本发明涉及生物制药技术领域，尤其涉及一种从链霉菌发酵液中分离纯化子囊霉素的方法。
背景技术：
子囊霉素(Ascomycin,Immunomycin,FK-520)为二十三碳的大环内酯类化合物，是免疫抑制剂FK-506(他克莫司，tacrolimus)乙基类似物。自从其结构类似他克莫司的免疫抑制活性被发现后，迅速推动了子囊霉素以及衍生物的免疫抑制活性研究。研究发现约翰子囊霉素具有很强的免疫抑制作用，目前子囊霉素已被用作生产半合成API(如吡美莫司)的中间体。吡美莫司主要应用于特应性皮炎、变应性接触性皮炎、银屑病，红斑狼疮，扁平苔藓，白癜风，移植物抗宿主病等自身免疫疾病的治疗。
国内对子囊霉素的研究尚处于起步阶段，公开号为CN101036649A的中国发明专利公开了子囊霉素作为免疫抑制剂在制备治疗自身免疫性糖尿病和皮肤病抑制排斥反应的药物中的用途。昆明理工大学穆云龙通过对子囊霉素菌种选育及发酵条件的初步研究，发酵培养96h，发酵效价最高可达131.7mg/L。但对于如何分离提取产物并未具体说明。
1988年日本日本藤泽制药公司报道提取子囊霉素的方法。由于发酵液中会存在多种子囊霉素类似物且由于子囊霉素在水相中存在异构现象，而提取分离方法中多含水相，这就使得发酵液中提纯子囊霉素主要技术研究存在较大技术难度。
目前对于子囊霉素的大部分研究工作集中在子囊霉素发酵、子囊霉素衍生物的开发、抗菌活性及临床应用等方面。现阶段子囊霉素分离提取的主要问题是子囊霉素的收率不高，分离成本高等问题。另外，由于子囊霉素在水相中存在异构现象，目前提取分离方法中多含有水相，产品中含有子囊霉素结构类似物，影响产品纯度及产品形态。
技术实现要素：
本发明的目的在于公开一种从链霉菌发酵液中分离纯化子囊霉素的方法，用以实现从链霉菌发酵液中高效、快速且低成本的提取并纯化子囊霉素，提高收率。
为实现上述发明目的，本发明提供了一种从链霉菌发酵液中分离纯化子囊霉素的方法，包括以下步骤：
步骤1)、向链霉菌发酵液中加入相当于链霉菌发酵液体积1～4％的助滤剂，搅拌30～45分钟，固液分离，收集菌丝体；
步骤2)、用有机溶剂于室温下浸泡提取菌丝体2～5次，每次浸泡提取2～6h，得到浸提液，合并浸提液，并减压浓缩得到浓缩液；
步骤3)、将步骤2)所得的浓缩液使用装填非极性大孔树脂的床层进行吸附，加入洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱液并浓缩；
步骤4)、向步骤3)所得的浓缩液中加入有机溶剂萃取，提取上相萃取液，对上相萃取液减压浓缩得到油状浓缩物；
步骤5)、将步骤4)所得的油状浓缩物用硅胶柱层析，加入洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱液并浓缩，得浓缩液；
步骤6)、将步骤5)所得的浓缩液加入有机溶剂进行重结晶，得到子囊霉素粗品；
步骤7)、将步骤6)所得的子囊霉素粗品使用动态轴向高压柱层析柱进行分离，加入洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱液，并浓缩洗脱液；
步骤8)、将步骤7)中浓缩后的洗脱液加入有机溶剂萃取后，进行重结晶，并烘干，即得含有子囊霉素的结晶物。
作为本发明的进一步改进，所述步骤1)中的助滤剂选自硅藻土、珍珠岩中的一种或者两种任意比例的混合物。
作为本发明的进一步改进，所述步骤2)中的有机溶剂选自乙酸乙酯、乙醇或者丙酮中的一种或者多种任意比例的混合物；所述减压浓缩得到浓缩液具体为：在0.06～0.1MPa的负压环境下，浓缩回收有机溶剂，以得到浓缩液。
作为本发明的进一步改进，所述步骤3)中的非极性大孔树脂选自X-5大孔树脂、D1300大孔树脂或者HZ818大孔树脂；所述步骤3)中的洗脱剂为20～55％vol丙酮水溶液或者25～70％vol乙醇水溶液。
作为本发明的进一步改进，所述步骤4)中的有机溶剂选自乙酸乙酯或者氯仿。
作为本发明的进一步改进，所述步骤5)中的硅胶柱层析为200～300目的硅胶层析柱；所述步骤5)中的洗脱剂为体积比为15:85～70:30的乙醇和正己烷的混合溶液、30～50％vol乙腈水溶液或者40～50％vol乙醇水溶液。
作为本发明的进一步改进，所述步骤6)中的有机溶剂选自石油醚、乙醚中的一种或者两种任意比例的混合溶液。
作为本发明的进一步改进，所述步骤7)中的动态轴向高压柱层析柱中的筛板粒径为10um，柱高100cm，直径10cm；所述步骤7)中的洗脱剂为体积比为15:85～70:30的丙酮和正己烷的混合溶液、30～50％vol乙腈水溶液或者40～50％vol乙醇水溶液；所述步骤7)中的有机溶剂选自石油醚、乙醚中的一种或者两种任意比例的混合溶液。
作为本发明的进一步改进，所述步骤8)中的有机溶剂选自正己烷、环己烷中的一种或者两种任意比例的混合溶液。
作为本发明的进一步改进，所述步骤8)中的结晶方式为冷却结晶，结晶温度为0～4℃。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明相对于现有技术能够大幅度缩短提取时间，提高了效率，具有操作方便、工艺简单和成本低等诸多优点，易于工业化生产，为子囊霉素的生产提供了可行的分离工艺。
具体实施方式
下面结合各实施方式对本发明进行详细说明，但应当说明的是，这些实施方式并非对本发明的限制，本领域普通技术人员根据这些实施方式所作的功能、方法、或者结构上的等效变换或替代，均属于本发明的保护范围之内。
除非说明书中有特殊说明，本发明中的各个实施例中的组分、原料均采用分析纯级别。另外，各实施例中的“g”为重量单位“克”；“h”为时间单位“小时”；“ml”为体积单位“毫升”；“室温”为23℃。
实施例一：
一种从链霉菌发酵液中分离纯化子囊霉素的方法，包括以下步骤。
步骤1)、向链霉菌发酵液中加入相当于链霉菌发酵液体积1％的珍珠岩作为助滤剂，搅拌30分钟，固液分离，过滤，并收集菌丝体。
步骤2)、用乙酸乙酯在室温下浸泡提取菌丝体2次，每次浸泡提取2h，得到浸提液，合并浸提液，并在0.06MPa的负压环境下，减压浓缩得到浓缩物。
步骤3)、将步骤2)得到的浓缩物用装填有X-5大孔树脂吸附的床层进行吸附，加入20％vol丙酮水溶液作为洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱液，浓缩。
步骤4)、向步骤3)所得的浓缩物加入乙酸乙酯进行萃取，提取上相萃取液，萃取液抽滤，0.08MPa减压浓缩得到油状浓缩物。
步骤5)、油状浓缩物用200目的硅胶柱层析，用体积比为15:85丙酮和正己烷的混合溶液作为洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱液，浓缩，得浓缩液。
步骤6)、将步骤5)所的浓缩液加入石油醚溶解，重结晶，得到子囊霉素粗品。
步骤7)、子囊霉素粗品使用动态轴向高压柱层析柱进行分离，用体积比为15:85丙酮和正己烷的混合溶液作为洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱液，并浓缩洗脱液。
步骤8)、将步骤7)中浓缩后的洗脱液加入石油醚，在0～4℃下冷却结晶，即得含有子囊霉素的结晶物。在本实施例中，结晶物中子囊霉素的纯度为99％，收率为85％。
实施例二：
一种从链霉菌发酵液中分离纯化子囊霉素的方法，包括以下步骤。
步骤1)、向链霉菌发酵液中加入相当于链霉菌发酵液体积4％的硅藻土作为助滤剂，进行搅拌40分钟，固液分离，过滤，并收集菌丝体。
步骤2)、用乙醇于室温下浸泡提取菌丝体5次，每次浸泡提取6h，得到浸提液，合并浸提液，并在0.1MPa的负压环境下，减压浓缩得到浓缩物。
步骤3)、将步骤2)所得的浓缩物用装填有D1300大孔树脂吸附的床层进行吸附，用含有70％vol乙醇的水溶液作为洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱液，浓缩。
步骤4)、将步骤3)所得的浓缩物加入氯仿进行萃取，提取上相萃取液，萃取液抽滤，0.08MPa减压浓缩得到油状浓缩物。
步骤5)、将步骤3)所得的油状浓缩物用300目硅胶柱层析，用40％vol乙腈水溶液作为洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱液，浓缩，得浓缩液。
步骤6)、将步骤5)所得的浓缩物由乙醚溶解，重结晶，得到子囊霉素粗品。
步骤7)、将步骤6)所得的子囊霉素粗品使用动态轴向高压柱层析柱进行分离；用45％vol乙醇的水溶液作为洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱液，并浓缩洗脱液。
步骤8)、将步骤7)所得的浓缩洗脱液加入乙醚，在0～4℃下冷却结晶，即得含有子囊霉素的结晶物。在本实施例中，结晶物中子囊霉素的纯度为98％，收率为90％。
实施例三：
一种从链霉菌发酵液中分离纯化子囊霉素的方法，包括以下步骤。
步骤1)、向链霉菌发酵液中加入相当于链霉菌发酵液体积3％的由硅藻土与珍珠岩所组成的混合物作为助滤剂，进行搅拌45分钟，固液分离，过滤，并收集菌丝体。
步骤2)、用丙酮于室温下浸泡提取菌丝体3次，每次浸泡提取3h，得到浸提液，合并浸提液，并在0.07MPa的负压环境下，减压浓缩得到浓缩物。
步骤3)、将步骤2)得到的浓缩物用装填有X-5大孔树脂吸附的床层进行吸附，含有55％vol丙酮水溶液作为洗脱剂梯度洗脱，收集洗脱液，浓缩。
步骤4)、将步骤3)所的浓缩物加入乙酸乙酯进行萃取，萃取液抽滤，0.07MPa减压浓缩至油状浓缩物。
步骤5)、将步骤4)所的油状浓缩物用250目硅胶柱层析，使用50％vol乙醇水溶液作为洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱液，浓缩。
步骤6)、将步骤5)得到的浓缩物经乙醚溶解，重结晶，得到子囊霉素粗品。
步骤7)、将步骤6)得到的子囊霉素使用动态轴向高压柱层析柱进行分离；含有45％vol乙醇水溶液作为洗脱剂梯度洗脱，收集液，并浓缩洗脱液。
步骤8)、将步骤7)中浓缩后的洗脱液加入由任意比例的石油醚与乙醚所组成的混合溶液，在0～4℃下冷却结晶，即得含有子囊霉素的结晶物。在本实施例中，结晶物中子囊霉素的纯度为99％，收率为90％。
上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。