2‑(R2‑硫代)‑10‑[3‑(4‑R1‑哌嗪‑1‑基)丙基]‑10H‑吩噻嗪用于治疗β‑淀粉样病或α‑共核蛋白病以及诊断或前诊断它们的方法与流程

蛋白或蛋白片段(肽)在脑中的累积是年龄相关的神经退行性疾病的重要特征。阿尔茨海默痴呆(阿尔茨海默病，AD)和β-脑淀粉样血管病(CAA)是β-淀粉样肽(Aβ)累积所引发的疾病，尚不清楚它们可能的机制。Aβ-蛋白内稳态，即通过受体或蛋白酶生产和降解/转运的平衡，在AD和CAA中受到干扰。然而目前为止，对于通过细胞转运蛋白(ABC转运蛋白)除去Aβ-肽的关注很少。在帕金森病(帕金森氏症)中累积α-共核蛋白(α-synuclein)，所述α-共核蛋白特别调控在黑质中的多巴胺释放。在α-共核蛋白病帕金森氏症中，已知ABC-转运蛋白在转运中起到至关重要的作用(Kortekaaset al.,Ann Neurol 2005,57,176-179)。在此，存在若干亚家族A-G，能够转运互相不同的底物(代谢物、药物、肽、蛋白、离子)并且甚至能够在转运功能上互相替代(例如ABCB1和ABCC1，Tao et al.Cancer Chemotherapy and Pharmacology,64,5,961-969)。

利用各种遗传改造的小鼠模型，发现ACB-转运蛋白(ABC转运蛋白的共同结构元件是ATP-结合盒和转运子)ABCC1，一种重要的蛋白/肽转运蛋白，特别是Aβ转运蛋白，在影响脑蛋白积累上有杰出的功能。ABCC1也是重要的α-共核蛋白转运蛋白。

下文，以Aβ-转运蛋白为实例来描述转运蛋白活性。

为了测定体内ABCC1活性，使用遗传上缺失ABCB1-、ABCG2-或ABCC1-转运蛋白的转基因小鼠(敲除小鼠)测定APP表达。

发现：

i)在缺失ABCC1转运蛋白的小鼠中，Aβ的量增加了12倍，

ii)ABCB1转运蛋白的缺失导致只增加了3倍，以及

iii)ABCG2的缺失没有Aβ累积效应。

因此，本发明的目的在于提供以适当的方式影响ABCC1转运蛋白以治疗神经退行性疾病，特别是β-淀粉样病(β-amyloidopathie)或α-共核蛋白病(α-synucleinopathie)的物质。这一目的是通过权利要求1的2-(R²-硫代)-10-[3-(4-R¹-哌嗪-1-基)丙基]-10H-吩噻嗪来实现的。进一步优选的实施方式将由从属权利要求中显见。

换言之，该目的是通过通式1的2-(R²-硫代)-10-[3-(4-R¹-哌嗪-1-基)丙基]-10H-吩噻嗪来实现的。

其中，基团

R¹和R²相同或不同并且各自彼此独立地为C₁-C₆烷基基团，彼此独立地任选地包括一个另外的取代基，所述取代基选自烷基、芳基、酰基(优选乙酰基)、氨基、硝基、磺酰基、羟基、烷氧基、芳氧基、芳硫基、烷硫基和卤素原子，其中各个烷基任选地包括至少一个另外的卤素原子，和

其余的R³位于吩噻嗪环体系的6-9位任一，为氢原子或烷基、芳基、酰基(优选乙酰基)、氨基、硝基、磺酰基、羟基、烷氧基、芳氧基、芳硫基、或烷硫基或卤素原子，其中各烷基任选地包括至少一个另外的卤素原子，或NR⁴R⁵-，或OR⁶-基团，其中R⁴、R⁵和R⁶相同或不同，并且各自彼此独立地选自氢和C₁-C₃烷基，和

其余的R⁷位于吩噻嗪环体系的1、2或4位任一，为氢原子或烷基、芳基、酰基(优选乙酰基)、氨基、硝基、磺酰基、羟基、烷氧基、芳氧基、芳硫基、或烷硫基或卤素原子，其中各烷基任选地包括至少一个另外的卤素原子，或NR⁸R⁹-，或OR¹⁰-基团，其中R⁸、R⁹和R¹⁰相同或不同，并且各自彼此独立地选自氢和C₁-C₃烷基，

用于治疗伴有脑蛋白沉积的β-淀粉样病或α-共核蛋白病。

此外，需要用于检测或诊断或前诊断α-共核蛋白病以及β-淀粉样病的方法。

本发明的目的是提供一种可以诊断或前诊断α-共核蛋白病以及β-淀粉样病的方法。这一目的通过根据权利要求11的方法实现。优选的实施方式将通过从属权利要求变得显而易见。换言之，本发明的目的是开发一种诊断或前诊断β-淀粉样病或α-共核蛋白病或者测定受试者患有此种疾病的风险的方法，其中所述受试者接受了通过脑ABCC1-转运蛋白转运的物质，所述方法由下述步骤组成：

a)测定受试者体液样品中至给定的时间点所接受的物质的量；

b)重复步骤a)的测定至至少一个另外的之后的时间点；

c)将步骤a)和b)中测定的量与在取样时未显示出β-淀粉样病或α-共核蛋白病的临床症状的受试者至相同时间点所限定的特征量进行比较。

受试者已经具有影响ABCC1-转运蛋白的至少一种物质意味着必须给予这一物质。甚至，例如，由于另一疾病的药物治疗，这一物质已经存在于受试者的身体中。将被检查的受试者的体液样品优选血清、血浆和/或神经液的样品。β-淀粉样病优选阿尔茨海默病，α-共核蛋白病优选帕金森病。任选地，α-共核蛋白病是路易体痴呆(DLB)。通过脑ABCC1-转运蛋白转运的物质，优选选自抗生素(如，二氟沙星，格雷沙星)、抗病毒剂/抗病毒药(如，沙奎那韦，利托那韦)、抗过敏药/抗组胺药(如，甲氰咪胍)、心血管药物(如，维拉帕米)、抗抑郁药(如，西酞普兰)、抗高尿酸血症药(如，丙磺舒)、细胞毒性药(如，甲氨蝶呤，依托泊苷，依达曲沙，ZD1694)、维生素/维生素类似物(例如，甲氨蝶呤，叶酸，L-甲酰四氢叶酸)、消炎药(如，吲哚美辛)、抗癫痫药(如，丙戊酸)、激素/激素衍生物(如，17β-雌二醇)、白三烯(如，LTC4)、荧光样品(如，钙黄绿素，Fluo-3，BCECF，SNARF)、天然物质的(内源性产生的)GSH-、硫酸盐-或葡糖苷酸偶联的代谢物、毒素或药物(如，2,4-二硝基苯基-SG，Bimane-SG，N-乙马来酰亚胺-SG，阿霉素-SG，噻替派-SG，环磷酰胺-SG，马法兰-SG，苯丁酸氮芥-SG，依他尼酸-SG，异丙甲草胺-SG，阿特拉津-SG，萝卜硫素-SG，黄曲霉毒素B1-环氧化物-SG，4-硝基喹啉1-氧化物-SG，As(SG)3，依托泊苷-Gluc，4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇(NNAL)-3β-O-Gluc，SN-38-gluc，4-甲基伞形酮基-β-d-gluc，6-羟基-5,7-二甲基-2-甲氨基-4-(3-吡啶甲基)-benzothiazolsulfat(E3040S)-Gluc，白三烯C4，前列腺素A2-SG，15-脱氧-A12,14-前列腺素J2-SG，羟基壬烯酸-SG，17β-雌二醇-17-β-d-gluc，葡萄糖醛酸基胆红素，二葡萄糖醛酸基胆红素(Bis-lucuronosylbilirubin)，猪去氧胆酸酯(Hyodeoxycholate)-6-α-Gluc，雌素酮-3-硫酸盐，脱氢表雄酮-硫酸盐，石胆酸硫酸盐(Sulfatolithocholat))(也参见Deeley RG et al.Substrate recognition and transport by multi drug resistance protein 1(ABCC1),FEBS letters 2006,580(4),pp.1103-1111)。

这一对ABCC1-转运蛋白的转运活性的间接分析可以用于诊断/前诊断相应的疾病。在已经通过其他途径自身摄取了ABCC1可转运的物质的受试者中，检查体液，例如血浆、血清和/或神经液中的药物浓度谱。对受试者的时间依赖性测量表明，相比于健康受试者，ABCC1-转运蛋白的减少，物质浓度曲线(浓度c对时间t)存在延迟或停止，即发生曲线最大值的时间改变。

当曲线相对于健康情形偏移时，表明ABCC1转运活性的改变。这意味着诸如Aβ或α-共核蛋白的物质转运更差并且因此指示相应的疾病。

两种小鼠模型都显示，ABCC1的药物调控表明它是重要的细胞跨膜转运蛋白用于Aβ蛋白，并且表明血脑屏障和脉络丛对于从脑中消除Aβ的重要的作用。已经发现，ABCC1-转运蛋白的选择性的药物活化将显著降低脑负载的Aβ并且对于患有脑蛋白内稳态受损的疾病的治疗是治疗上有用的。此外，如上所述对于ABCC1-转运蛋白的转运活性分析可以用于直接或间接诊断/前诊断上述相应的疾病。通过给予经ABCC1-转运蛋白转运的物质，能够进行直接分析及其测定。上面已经解释了间接分析。

与ABC-转运蛋白相关的输送机制的改变可实质上影响Aβ和其他脑蛋白的时间上的累积谱。结果，ABCC1-转运蛋白的功能影响患上神经退行性疾病，尤其是阿尔茨海默病的风险。在此意义下，神经退行性疾病的治疗指现有疾病的预防和治疗。

首先以使得显示出ABCC1能够转运Aβ的方式来研究ABC-转运蛋白在Aβ分泌中的作用。为此，使用来自原代培养的小鼠大脑毛细血管内皮的内皮细胞(细胞培养物制备)，体外进行Transwell-Assay(内皮细胞通透迁移室检测，ECTA)。

使用来自ABCB1-缺陷型、ABCC1-缺陷型(敲除)小鼠和来自对照小鼠(C57BI/6，FVB/N)的脑毛细血管的内皮细胞的原代培养物，调查Aβ-特异的转运活性。在ABCB1-缺陷型、ABCC1-缺陷型内皮细胞中，从近腔(脑)到血管内膜腔(血液)的Aβ转运受损。对于对照细胞，在给予Aβ-肽(Aβ42)后首个六小时期间，平均Aβ转运率为2.2pg/min。相比之下，ABCC1-缺陷型细胞只达到该负载能力的一半(1,0pg/min)。在ABCB1-缺陷型细胞中，几乎没有Aβ转运(0.3pg/min)。对于来自毛细血管内皮细胞和脉络丛的细胞进行进一步研究表明，ABCB1转运蛋白在大脑毛细血管内皮中高度表达，而内皮ABCC1-表达在脑毛细血管中很低。

基于新产生的ABC-转运蛋白缺陷型阿尔茨海默病小鼠模型，在体内调查ABC-转运蛋白家族成员的相对重要性。遗传修饰的小鼠各存在特异的ABC-转运蛋白ABCG2、ABCB1或ABCC1缺陷(敲除)。

脑切片的Aβ-免疫组化分析显示：

i)相比于对照小鼠，在ABCC1-缺陷型小鼠中，皮质Aβ-阳性斑块的数量和尺寸显著增加(参见图1和2a-c)。

ii)相比于ABCC1-缺陷型小鼠，ABCB1-缺陷型小鼠显示出Aβ-斑块的数量和尺寸的增加较小。

iii)在对照小鼠和ABCG2-缺陷型小鼠之间，没有观察到显著差异(图2a-c)。

为了测定缓冲液可溶性的Aβ(多数为小单体和寡聚体)和胍可溶的Aβ(主要是纤维化或聚集的材料)的量，使用酶联免疫吸附检测(ELISA)用于Aβ。

根据免疫组化分析的形态学结果，在所有所测的时间点，相比对照，ABCC1缺陷型小鼠显示出累积的Aβ的显著增加。Aβ的脑负载在25周龄时最大。此时，Aβ值(Aβ42)比对照小鼠高12倍。在ABCC1缺陷型组中，缓冲液可溶性Aβ也随着年龄增加，但在25周，在最高斑块负载后，可溶性Aβ的数值急剧下降。

进行进一步调查，以提供在需要时，缺乏ABCC1转运和Aβ积累之间的关联的进一步证据。

ABC转运蛋白的转运动力主要取决于特异的蛋白/肽特性。淀粉样蛋白前体蛋白的荷兰型变体(荷兰型变体APP_dt)的α-分泌酶分泌在APP附近引入另外的负电荷，因此影响Aβ跨血脑屏障的消除，导致脑淀粉样血管病(CAA)。对来自对照小鼠的脑毛细血管和脉络丛(CP)的Western印迹分析显示ABCB1在脑毛细血管内皮细胞(BC)中的强烈表达和ABCC1在CP中强烈表达(图3d)。由于ABC转运蛋白对于消除Aβ起重要作用，假设ABC转运蛋白缺陷型APP_dt-转基因小鼠具有增加的脑膜血管Aβ_dt累积(在血脑屏障和血脑屏障脉络丛)。在24月龄的ABC缺陷型APP_dt小鼠中量化CAA的程度。在ABCC1-缺陷型动物中，估测至少51％的血管受影响(>75％血管壁负载Aβ)，相比之下，对照为23％(图3c)。

根据这些结果，检查到通过药物介导的ABC-转运蛋白的活化可影响/降低脑中可溶性Aβ的量的程度。用止吐药硫乙哌丙嗪(Thiethylperazine,2-(乙硫基)-10-[3-(4-甲基哌嗪-1-基)丙基]-10H-吩噻嗪)处理具有淀粉样蛋白沉积的小鼠并孵育小鼠30天。每天3mg/kg体重肌内给予2次。小鼠老年斑块形成前，就要采用预防性的措施。对于被处理动物的ELISA测量显示相比于载体处理的动物(载体＝水)，在处理小鼠中，Aβ的量降低至少31％(图3e)。结果如图3所图示。

除去Aβ的能力证明是Aβ在脑中积累调节的主要因素。

已证明Thiethylperazin为高度有效的ABCC1-转运蛋白活化剂。从相同的基本结构出发得到的进一步的衍生物也在ABCC1-转运蛋白的活化方面显示出优良的结果。相应的衍生物如通式I所示

其中，基团

R¹和R²相同或不同并且各自彼此独立地为C₁-C₆烷基基团，彼此独立地任选地包括一个另外的取代基，所述取代基选自烷基、芳基、酰基(优选乙酰基)、氨基、硝基、磺酰基、羟基、烷氧基、芳氧基、芳硫基、烷硫基和卤素原子，其中所述烷基各任选地包括至少一个另外的卤素原子，和

R³位于吩噻嗪环体系的6-9位任一，优选位于6、7或8位，为氢原子或烷基、芳基、酰基(优选乙酰基)、氨基、硝基、磺酰基、羟基、烷氧基、芳氧基、芳硫基、或烷硫基或卤素原子，其中各个烷基任选地包括至少一个另外的卤素原子，或NR⁴R⁵-，或OR⁶-基团，其中R⁴、R⁵和R⁶相同或不同，并且各自彼此独立地选自氢和C₁-C₃烷基，和

R⁷位于吩噻嗪环体系的1、2或4位任一，优选位于2或4位，为氢原子或烷基、芳基、酰基(优选乙酰基)、氨基、硝基、磺酰基、羟基、烷氧基、芳氧基、芳硫基、或烷硫基或卤素原子，其中各烷基任选地包括至少一个另外的卤素原子，或NR⁸R⁹-，或OR¹⁰-基团，其中R⁸、R⁹和R¹⁰相同或不同，并且各自彼此独立地选自氢和C₁-C₃烷基。

这些衍生物因此适于治疗神经退行性疾病，特别是β-淀粉样病或α-共核蛋白病，如上所述，其中治疗包括对已有疾病的预防以及治疗。一个卤素原子/多个卤素优选选自氟和氯。R^1,2,3,7的(-(C＝O)-R)酰基基团优选乙酰基基团(-C(＝O)CH₃)。基团R¹和R²可以相同或不同，并且各自独立地为C₁-C₆烷基(优选C₁-烷基)或者被乙酰基取代的C₁-C₆烷基(优选C₁-烷基)，基团R³和R⁷是氢或乙酰基。在优选的实施方式中，基团R¹和R²相同或不同并且各自独立地为C₁-C₃烷基。此外，优选基团R³和R⁷是氢。特别优选的是，当R¹是甲基，R²是乙基并且基团R³和R⁷是氢时，是Thiethylperazin)。当用于治疗神经退行性疾病时，已证明向2-(R²-硫代)-10-[3-(4-R¹-哌嗪-1-基)丙基]-10H-吩噻嗪中添加其他活性成分，优选1-二苯甲基哌嗪，高度优选1-二苯甲基-4-肉桂基-哌嗪(Cinnarizin)是有益的。可以使用根据本发明的2-(R²-硫代)-10-[3-(4-R¹-哌嗪-1-基)丙基]-10H-吩噻嗪衍生物，通过上述间接分析来治疗或诊断各种神经退行性疾病。在特别优选的实施方式中，神经退行性疾病是β-淀粉样病，特别是阿尔茨海默病(AD)。另一个实施方式涉及神经退行性疾病是α-共核蛋白病，尤其是帕金森病(PD)的情形。两种情形，即β-淀粉样病和α-共核蛋白病的特征在于蛋白的脑沉积，所述疾病可以通过ABCC1-转运蛋白的活化来治疗或通过其活性来诊断。

另外，通过ABCC1-转运蛋白活化可治疗的或者通过ABCC1-转运蛋白活化可诊断的疾病也在下面提及。所以进一步地，可治疗的疾病是路易体痴呆(LBD)。它的特征也在于脑蛋白累积，即α-共核蛋白病如帕金森病。

另一个实施方式涉及神经退行性疾病是亨廷顿舞蹈症(HD)的情形。另一个实施方式涉及神经退行性疾病是朊病毒疾病，尤其是克雅氏疾病(CJD)或致死性家族性失眠症(FFI)的情形。另一个实施方式涉及神经退行性疾病是tau蛋白病，特别是皮质基底节变性(CBD)、Steel-Richardson-Olszewski综合症(PSP，进行性核上性麻痹)和皮克病(PiD)的情形。另一个实施方式涉及神经退行性疾病是额颞叶变性(FTLD)，特别是泛素阳性变性TDP43阳性变性或泛素TDP43阴性变性的情形。另一个实施方式涉及神经退行性疾病是肌萎缩侧索硬化(ALS)的情形。另一个实施方式涉及神经退行性疾病是脊髓小脑共济失调(SCA)或痉挛性轻截瘫(SPG)的情形。另一个实施方式涉及神经退行性疾病/神经免疫性疾病是多发性硬化症(MS)或MS-相关的症状，例如ADEM或Devic症状的情形。

附图说明

图1a示出在ABCC1-缺陷型小鼠(ABCC1ko)中，皮质神经斑块的密度增加75％；

图1b、c示出由于尺寸大于700μm²斑块量(+63％)，和小斑块(-24％)的较小频率，平均斑块大小增加(+34％)。误差棒，标准误(n≥3)；

图1d示出在ABCG2-缺陷型(ABCG2ko)，ABCB1-缺陷型(ABCB1ko)，ABCC1-缺陷型(ABCC1ko)小鼠和对照小鼠中的IHC染色，示出ABCC1-缺陷型动物的Aβ的较高表面密度。详细示出了相同尺寸的典型斑块，坐标尺表示为500μm(概况)和50μm(切取的部分)(*p<0.05)；

图2a是在特异的ABC-转运蛋白敲除小鼠中，皮质(覆盖)的斑块密度和大小。尤其是ABCC1-缺陷型(ABCC1ko)小鼠展现出增加的Aβ-淀粉样变性负载(浅灰色条，各在不同组中的最右侧)，x轴的w＝周；

图2b是在25周龄的ABCC1-缺陷型(ABCC1ko)和ABCB1-缺陷型(ABCB1ko)小鼠中，总斑块尺寸增加，x轴的w＝周；

图2c示出较小尺寸的斑块发生和更大尺寸的斑块(>700μm²)发生的总体增加是相关的，而中等尺寸的斑块数量保持相同值，误差棒，标准误(n≥5)，*P<0.05；

图3是ABCC1的缺陷促进Aβ和Aβ_dt的积累并且ABCC1的活化(通过给予Torecan)降低Aβ值；

图3a示出在25周龄的ABCC1缺陷型中，不溶性Aβ显著增加(～12倍)；和

图3b示出相比于22周龄(-56％)，在25周龄，缓冲液可溶的Aβ42的量显著降低。这可能是由于不溶性Aβ在沉淀物中的沉积。通过免疫组化测量，在相同的年龄，由Aβ沉积占据的表面积增加83％(误差棒，标准误n≥5，p<0.05)；

图3c示出53％的血管受到CAA的严重影响(>75％血管壁具有Aβ)。这涉及ABCC1-缺陷型小鼠(ABCC1ko)，相比之下，在对照中是23％(n＝3)；

图3d示出可以看出ABCC1主要在脉络丛(CP)中表达，而ABCB1主要在脑毛细血管(BP)中表达；

图3e示出通过Thiethylperazine(Torecan)的ABCC1的活化，降低小鼠中所获得的Aβ值(-28％)，误差棒，标准误(n＝4,*p<0.05)。

实例

动物

APP转基因小鼠(APP,APP_dt)购自The Jackson Laboratory(Bar Harbor，美国)和图宾根大学(Tübingen，德国)。NEP缺陷型小鼠购自Riken Brain Research Institute(Saitama，日本)。ABCG2-、ABCB1-和ABCC1-缺陷型小鼠购自Taconic-Farms(丹麦)。所有的转基因和基因敲除小鼠系都在FVB遗传背景下饲养至少9代。小鼠保持在23℃，12h/12h光/暗循环，食物和水供应不限。

方法

组织制备

对于组织制备，通过颈脱位处死小鼠并且用PBS(磷酸盐缓冲的生理盐水溶液)心脏灌注。移除脑并将一个脑半球存储在4％多聚甲醛缓冲液中用于石蜡包埋和免疫组化。另一脑半球在液氮中快速冷冻，并且存储在-80℃用于生化分析。

ELISA

使用Genetics Company(TGC,Schlieren，瑞士)的ELISA-Kits(TH40HS,TK42HS)进行Aβ的量化。使用PreCellys24(12s,6.500rpm)将脑半球均浆。添加碳酸盐缓冲液(pH 8.0)后，使用PreCellys(5s,5000rpm)将脑组织匀浆进行混合并且在4℃以24.000g离心90min以将不溶物与可溶性Aβ物质分离。将剩余的上清液(缓冲液可溶部分)用8M盐酸胍以1：1.6比例混合进行处理。对于聚集的Aβ-物质的提取，将沉淀溶解在8倍体积的5M盐酸胍中，室温振荡3小时并在4℃以24,000g离心20min。剩余的上清液为盐酸胍成分(GuaHCl)。使用Nanodrop1000分光光度计(Thermo Fisher Scientific,Wilmington，美国)，以三个重复来测量所有样品的蛋白含量。ELISA试验要根据制造商的说明书来进行适当的稀释。

Western印迹

制备组织匀浆用于Westernblot试验。使用BCA-Assays(Pierce,Thermo Fisher Scientific,Rockford,USA)来测定提取物的总蛋白浓度。每个泳道上样10μg总蛋白进行电泳后，将蛋白点印到PVDF膜上。在室温下，用含有5％干乳的TBST缓冲液(50mMTris，pH 7.4，150mMNaCI，0.1％Tween20)在室温下封闭1小时，在4℃过夜检测ABCB1(1:500，D-11，Santa Cruz)、ABCC1(1:200，Alexis Bio)或β-Actin(1:20,000，Sigma)几种蛋白。作为检测抗体，使用抗小鼠-HRP，抗大鼠HRP或抗兔HRP。并用Amersham ECL Plus检测试剂盒以及RoperCoolSnap HQ²照相机进行显影。

免疫组化分析(IHC)

将用福尔马林固定的脑包埋在石蜡中并切成厚度4μm的切片。切片在去除石蜡后用BondMax^TM Autostainer(Menarini/Leica，德国)进行后续染色。通过在95％甲酸(用于抗体6F3D,Dako，德国)和70％甲酸(用于抗体4G8,Millipore，德国)中5min阻断内源性过氧化酶(5min)并进行抗原决定簇回复后再开始免疫染色。在室温下，以下述稀释：6F3D(1:100)，4G8(1:500)将一抗孵育30min。根据标准方法DAB R30，利用BondMax^TM Bond Polymer Refine检测试剂盒来检测一抗。在230nm分辨率下，使用MiraxDesk/MiraxMidi扫描仪对染色后切片进行完全数字化扫描，然后使用AxioVision软件包(Zeiss，德国)进行自动分析。

CAA严重性的评估

对APP_dt小鼠模型的脑切片用4G8抗体染色。以盲实验的方式检测至少两个不连续的切片的CAA脑膜血管。人工计数所有脑膜血管，并将CAA严重性按下面分类：

分类I：未影响

分类II：≤25％外周阳性染色

分类III：≤50％外周阳性染色

分类IV：≤75％外周阳性染色

分类V：≤100％外周阳性染色

所有类中的平均血管数是相对于被发现的血管的总数来计算。

内皮细胞-Transwell检测(ECTA)

按Coisne等人所述来制备鼠脑毛细血管内皮细胞(Coisne,C.,et al.Mouse syngenic in vitro blood-brain barrier model:a new tool to examine inflammatory events in cerebral endothelium.Laboratory Investigation,85,734-746(2005))。将至少10只3-4周龄的小鼠斩首并移除脑。在将脑干,白质和脑皮质解剖后，将组织放在两倍体积的洗涤缓冲液B(WBB)(Hanks bufferedsaltsolution(HBSS)，10mM HEPES，0.1％BSA)中在15ml的Glassdouncers(Wheaton Industries,Millville,NJ,USA)中匀浆。向均浆中添加一体积30％的葡聚糖。以3,000g在4℃离心两次。将含有血管的沉淀在WBB中重悬并且通过用力吹打溶液来分离大血管。使用60μm膜真空过滤以将大血管与毛细血管分离。在用胶原蛋白酶/分散酶(HBSS，10mM HEPES，0.15g/ml TCLK，10μg/ml DNAse-l，1mg/ml胶原蛋白酶/分散酶(Roche)联合处理后，进一步通过用力吹打溶液获得单细胞悬液。将内皮细胞以每孔120,000细胞的密度引入到涂有Matrigel的Transwellinserts(0.4μm Poren,Greiner Bio-One，德国)中，并放到有胶质细胞培养物的条件下进行生长。

在测试期间，使用硫磺来测定细胞旁流。用含有10ng的Aβ42(1.6nM终浓度)的溶液来更换近腔室处的培养基。随后，在2h、6h和24h从腔室中取样并通过ELISA来测定Aβ含量(TK42-highsense,TGC，瑞士)。转运率的确定如Coisne等人在(文章)中的描述(Coisne,C.et al.Mouse syngenic in vitro blood-brain barrier model:a new tool to examine inflammatory events in cerebral endothelium.Laboratory Investigation,85,734-746(2005))。

ELISA统计

将Lilliefors-godness-of-fit-Test(α＝0.05)应用于ELISA数据和对数转换的ELISA数据以区分正常分布的样品数据估测值和对数正态分布样品数据的估测值。尽管样品量小，但是对两组数据设定，在44个样品中有5个都不符合无效假设(H₀)。根据主要的正偏离(偏移)的观察以及严格的阳性样品数据，正常分布的数据的估测值被放弃。对可能的对数正态分布的估测值计算平均值和置信区间。使用Wilcoxon-Rank-sum-Test来比较每个时间点处不同小鼠品系的ELISA数据。