本发明涉及生物
技术领域：
。更具体地说，本发明涉及暗色环纹炭团菌活性代谢产物的制备方法。
背景技术：
：三七具有显著的活血化瘀、消肿定痛功效，是一种中国传统名贵药材。近年来，对三七原材料的需求日益增长，但是栽培过程中的真菌病害严重影响了三七生长。三七黑斑病、能侵染三七植株和地下根系，以茎、叶、花轴受害较重，根部感染后呈褐色湿腐状，四季均可发生。三七圆斑病可为害植株各个部位，叶片发病初期叶背面呈现黄色小点，在天气潮湿或连续阴雨天，迅速扩大成透明状圆形，可引起芽腐和茎基腐。三七灰霉病以危害叶为主，多从下部老叶的叶尖或近地部分叶柄发病，灰褐色病斑，腐烂。在广西三七的传统产区，由于低海拔及高温多湿的气象条件，这种病害往往是同时发生的，造成了三七的大量减产甚至绝收，给种植户带来了巨大的经济损失。目前，在三七种植上，防治真菌病害过度依赖化学农药，大量化学农药的使用不仅影响了三七的品质，也造成了三七药材的大量农药残留。因此，开展生物防治三七真菌病害对三七产业的可持续发展是非常迫切和必要的。为此筛选出能同时拮抗这些病害的拮抗菌具有重大意义。技术实现要素：本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。本发明还有一个目的是提供一种暗色环纹炭团菌活性代谢产物的制备方法及其应用，此制备方法简单，易操作，不仅对三七灰霉病病原菌、三七圆斑病病原菌病原菌、苦玄参褐斑病病原菌、艾纳香条斑病病原菌、广西莪术叶斑病病原菌、草豆蔻叶斑病病原菌和罗汉果斑枯病病原菌菌丝有很好的抑制作用，还对其孢子萌发具有很强的抑制作用。为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种暗色环纹炭团菌活性代谢产物的制备方法，包括以下步骤：步骤一、将暗色环纹炭团菌在PDA培养基上活化培养，挑取菌丝块接入改良的PDB培养基中，于25～28℃，摇床培养8～12d，得初次发酵液；其中所述改良的PDB培养基包括PDB和100～150mL三七茎叶原浆；步骤二、按体积质量比为1000mL:0.00004～0.0001g:0.00004～0.0001g向步骤一中得到的初次发酵液中加入氯化钙和琥珀酸钠，于25～28℃，摇床培养3～8d，得二次发酵液；步骤三、按体积比为1:1～2向步骤二中得到的二次发酵液中加入乙酸乙酯，离心处理，滤除沉淀物，取上清液，然后旋蒸蒸发去除溶剂，旋蒸温度为50～60℃，即得到暗色环纹炭团菌活性代谢产物。优选的是，步骤三中乙酸乙酯可以用氯仿或者乙醚替代，其旋蒸温度分别为45～55℃和20～30℃。优选的是，步骤一中三七茎叶原浆的制备方法：将三七的茎和叶放入研钵中，加入冰水研磨30min，然后加入胱氨酸、苏氨酸、白氨酸和赖氨酸，置于超声波中以60kHz超声频率处理40min，再用研钵研磨10min，置于超声波中以60kHz超声频率处理20min，过滤即得，置于4℃环境中保藏，备用；其中所述三七的茎、叶、冰水、胱氨酸、苏氨酸、白氨酸和赖氨酸的质量比为1:1:10:0.00005:0.00005:0.00005:0.00005。优选的是，步骤一的初次发酵液进行诱导后处理：将1000重量份初次发酵液放入4℃环境中培养1d，然后加入1重量份病原菌悬浊液，再移至10℃环境中培养5d，然后移至摇床，于25～28℃，200r/min条件下继续培养3d后即得；其中，所述病原菌悬浊液的制备方法：挑取0.1～0.5重量份病原菌菌丝块至100重量份水中，再用电动搅拌器以1000r/min的转速条件下搅拌20～30min制成悬浊液；所述病原菌菌丝块可以为三七灰霉病病原菌和三七圆斑病病原菌的一种或两种。本发明还提供了一种采用上述制备方法获得的暗色环纹炭团菌活性代谢产物的应用，在防治三七灰霉病和三七圆斑病中的应用。优选的是，还包括在防治苦玄参褐斑病、艾纳香条斑病、广西莪术叶斑病、草豆蔻叶斑病和罗汉果斑枯病中的应用。本发明至少包括以下有益效果：第一、采用三七茎叶原浆改良的PDB培养基培养暗色环纹炭团菌，三七茎叶原浆可以提供暗色环纹炭团菌繁殖所需要的活性物质，可以加快其繁殖速度，在相同时间内得到更多其菌体。第二、在初次发酵液中加入氯化钙和琥珀酸钠进行二次发酵，琥珀酸钠可以促进暗色环纹炭团菌吸收营养物质，氯化钙可以促进暗色环纹炭团菌活性代谢产物的溶出，两者结合可以促使暗色环纹炭团菌分泌更多活性代谢产物。第三、将胱氨酸、苏氨酸、白氨酸和赖氨酸加入三七茎叶研磨液中，促使三七细胞膜破裂，与超声手段结合可以促进三七茎叶中活性物质流出，并在低温环境中与氨基酸形成稳定微溶液，保持三七茎叶活性物质的活性。第四、利用病原菌悬浊液对初次发酵液的诱导后处理，可以激活其菌体内分泌暗色环纹炭团菌活性代谢产物的机制，促使其分泌出更多活性代谢产物，且暗色环纹炭团菌活性代谢产物的活性更强。第五、暗色环纹炭团菌活性代谢产物在乙酸乙酯、氯仿和乙醚中溶解度高，采用这3种溶剂萃取，所得暗色环纹炭团菌活性代谢产物得率高。利用本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。具体实施方式下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。<实施例1>暗色环纹炭团菌活性代谢产物的制备方法，包括以下步骤：步骤一、将暗色环纹炭团菌在PDA培养基上活化培养，培养温度为28℃，培养时间5d，挑取菌丝块接入改良的PDB培养基中，于28℃，摇床培养10d，得初次发酵液；其中所述改良的PDB培养基包括PDB和100mL三七茎叶原浆；步骤二、按体积质量比为1000mL:0.00005g:0.00005g向步骤一中得到的初次发酵液中加入氯化钙和琥珀酸钠，于28℃，摇床培养5d，得二次发酵液；步骤三、按体积比为1:1向二次发酵液中加入乙酸乙酯，离心处理，滤除沉淀物，取上清液，然后旋蒸蒸发去除溶剂，旋蒸温度为55℃，即得到暗色环纹炭团菌活性代谢产物。<实施例2>一、暗色环纹炭团菌活性代谢产物的制备方法，包括以下步骤：步骤一、将暗色环纹炭团菌在PDA培养基上活化培养，培养温度为28℃，培养时间5d，挑取菌丝块接入改良的PDB培养基中，于28℃，摇床培养12d，得初次发酵液；其中所述改良的PDB培养基包括PDB和150mL三七茎叶原浆；步骤二、按体积质量比为1000mL:0.0001g:0.0001g向步骤一中得到的初次发酵液中加入氯化钙和琥珀酸钠，于28℃，摇床培养8d，得二次发酵液；步骤三、按体积比为1:2向二次发酵液中加入乙酸乙酯，离心处理，滤除沉淀物，取上清液，然后旋蒸蒸发去除溶剂，旋蒸温度为60℃，即得到暗色环纹炭团菌活性代谢产物。<实施例3>暗色环纹炭团菌活性代谢产物的制备方法，包括以下步骤：步骤一、将暗色环纹炭团菌在PDA培养基上活化培养，培养温度为28℃，培养时间5d，挑取菌丝块接入改良的PDB培养基中，于25℃，摇床培养8d，得初次发酵液；其中所述改良的PDB培养基包括PDB和100mL三七茎叶原浆；步骤二、按体积质量比为1000mL:0.00004g:0.00004g向步骤一中得到的初次发酵液中加入氯化钙和琥珀酸钠，于25℃，摇床培养3d，得二次发酵液；步骤三、按体积比为1:1向二次发酵液中加入乙酸乙酯，离心处理，滤除沉淀物，取上清液，然后旋蒸蒸发去除溶剂，旋蒸温度为50℃，即得到暗色环纹炭团菌活性代谢产物。<实施例4>暗色环纹炭团菌活性代谢产物的制备方法，包括以下步骤：步骤一、将暗色环纹炭团菌在PDA培养基上活化培养，培养温度为28℃，培养时间5d，挑取菌丝块接入改良的PDB培养基中，于28℃，摇床培养10d，得初次发酵液；其中，初次发酵液进行诱导后处理：将1000重量份初次发酵液放入4℃环境中培养1d，然后加入1重量份病原菌悬浊液，再移至10℃环境中培养5d，然后移至摇床，于28℃，200r/min条件下继续培养3d后即得；其中，所述病原菌悬浊液的制备方法：挑取0.3重量份三七灰霉病病原菌菌丝块至100重量份水中，再用电动搅拌器以1000r/min的转速条件下搅拌25min制成悬浊液；其中所述改良的PDB培养基包括PDB和100mL三七茎叶原浆；其中，三七茎叶原浆的制备方法：将三七的茎和叶放入研钵中，加入冰水研磨30min，然后加入胱氨酸、苏氨酸、白氨酸和赖氨酸，置于超声波中以60kHz超声频率处理40min，再用研钵研磨10min，置于超声波中以60kHz超声频率处理20min，过滤即得，置于4℃环境中保藏，备用；三七的茎、叶、冰水、胱氨酸、苏氨酸、白氨酸和赖氨酸的质量比为1:1:10:0.00005:0.00005:0.00005:0.00005；步骤二、按体积质量比为1000mL:0.00005g:0.00005g向步骤一中得到的初次发酵液中加入氯化钙和琥珀酸钠，于28℃，摇床培养5d，得二次发酵液；步骤三、按体积比为1:1向二次发酵液中加入乙酸乙酯，离心处理，滤除沉淀物，取上清液，然后旋蒸蒸发去除溶剂，旋蒸温度为55℃，即得到暗色环纹炭团菌活性代谢产物。<实施例5>暗色环纹炭团菌活性代谢产物的制备方法，包括以下步骤：步骤一、将暗色环纹炭团菌在PDA培养基上活化培养，培养温度为28℃，培养时间5d，挑取菌丝块接入改良的PDB培养基中，于28℃，摇床培养12d，得初次发酵液；其中，初次发酵液进行诱导后处理：将1000重量份初次发酵液放入4℃环境中培养1d，然后加入1重量份病原菌悬浊液，再移至10℃环境中培养5d，然后移至摇床，于28℃，200r/min条件下继续培养3d后即得；其中，所述病原菌悬浊液的制备方法：挑取0.5重量份三七灰霉病病原菌菌丝块至100重量份水中，再用电动搅拌器以1000r/min的转速条件下搅拌30min制成悬浊液；其中所述改良的PDB培养基包括PDB和150mL三七茎叶原浆；其中，三七茎叶原浆的制备方法：将三七的茎和叶放入研钵中，加入冰水研磨30min，然后加入胱氨酸、苏氨酸、白氨酸和赖氨酸，置于超声波中以60kHz超声频率处理40min，再用研钵研磨10min，置于超声波中以60kHz超声频率处理20min，过滤即得，置于4℃环境中保藏，备用；三七的茎、叶、冰水、胱氨酸、苏氨酸、白氨酸和赖氨酸的质量比为1:1:10:0.00005:0.00005:0.00005:0.00005；步骤二、按体积质量比为1000mL:0.0001g:0.0001g向步骤一中得到的初次发酵液中加入氯化钙和琥珀酸钠，于28℃，摇床培养8d，得二次发酵液；步骤三、按体积比为1:2向二次发酵液中加入乙酸乙酯，离心处理，滤除沉淀物，取上清液，然后旋蒸蒸发去除溶剂，旋蒸温度为60℃，即得到暗色环纹炭团菌活性代谢产物。<实施例6>暗色环纹炭团菌活性代谢产物的制备方法，包括以下步骤：步骤一、将暗色环纹炭团菌在PDA培养基上活化培养，培养温度为28℃，培养时间5d，挑取菌丝块接入改良的PDB培养基中，于25℃，摇床培养8d，得初次发酵液；其中，初次发酵液进行诱导后处理：将1000重量份初次发酵液放入4℃环境中培养1d，然后加入1重量份病原菌悬浊液，再移至10℃环境中培养5d，然后移至摇床，于25℃，200r/min条件下继续培养3d后即得；其中，所述病原菌悬浊液的制备方法：挑取0.1重量份三七灰霉病病原菌菌丝块至100重量份水中，再用电动搅拌器以1000r/min的转速条件下搅拌20min制成悬浊液；其中所述改良的PDB培养基包括PDB和100mL三七茎叶原浆；其中，三七茎叶原浆的制备方法：将三七的茎和叶放入研钵中，加入冰水研磨30min，然后加入胱氨酸、苏氨酸、白氨酸和赖氨酸，置于超声波中以60kHz超声频率处理40min，再用研钵研磨10min，置于超声波中以60kHz超声频率处理20min，过滤即得，置于4℃环境中保藏，备用；三七的茎、叶、冰水、胱氨酸、苏氨酸、白氨酸和赖氨酸的质量比为1:1:10:0.00005:0.00005:0.00005:0.00005；步骤二、按体积质量比为1000mL:0.00004g:0.00004g向步骤一中得到的初次发酵液中加入氯化钙和琥珀酸钠，于25℃，摇床培养3d，得二次发酵液；步骤三、按体积比为1:1向二次发酵液中加入乙酸乙酯，离心处理，滤除沉淀物，取上清液，然后旋蒸蒸发去除溶剂，旋蒸温度为50℃，即得到暗色环纹炭团菌活性代谢产物。<实施例7>按实施例1的方法，将乙酸乙酯替换成氯仿，旋蒸温度为45℃，其它操作与实施例1一致，得到暗色环纹炭团菌活性代谢产物。<实施例8>按实施例1的方法，将乙酸乙酯替换成乙醚，旋蒸温度为25℃，其它操作与实施例1一致，得到暗色环纹炭团菌活性代谢产物。<对比试验>取乙醇为对比例1，按实施例1的方法，将乙酸乙酯替换成乙醇，旋蒸温度为55℃，其它操作与实施例1一致，得到暗色环纹炭团菌活性代谢产物。取丙酮为对比例2，按实施例1的方法，将乙酸乙酯替换成丙酮，旋蒸温度为35℃，其它操作与实施例1一致，得到暗色环纹炭团菌活性代谢产物。采用实施例1，实施例7，实施例8、对比例1、对比例2的方法，5种溶剂对暗色环纹炭团菌活性代谢产物的提取效果如表1所示，以乙酸乙酯得率最高，氯仿和乙醚次之，乙醇和丙酮最低。暗色环纹炭团菌活性代谢产物得率(％)＝暗色环纹炭团菌活性代谢产物体积/二次发酵液体积×100％表1暗色环纹炭团菌活性代谢产物的得率有机溶剂得率/％乙酸乙酯5.23氯仿3.31乙醚2.84乙醇0.88丙酮0.72<实施例9>按实施例4的方法，将三七灰霉病病原菌菌丝块替换成三七圆斑病病原菌菌丝块，其它操作与实施例4一致，得到暗色环纹炭团菌活性代谢产物。<实施例10>按实施例4的方法，将三七灰霉病病原菌菌丝块替换成混合菌，其中混合菌采用三七灰霉病病原菌菌丝块和三七圆斑病病原菌菌丝块制成，其它操作与实施例4一致，得到暗色环纹炭团菌活性代谢产物。<病原菌抑制试验>采用实施例1～6、实施例9和实施例10的方法获得的暗色环纹炭团菌活性代谢产物对病原菌进行抑制率试验，病原菌包括三七灰霉病病原菌、三七圆斑病病原菌、苦玄参褐斑病病原菌、艾纳香条斑病病原菌、广西莪术叶斑病病原菌、草豆蔻叶斑病病原菌和罗汉果斑枯病病原菌。1、暗色环纹炭团菌活性代谢产物对病原菌菌丝的影响：采用菌丝生长速率法测定。取10mL的暗色环纹炭团菌活性代谢产物加入到90mL的PDA培养基，充分混匀，倒入直径为9cm的培养皿中制成带药平板，每个处理4个重复。以无菌水作为对照。将培养好的直径为5mm病原菌接种至处理及对照的平板中央，于28℃温度的培养箱中培养5d后，用直尺测量菌落直径。按以下公式计算抑制率：菌丝生长抑制率(％)＝(对照菌落增长直径-药剂处理菌落增长直径)/对照菌落增长直径×100％表2暗色环纹炭团菌活性代谢产物对病原菌菌丝的影响2、暗色环纹炭团菌活性代谢产物对病原菌孢子萌发的影响：采用悬滴法测定暗色环纹炭团菌活性代谢产物对孢子萌发的抑制作用：将病原菌培养一定时间后使其产孢，加无菌水配置成10倍物镜下每视野50～60个孢子左右的孢子悬浮液。等体积吸取孢子悬浮液与暗色环纹炭团菌活性代谢产物，以孢子悬液为对照，4次重复，28℃下培养，24h后检查孢子萌发情况，计算孢子萌发抑制率。萌发抑制率(％)＝(对照萌发率-处理萌发率)/对照萌发率×100％表3暗色环纹炭团菌活性代谢产物对病原菌孢子萌发的影响由表2和表3中的病原菌菌丝抑制率和病原菌孢子萌发的抑制率的数据，可以看出采用实施例3～6的制备方法制备的暗色环纹炭团菌活性代谢产物对病原菌菌丝的抑制率和对病原菌孢子萌发的抑制率明显高于采用实施例1～3的制备方法制备的暗色环纹炭团菌活性代谢产物，说明在初次发酵液中加入氯化钙和琥珀酸钠进行二次发酵，可以促使暗色环纹炭团菌分泌更多活性代谢产物，再利用病原菌悬浊液对初次发酵液的诱导后处理，可以激活其菌体内分泌暗色环纹炭团菌活性代谢产物的机制，促使其分泌出更多活性代谢产物，且暗色环纹炭团菌活性代谢产物的活性更强。由实施例4、实施例9和实施例10的病原菌菌丝抑制率和病原菌孢子萌发的抑制率的数据可以看出，3个实施例所得的暗色环纹炭团菌活性代谢产物对病原菌菌丝抑制率和病原菌孢子萌发的抑制率差不多，说明采用三七灰霉病病原菌或三七圆斑病病原菌或二者的混合物对初次发酵液进行诱导后处理的作用相当，且均可以促使暗色环纹炭团菌分泌出更多活性代谢产物，暗色环纹炭团菌活性代谢产物的活性更强。尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。当前第1页1 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