一种从L‑鸟氨酸发酵液中提取L‑鸟氨酸盐酸盐的方法与流程

本发明属于生物化工领域，具体涉及一种从L-鸟氨酸发酵液中提取L-鸟氨酸盐酸盐的方法。

背景技术：

L-鸟氨酸是人体代谢中必不可少的中间代谢产物，是一种碱性氨基酸。L-鸟氨酸是活细胞中重要的代谢化合物，是细菌细胞膜和多肽类抗生素的组成成分，但并不参与蛋白质的合成，而是以游离态存在。它主要参与生物体内的尿素循环，用于生物体内瓜氨酸、精氨酸、脯氨酸、多胺的生物合成，对于体内氨态氮的排出有重要作用。其多功能保健作用使得近年L-鸟氨酸产品的开发逐渐升温，在医药、保健领域及化学工业的应用也日益广泛，前景看好。

L-鸟氨酸的生产方法主要包括有机合成法、精氨酸酶解法和微生物直接发酵法，其中有机合成法存在污染严重、副产物多、提纯难度大等缺陷，已逐步淘汰。酶解法利用L-精氨酸酶水解L-精氨酸，得到产物L-鸟氨酸和尿素，该法专一性强，L-精氨酸酶易于获得，反应条件温和，但是直接采用L-精氨酸原料，导致生产成本居高不下。微生物直接发酵法是获取L-鸟氨酸的重要来源，相比其他方法，发酵法的原料成本较低、产量较高、同时，通过基因工程方法对菌种进行定向改造，从源头上提高了L-鸟氨酸的产量，目前用于产生L-鸟氨酸的菌种主要为谷氨酸棒杆菌的精氨酸缺陷型菌株。但是微生物在代谢产生的L-鸟氨酸发酵液中包含部分杂质氨基酸、糖、蛋白质、色素、无机盐等杂质成分，给分离提纯L-鸟氨酸带来了一定的困难。由于L-鸟氨酸水溶性极高，因此一般将其转化为溶解度较小的L-鸟氨酸盐酸盐作为产品，现有的L-鸟氨酸盐酸盐提取方法主要针对杂质较少的酶解法生产体系。针对的发酵液体系的L-鸟氨酸盐酸盐的提取方法也有报道，一般需要经过微滤除菌体、离子交换除杂、脱色、浓缩结晶等几个步骤，其中脱色过程一般使用粉末活性炭在偏酸性条件下进行间歇式脱色，处理周期长，活性炭用量大且不能重复利用，导致提取成本大大增加。也有采用纳滤膜脱色的报道，但是纳滤膜对L-鸟氨酸具有较强的截留能力，需要采用渗滤操作方可提高收率，导致产品被稀释，增加了后期浓缩能耗。由此可见开发一种工艺简单能进行连续化操作且成本较低的L-鸟氨酸盐酸盐提取方法将促进微生物直接发酵法制备L-鸟氨酸技术用于规模化生产。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种从L-鸟氨酸发酵液中提取L-鸟氨酸盐酸盐的方法，以解决现有技术存在的处理周期长和成本较高等问题。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种从L-鸟氨酸发酵液中提取L-鸟氨酸盐酸盐的方法，它包括如下步骤：

(1)将L-鸟氨酸发酵液调节pH至6.0～6.5后进行微滤处理，除去其中的菌体细胞和颗粒物，收集微滤液；

(2)将步骤(1)中所得的微滤液进行超滤处理，除去其中的杂蛋白和部分色素，收集超滤透过液；

(3)将步骤(2)中所得的超滤透过液加热至60～70℃后，以3～6BV/h的流速泵入活性炭层析柱进行脱色；在430nm下，以纯水为参比，检测层析柱流出液的透射比，当流出液的透光率低于97％时，停止上柱脱色，收集脱色液；

(4)将步骤(3)中所得的脱色液调节pH后，采用阳离子交换树脂层析柱进行吸附，收集完成吸附的离子交换柱进行洗脱处理，所得洗脱液经减压浓缩蒸氨，得到浓缩液；

(5)将步骤(4)中所得浓缩液降至室温，加入30～36wt％的盐酸水溶液进行酸化反应后，代替步骤(2)中所得的超滤液，重复步骤(3)中操作，收集得到二次脱色液；

(6)向步骤(5)中所得的二次脱色液中加入乙醇进行L-鸟氨酸盐酸盐结晶；乙醇加入完毕后，养晶4～6h，过滤并真空干燥后，即得L-鸟氨酸盐酸盐晶体。

其中，BV是指相对应的单柱所填充的吸附剂床层体积。

步骤(1)中，所述的L-鸟氨酸发酵液中，L-鸟氨酸的浓度为30～50g/L，色素的含量在430nm下，以纯水为参比，透射比为15～30％。

步骤(1)中，调节pH所用试剂为30～36wt％的盐酸。

步骤(1)中，所述的微滤处理是采用孔径为0.2～0.5微米的管式陶瓷膜进行微滤，操作温度为20～40℃，操作压力0.05～0.3Mpa。

步骤(2)中，所述的超滤处理是采用截留分子量为5000道尔顿的卷式有机膜进行超滤，操作温度为20～40℃，操作压力0.2～0.4Mpa。

步骤(3)中，所述的活性炭层析柱为玻璃或不锈钢柱，外带夹套可通入热水进行保温，柱内活性炭床层的高径比为8～12：1，优选10：1；其中，所述的活性炭为果壳基颗粒活性炭，颗粒粒径为30～70目。

步骤(3)中，超滤液以3～6BV/h的流速泵入活性炭层析柱进行脱色，且脱色过程中保持温度为60～70℃。

步骤(3)中，停止上柱脱色并收集脱色液后，可用3BV体积的60℃去离子水以3～5BV/h的流速冲洗活性炭层析柱，收集前段流出的1BV体积的流出液，并与后批次的L-鸟氨酸发酵液合并，继续用于脱色；将完成脱色的活性炭层析柱进行再生，用于下一次脱色。

其中，柱层析的再生方法为：用60℃的0.5mol/L NaOH溶液作为再生剂，以2BV/h的流速冲洗层析柱，NaOH溶液用量为3BV；再用60℃的去离子水以4BV/h的流速冲洗层析柱，直至流出液的pH值为7.0。

步骤(4)中，所述的阳离子交换树脂层析柱为玻璃或不锈钢柱，外带夹套可通入热水进行保温，柱内阳离子交换树脂床层的高径比为4～8：1，优选6：1；其中，所述的阳离子交换树脂为NH₄⁺型JK006型阳离子交换树脂。

步骤(4)中，进行吸附的具体操作方法为：将3支相同的阳离子交换树脂层析柱串联，从第1柱进脱色液，由第3柱排出废液，脱色液的进料速度为2～3BV/h；当进料量达到3BV时，第1柱吸附饱和，停止进脱色液，并以2～3BV/h的进料速度通入去离子水进行洗涤，并由第3柱排出；当去离子水洗涤至3BV时，停止通入去离子水，将第1柱转去进行洗脱处理；在第3柱后串联第4柱，从第2柱进脱色液，由第4柱排出废液，重复前述操作，进行循环处理。

步骤(4)中，所述的洗脱处理为保持洗脱流速为1～2BV/h，先用1BV的pH 8～9的氨水进行预洗脱，再用0.5mol/L氨水作为洗脱剂进行洗脱，收集pH9.0～11的洗脱液。其中，使用0.5mol/L氨水作为洗脱剂进行洗脱时，废弃pH＜8.0的洗脱液，收集pH8.0～9.0的洗脱液用于预洗脱下一离子交换柱。洗脱完成后，向离子交换柱中通入2BV的洗脱剂对离子交换柱进行再生，再通入去离子水洗至流出液的pH为8.0，即完成离子交换柱的再生。

步骤(4)中，所述的减压浓缩蒸氨的方法为：在60～70℃和-0.1～-0.08Mpa的真空度下，将洗脱液浓缩至L-鸟氨酸的质量百分比为30～40％。

步骤(5)中，所述的酸化反应是指向降至室温后的步骤(4)中所得浓缩液中加入30～36％的盐酸水溶液，直至pH为4.5～5.5后，搅拌1～4h。

步骤(6)中，乙醇和二次脱色液的体积比为1.2：1～2.0：1；其中，全部乙醇在1～4h内加入二次脱色液中。

其中，加入乙醇进行结晶的和养晶的过程中，保持体系温度为20℃。

步骤(6)中，真空干燥的方法为：在50～60℃和-0.1～-0.08Mpa的真空度下，真空干燥晶体4～6h。

有益效果：与现有技术相比，本发明工艺简单，采用超滤与可再生的活性炭层析柱进行连续脱色，脱色液的透射比达98％以上，并大幅降低了脱色成本和操作周期。采用连续离子交换，提高了树脂对L-鸟氨酸的吸附能力，减少了树脂再生次数和废水排放，并将离子交换的收率保持在97％以上。该法的L-鸟氨酸盐酸盐的提取率达85％以上，产品纯度达98.5％以上，有利于工业化生产，具有显著的经济和社会价值。

附图说明

图1为本发明的工艺流程图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例中，BV是指相对应的单柱所填充的吸附剂床层体积。

实施例1

将L-鸟氨酸发酵液(32g/L，透射比30％)调节至pH 6.0，进行微滤处理，操作压力0.1Mpa，操作温度30℃，孔径为0.5微米，细胞去除率为98％，将收集的微滤液进行超滤处理，操作压力0.3Mpa，操作温度35℃，杂蛋白去除率88％，收集超滤液，透射比为45％。将收集的超滤液加热至60℃，以5BV/h的流速泵入活性炭层析柱进行脱色，床层的直径比为8。处理完55BV的超滤液后，停止上柱脱色，脱色液透射比为98.5％。用3BV体积的60℃去离子水按3BV/h的流速冲洗活性炭层析柱，收集前段流出的1BV体积的流出液，与后批次的L-鸟氨酸发酵液合并，继续用于脱色；活性炭层析柱则进行再生，用于下一次脱色。将收集的脱色液调节至pH 2.5进行连续离子交换除杂，单柱树脂床层高径比为6，进料流速为2BV/h，交换饱和后的树脂对L-鸟氨酸的吸附量达到100mg/g树脂。洗脱过程中收集pH9.0～11的洗脱液并蒸氨浓缩，温度为60℃，真空度-0.08Mpa，将洗脱液浓缩至L-鸟氨酸含量为35％wt。加35％浓盐酸酸化至pH为4.5后进行二次脱色，脱色流速为3BV/h，二次脱色液的透射比为98％，按醇水体积比1.4：1流加乙醇进行结晶，流加时间3h，养晶4h。在真空度-0.1Mpa，55℃下真空干燥晶体6h，即获得L-鸟氨酸盐酸盐产品。产品纯度为98.5％，产品提取收率为87％。

实施例2

将L-鸟氨酸发酵液(40g/L，透射比19％)调节至pH 6.5，进行微滤处理，操作压力0.15Mpa，操作温度25℃，孔径为0.22微米，细胞去除率为99％，将收集的微滤液进行超滤处理，操作压力0.25Mpa，操作温度30℃，杂蛋白去除率91％，收集超滤液，透射比为45％。将收集的超滤液加热至65℃，以6BV/h的流速泵入实例1中再生的活性炭层析柱进行脱色，床层的高径比为10。处理完50BV的超滤液后，停止上柱脱色，脱色液透射比为99.0％。用3BV体积的60℃去离子水按3BV/h的流速冲洗活性炭层析柱，收集前段流出的1BV体积的流出液，与后批次的L-鸟氨酸发酵液合并，继续用于脱色；活性炭层析柱则进行再生，用于下一次脱色。将收集的脱色液调节至pH 2.0进行连续离子交换除杂，单柱树脂床层高径比为6，进料流速为1.5BV/h，交换饱和后的树脂对L-鸟氨酸的吸附量达到112mg/g树脂。洗脱过程中收集pH9.0～11的洗脱液并蒸氨浓缩，温度为55℃，真空度-0.08Mpa，将洗脱液浓缩至L-鸟氨酸含量为40％wt。加34％浓盐酸酸化至pH为5.0后进行二次脱色，脱色流速为5BV/h，二次脱色液的透射比为98％。按醇水体积比1.5：1流加乙醇进行结晶，流加时间2h，养晶6h。在真空度-0.1Mpa，55℃下真空干燥晶体6h，即获得L-鸟氨酸盐酸盐产品。产品纯度为98.8％，产品提取收率为88％。

实施例3

将L-鸟氨酸发酵液(44g/L，透射比23％)调节至pH 6.2，进行微滤处理，操作压力0.3Mpa，操作温度33℃，孔径为0.22微米，细胞去除率为99％，将收集的微滤液进行超滤处理，操作压力0.4Mpa，操作温度35℃，杂蛋白去除率91％，收集超滤液，透射比为45％。将收集的超滤液加热至60℃，以6BV/h的流速泵入实例2中再生的活性炭层析柱进行脱色，床层的高径比为12。处理完65BV的超滤液后，停止上柱脱色，脱色液透射比为98.7％。用3BV体积的60℃去离子水按3BV/h的流速冲洗活性炭层析柱，收集前段流出的1BV体积的流出液，与后批次的L-鸟氨酸发酵液合并，继续用于脱色；活性炭层析柱则进行再生，用于下一次脱色。将收集的脱色液调节至pH 2.0进行连续离子交换除杂，单柱树脂床层高径比为4，进料流速为1.5BV/h，交换饱和后的树脂对L-鸟氨酸的吸附量达到91mg/g树脂。洗脱过程中收集pH9.0～11的洗脱液并蒸氨浓缩，温度为65℃，真空度-0.09Mpa，将洗脱液浓缩至L-鸟氨酸含量为30％wt。加36％浓盐酸酸化至pH为5.3后进行二次脱色，脱色流速为6BV/h，二次脱色液的透射比为98.4％。按醇水体积比1.8：1流加乙醇进行结晶，流加时间1h，养晶5h。在真空度-0.1Mpa，60℃下真空干燥晶体4h，即获得L-鸟氨酸盐酸盐产品。产品纯度为98.7％，产品提取收率为85％。

实施例4

将L-鸟氨酸发酵液(31g/L，透射比30％)调节至pH 6.1，进行微滤处理，操作压力0.05Mpa，操作温度35℃，孔径为0.5微米，细胞去除率为97％，将收集的微滤液进行超滤处理，操作压力0.2Mpa，操作温度30℃，杂蛋白去除率93％，收集超滤液，透射比为55％。将收集的超滤液加热至70℃，以3BV/h的流速泵入实例3中再生的活性炭层析柱进行脱色，床层的高径比为10。处理完70BV的超滤液后，停止上柱脱色，脱色液透射比为98.0％。用3BV体积的60℃去离子水按5BV/h的流速冲洗活性炭层析柱，收集前段流出的1BV体积的流出液，与后批次的L-鸟氨酸发酵液合并，继续用于脱色；活性炭层析柱则进行再生，用于下一次脱色。将收集的脱色液调节至pH 1.5进行连续离子交换除杂，单柱树脂床层高径比为8，进料流速为1BV/h，交换饱和后的树脂对L-鸟氨酸的吸附量达到105mg/g树脂。洗脱过程中收集pH9.0～11的洗脱液并蒸氨浓缩，温度为60℃，真空度-0.1Mpa，将洗脱液浓缩至L-鸟氨酸含量为30％wt。加30％浓盐酸酸化至pH为4.8后进行二次脱色，脱色流速为3BV/h，二次脱色液的透射比为98％。按醇水体积比1.2：1流加乙醇进行结晶，流加时间4h，养晶5h。在真空度-0.1Mpa，60℃下真空干燥晶体4h，即获得L-鸟氨酸盐酸盐产品。产品纯度为98.5％，产品提取收率为86％。