一种基于对称环状哑铃模板的核酸恒温指数扩增技术及其在microRNA检测中的应用的制作方法

文档序号:12167109阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种环状哑铃形扩增模板,包括两个环部和一个颈部,其特征在于,两个环部上均设有长度可调节的toehold序列,所述的toehold序列及相连颈部的部分序列与靶序列互补,环部的另一侧含有切口酶识别位点。

2.根据权利要求1所述的环状哑铃形扩增模板,其特征在于,所述toehold序列的长度≤14 bp。

3.根据权利要求2所述的环状哑铃形扩增模板,其特征在于,所述toehold序列的长度为9-14bp。

4.根据权利要求1所述的环状哑铃形扩增模板,其特征在于,与toehold序列相连的颈部与靶序列互补部分的长度为9-14bp。

5.一种microRNA检测试剂盒,其包括权利要求1-4任一项所述的环状哑铃形扩增模板,所述靶序列即为目标microRNA。

6.根据权利要求5所述的microRNA检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括A液和B液,其中A液包括:切口酶缓冲液、dNTP、RNase抑制剂;B液包括:DNA聚合酶缓冲溶液、DNA聚合酶、切口酶、以及能与双链DNA 结合发光的荧光染料。

7.一种高效率的microRNA检测方法,包括如下步骤:

(1)从样品中提取总microRNA;

(2)加入权利要求1-4任一项所述的环状哑铃形扩增模板进行恒温指数扩增;

(3)根据检测到的荧光强度判断目标microRNA的浓度。

8.根据权利要求7所述的microRNA检测方法,其特征在于,所述恒温指数扩增体系中还含有dNTP、RNase抑制剂、DNA聚合酶缓冲溶液、DNA聚合酶、切口酶缓冲液、切口酶、以及能与双链DNA 结合发光的荧光染料。

9.根据权利要求8所述的所述的microRNA检测方法,其特征在于,所述恒温指数扩增体系中,环状哑铃形扩增模板的用量为0.05-0.25 μM。

10.根据权利要求8所述的所述的microRNA检测方法,其特征在于,所述DNA聚合酶为Vent(exo-)聚合酶,其用量为0.05-0.3 U/μL;所述切口酶为Nt.BstNBI切口酶,其用量为0.05-0.25 U/μL。

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