液收集取样进行SDS-PAGE分析。(5)用25mlddH2O平衡脱盐柱，加入2.5ml步骤(4)所得样品(不足2.5ml用ddH2O补满)，丢弃流穿液。加入3.5ml1×PBS缓冲液进行洗脱，收集流穿液。重复后两步直至样品全部脱盐结束。(6)收集蛋白流穿液，加入10kD的超滤管中，3500r超滤1h，去除流穿液。加入1×PBS缓冲液至超滤管刻度，继续超滤1h，此步骤重复三次。收集超滤管内的超滤液，放入程序降温盒中，-80℃保存。所得样品也进行SDS-PAGE分析。实施例4：本发明所用细胞裂解液效果验证按照实施例1步骤(1)方法收集菌体，将所收集菌体加入到四份LB培养基中，离心收集菌体后分为A、B、C、D四组。A、C组用5mlPMSF(苯甲基磺酰氟)缓冲液(20mMpH7.5磷酸钠缓冲液，500mMNaCl，10mM咪唑，1mMPMSF)重悬细胞，B、D组用5ml本发明细胞裂解液(20mMpH7.5磷酸钠缓冲液，500mMNaCl，10mM咪唑，1mMPMSF，0.2mg/ml溶菌酶，蛋白酶抑制剂)重悬细胞。其中C、D两组放入-80℃冷藏12h过夜。四组菌体处理后进行超声破菌。冰浴条件下超声粉碎细菌条件：工作3s，间歇2s，全程时间5min，功率150W。超声后的裂解液7800r，离心40min，取上清。然后其他所有步骤方法均与实施例(1)相同，进行Ni2+-NTA亲和纯化，将纯化前后液体取样进行吸光度值测量和SDS-PAGE分析。结果见附图1。由附图1结果可得，利用本发明细胞裂解液，并且配合-80℃冷藏，纯化后的泳道痕迹明显比其他泳道更深，提取蛋白的量显著更高。