一种念珠菌基因分型即时检测试剂盒的制作方法

本发明涉及一种念珠菌基因分型即时检测试剂盒，特别涉及一种不依赖于高能量分子的恒温扩增技术。
背景技术：
：念珠菌是一种真菌，通常引起阴道炎的是念珠菌中的白色念珠菌。此菌呈卵圆形，有芽孢及细胞发芽伸长而形成的假菌丝。念珠菌对热的抵抗力不强，加热至60℃1小时后即可死亡。但对干燥、日光、紫外线及化学制剂等抵抗力较强。念珠菌是真菌中最常见的条件致病菌。它常寄生于人的皮肤、口腔、阴道和肠粘膜等处，当机体免疫机能低下或正常寄居部位的微生态环境失调，容易引起念珠菌病。念珠菌可引起皮肤粘膜浅层或全身系统性感染，感染不同部位可引起不同的疾患，除皮肤念珠菌病外，还有念珠菌性口腔炎、阴道炎、膀胱炎、肾盂肾炎、脑膜炎、菌血症和胆道感染等。引起人类假丝酵母菌病主要是白假丝酵母菌，占80%～90%，已鉴别有200多种白色假丝酵母菌，所有菌株似乎均具有寄居或引起阴道炎的同等能力。随着时代的变迁，假丝酵母菌耐药的增加，其菌种发生改变，白假丝酵母菌在外阴阴道炎中的比例有所下降，而其他假丝酵母菌所致的外阴阴道炎增加。念珠稍属于酵母样真菌，迄今发现的念珠菌有270种以上，但临床常的条件致病菌主要有以下几种：白色念珠菌、热带念珠菌、白色念珠菌类星型变种、克柔念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、季也蒙念珠菌、乳酒念珠菌和都柏林念珠菌等。其中白色念珠菌和热带念珠菌致病力最强，引起人类念珠菌病的主要是白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌，占60~80%。近年来报道，念珠菌感染菌种存在变迁趋势，引起念珠菌感染中非白色念珠菌增多，且在病灶中可存在多种致病念珠菌的混合感染；然而各种念珠菌对抗真菌药的天然敏感度差异较大，所以即时检测对念珠菌感染患者进行念珠菌分型有着积极意义。基于病原体dna直接进行检测，相比涂片敏感性大大提高，可以极大提升阳性检出率。念珠菌的dna的检测常用到传统pcr技术，检测程序需要设置多个循环，每个循环包括核酸的变性、退火、延伸，这导致pcr在技术应用上有几点限制：第一，pcr技术需要昂贵的实验室仪器，同时仪器要具备精细的温度控制程序和加热模板，从而实现很高的温度下的dna模板链的变性，较低的温度下引物探针退火延伸模板，这样重复温度变化几十个循环之后实现模板量的放大。由于每一个循环时间都较短，仪器必须能快速准确升降温度，这就需要银制或金制的加热模块，增加了仪器研制的成本。第二，pcr扩增体系中的聚合酶必须具有耐受高温的能力，否则必须在每一个循环中重新加入新酶，以实现下一循环的扩增，这样极容易造成污染也加大了成本。第三，在pcr循环中，每一个循环引物退火的时间都很短（几秒到十几秒）这就要求引物必须快速找到模板上同源匹配的区段，以实现延伸。这就要求pcr体系必须有过量的pcr引物。过量的引物会与模板错配，错误引发扩增，引物二聚体等等，进而抑制pcr扩增，特别是在模板量低的情况，会使这种情况加剧。本发明恒温扩增技术主要利用重组酶的活性，不进行核酸解链和退火即可在恒温条件下（如37℃）进行核酸的扩增，与传统的pcr技术相比，不需要昂贵的仪器，也避免了高温对酶的损耗。同时恒温扩增技术在体系中不需要加入过量的引物，降低了引物与模板错配或生成引物二聚体的可能性。另外，恒温扩增体系有多重工具酶匹配进行有效扩增，扩增效率远远高于传统pcr技术，所用时间更短，最短可以在5min内实现。最后，相对于目前其他恒温扩增技术平台相比，本发明所用的重组酶依赖扩增技术平台是新一代核酸检测的利器，在检测的时效性，便捷性和技术参数等多个方面都优于其它恒温扩增技术平台，通过试剂的有效匹配，甚至可以在人体腋下进行扩增反应。在该技术平台上，除了可以开发基于小型便携式设备用于医疗检测机构如医院急诊科、妇产科、手术室；社区服务中心和基层医疗机构；检验检疫疾病防控机构的分子诊断产品，还可以开发出适合家庭使用的分子诊断产品，使我国不同区域即便存在经济条件参差不齐的情况下，也可以展开全国性病毒性疾病、肿瘤和遗传性疾病的定期和快速普查。这是一个非常巨大的潜在市场，其经济价值和社会效益不可估量。当前我们已经开发适用于医疗机构和家庭使用的hiv检测产品和宫颈癌hpv检测产品。随着平台的不断成熟，可进一步拓展到食品安全、检验检疫、防恐等多个领域。本发明念珠菌基因分型即时检测试剂盒将恒温扩增技术应用到念珠菌感染的检测上，缩短了反应时间，降低了体系对反应条件的要求，大大地提高了检测的效率，也不需要人为主观判读结果，同时检测结果不受混合感染的干扰，因此能更准确的提示混合感染的类型，非常有利于临床的快速诊断和对症治疗。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种念珠菌基因分型即时检测试剂盒，包括反应液，启动液，反应酶系，念珠菌特异性引物及探针。念珠菌基因分型即时检测试剂盒反应液的具体组分如下：品名浓度（摩尔浓度/质量分数/质量浓度）tris-hcl50mmkcl40mm二硫苏糖醇2mm甜菜碱1m海藻糖3.5%peg5.5%bsa0.1mg/ml作为上述反应液的进一步改进，tris-hcl的ph为7.0～9.0，优选ph为8.3。念珠菌基因分型即时检测试剂盒启动液的具体组分如下：品名摩尔浓度氯化镁5mm~20mm作为上述启动液的进一步改进，氯化镁的优选浓度为10mm。念珠菌基因分型即时检测试剂盒反应酶系的具体组分如下：品名浓度（摩尔浓度/酶浓度/质量浓度）dntps200um聚合酶bsu100ng/ul单链结合蛋白262ng/ul重组酶（e.colirect）360ng/ul上游引物200nm下游引物200nm作为上述反应酶系的进一步改进，重组酶选自e.colirect蛋白。念珠菌基因分型即时检测试剂盒特异性引物及探针序列如下：上游引物1tcaacaacggatctcttggttctc（seqidno：1）下游引物1aattgtggtggccactagcaaaataagcgttttg（seqidno：2）荧光探针1catcgatgaagaacgcagcgaaatgcga(fam-dt)ta(dspacer)gt(bhq-dt)aatrtgaattgcaga（seqidno：3）上游引物2aactttcaacaacggatctcttgg（seqidno：4）下游引物2tcaacaccgagttggtaaaacctaatacagtattaac（seqidno：5）荧光探针2cgtgaatcatcgaatct(fam-dt)t(dspacer)t(bhq-dt)gaacgcacattgcgccc（seqidno：6）上游引物3atcgaatctttgaacgcacattgcg（seqidno：7）下游引物3atatacgtggtggacgttaccgccgcaagcaatg（seqidno：8）荧光探针3catcgatgaagaacgcagcgaaa(fam-dt)gc(dspacer)at(bhq-dt)acgtaatrtgaattgcaga（seqidno：9）作为本发明方法的进一步改进，恒温扩增的温度为35～42℃，优选扩增温度为37℃。本发明的有益效果：本发明的恒温扩增体系，不依赖于atp、磷酸肌酸等高能能量分子，相对现有的恒温扩增体系，其组成更为简单，成本更为低廉，使用更为方便。本发明的恒温扩增体系适用于复杂模板的扩增，扩增速度快且稳定，可以在15min以内完成扩增反应，扩增的灵敏度和准确性高，不易出现错配，扩增效果好。本发明的恒温扩增体系使用荧光实时定量技术，应用范围更广，适用于市面上大多数荧光定量扩增仪。本发明同时检测3种致病念珠菌，分别是白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌。对比常规检测的培养方法，时间更短，灵敏度高受培养条件限制少，人为误操作几率低。附图说明：图1至图10依次分别为实施例1至实施例10的荧光结果图，图中荧光曲线的标号对应实施例中反应管的标号。具体实施方式一种念珠菌基因分型即时检测试剂盒，采用了一种不依赖于高能能量分子的恒温扩增技术。试剂盒成分包括反应液，启动液，反应酶系，念珠菌特异性引物及探针，各成分的具体组分如下：念珠菌基因分型试剂盒念珠菌基因分型即时检测试剂盒反应液的具体组分如下：品名浓度（摩尔浓度/质量分数/质量浓度）tris-hcl（ph8.3）50mmkcl40mm二硫苏糖醇2mm甜菜碱1m海藻糖3.5%peg5.5%bsa0.1mg/ml念珠菌基因分型即时检测试剂盒启动液的具体组分如下：品名摩尔浓度氯化镁10mm念珠菌基因分型即时检测试剂盒反应酶系的具体组分如下：品名浓度（摩尔浓度/酶浓度/质量浓度）dntps200um聚合酶bsu100ng/ul单链结合蛋白262ng/ul重组酶（e.colirect）360ng/ul上游引物200nm下游引物200nm念珠菌基因分型即时检测试剂盒特异性引物及探针序列如下：上游引物1tcaacaacggatctcttggttctc（seqidno：1）下游引物1aattgtggtggccactagcaaaataagcgttttg（seqidno：2）荧光探针1catcgatgaagaacgcagcgaaatgcgata(fam-dt)tc(dspacer)at(bhq-dt)aatrtgaattgcaga（seqidno：3）上游引物2aactttcaacaacggatctcttgg（seqidno：4）下游引物2tcaacaccgagttggtaaaacctaatacagtattaac（seqidno：5）荧光探针2cgtgaatcatcgaatct（fam-dt)tt(dspacer)tt(bhq-dt)gaacgcacattgcgccc（seqidno：6）上游引物3atcgaatctttgaacgcacattgcg（seqidno：7）下游引物3atatacgtggtggacgttaccgccgcaagcaatg（seqidno：8）荧光探针3catcgatgaagaacgcagcgaaa(fam-dt)tg(dspacer)gat(bhq-dt)acgtaatrtgaattgcaga（seqidno：9）下面结合具体的实验，进一步说明念珠菌基因分型即时检测试剂盒的优势，但并非限制本发明。实验样本来源：以念珠菌感染患者中分离的热带念珠菌、光滑念珠菌、白色念珠菌、经提取得到的核酸溶液作为样本；以混合热带念珠菌-光滑念珠菌、热带念珠菌-白色念珠菌、光滑念珠菌-白色念珠菌的核酸溶液作为混合感染样本；以外购金黄色葡萄球菌、卷曲乳杆菌、詹式乳杆菌、惰性乳杆菌、支原体菌株、加德纳菌、阴道毛滴虫、近平滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌、乳酒念珠菌经提取得到的核酸溶液作为特异性实验的样本；以正常人阴道分泌物提取物为阴性对照样本。实施例1（3种念珠菌的检测）：取6个200ul反应管，分别标记为反应管1~6。在反应管1~6中分别加入20ul反应液、5ul反应酶系；在反应管1、2中加入上游引物1（200nm）、下游引物1（200nm）、荧光探针1（150nm）；在反应管3、4中加入上游引物2（200nm）、下游引物2（200nm）、荧光探针2（150nm）；在反应管5、6中加入上游引物3（200nm）、下游引物3（200nm）、荧光探针3（150nm）。在反应管1中加入热带念珠菌样本2ul，反应管3中加入光滑念珠菌样本2ul、反应管5加入白色念珠菌样本2ul，反应管2,、4、6都分别加入阴性对照样本2ul。各反应管均用灭菌水补足体系到45ul，振荡混匀后各管再分别加入5ul启动液（各管的终体积为50ul）。选择荧光定量pcr仪进行扩增及收集荧光，具体上机条件为：37℃，30s，30个循环，每个循环都搜集荧光。实施例2（非最优扩增温度条件的检测）：同实施例1，不同之处在于上机条件改为：35℃，30s，30个循环，每个循环都收集荧光。结果如图2。实施例3（非最优扩增温度条件的检测）：同实施例1，不同处在于上机条件改为：42℃，30s，30个循环，每个循环都收集荧光。结果如图3。实施例4（特异性实验）：按照实施例1配制体系42管，分别标记1~42反应管。在1~14反应管的体系中加入上游引物1（200nm）、下游引物1（200nm）、荧光探针1（150nm）；在15~28反应管的体系中加入上游引物2（200nm）、下游引物2（200nm）、荧光探针2（150nm；在28~42反应管的体系中加入上游引物3（200nm）、下游引物3（200nm）、荧光探针3（150nm）。在1~13号反应管中按顺序分别加入热带念珠菌、黄色葡萄球菌、卷曲乳杆菌、詹式乳杆菌、惰性乳杆菌、支原体菌株、加德纳菌、阴道毛滴虫、白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌、乳酒念珠菌样本2ul；在14~26号反应管中按顺序分别加入光滑念珠菌、黄色葡萄球菌、卷曲乳杆菌、詹式乳杆菌、惰性乳杆菌、支原体菌株、加德纳菌、阴道毛滴虫、热带念珠菌、白色念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌、乳酒念珠菌的样本2ul；在27~34号反应管中按顺序分别加入白色念珠菌、黄色葡萄球菌、卷曲乳杆菌、詹式乳杆菌、惰性乳杆菌、支原体菌株、加德纳菌、阴道毛滴虫、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌、乳酒念珠菌样本2ul。各反应管均用灭菌水补足体系到45ul，振荡混匀后各管再分别加入5ul启动液（各管的终体积为50ul）。选择荧光定量pcr仪进行扩增及收集荧光，具体上机条件为：37℃，30s，30个循环，每个循环都搜集荧光，结果如图4。实施例5（热带念珠菌重复性实验）：按实施例1配制体系6管，分别标记反应管1~6。在反应管1~6中加入上游引物1（200nm）、下游引物1（200nm）、荧光探针1（150nm）。在反应管1~3中均加入热带念珠菌样本2ul，在反应管4~6中加入阴性对照样本2ul。各反应管均用灭菌水补足体系到45ul，振荡混匀后各管再分别加入5ul启动液（各管的终体积为50ul）。选择荧光定量pcr仪进行扩增及收集荧光，具体上机条件为：37℃，30s，30个循环，每个循环都搜集荧光，结果如图5。实施例6（光滑念珠菌重复性实验）：按实施例1配制体系6管，分别标记反应管1~6。在反应管1~6中加入上游引物2（200nm）、下游引物2（200nm）、荧光探针2（150nm）。在反应管1~3中均加入光滑念珠菌样本2ul，在反应管4~6中加入阴性对照样本2ul。各反应管均用灭菌水补足体系到45ul，振荡混匀后各管再分别加入5ul启动液（各管的终体积为50ul）。选择荧光定量pcr仪进行扩增及收集荧光，具体上机条件为：37℃，30s，30个循环，每个循环都搜集荧光，结果如图6。实施例7（白色念珠菌重复性实验）：按实施例1配制体系6管，分别标记反应管1~6。在反应管1~6中加入上游引物3（200nm）、下游引物3（200nm）、荧光探针3（150nm）。在反应管1~3中均加入白色念珠菌样本2ul，在反应管4~6中加入阴性对照样本2ul。各反应管均用灭菌水补足体系到45ul，振荡混匀后各管再分别加入5ul启动液（各管的终体积为50ul）。选择荧光定量pcr仪进行扩增及收集荧光，具体上机条件为：37℃，30s，30个循环，每个循环都搜集荧光，结果如图7。实施例8（热带念珠菌和光滑念珠菌混合感染检测）：按实施例1配制体系6管，分别标记反应管1~6。在反应管1、2中加入上游引物1（200nm）、下游引物1（200nm）、荧光探针1（150nm）；在反应管3、4中加入上游引物2（200nm）、下游引物2（200nm）、荧光探针2（150nm）；在反应管5、6中加入上游引物3（200nm）、下游引物3（200nm）、荧光探针3（150nm）。在反应管1、3、5中均加入热带念珠菌和光滑念珠菌菌混合感染样本2ul；在反应管2、4、6中均加入阴性对照样本2ul。各反应管均用灭菌水补足体系到45ul，振荡混匀后各管再分别加入5ul启动液（各管的终体积为50ul）。选择荧光定量pcr仪进行扩增及收集荧光，具体上机条件为：37℃，30s，30个循环，每个循环都搜集荧光，结果如图8。实施例9（热带念珠菌和白色念珠菌混合感染检测）：同实施例8，不同处是往反应管1、3、5中均加入热带念珠菌和白色念珠菌混合感染样本2ul。选择荧光定量pcr仪进行扩增及收集荧光，具体上机条件为：37℃，30s，30个循环，每个循环都搜集荧光，结果如图8。实施例10（光滑念珠菌和白色念珠菌混合感染检测）：同实施例8，不同处是往反应管1、3、5中均加入光滑念珠菌和白色念珠菌混合感染样本2ul。选择荧光定量pcr仪进行扩增及收集荧光，具体上机条件为：37℃，30s，30个循环，每个循环都搜集荧光，结果如图10。结论：1.从图1的结果可以看出，对应的病原体样本扩增结果都有“s”型扩增曲线，说明本发明试剂盒的恒温扩增效果好。2.从图2、3的结果可以看出，即使不是在最适温度下进行扩增反应，仍然得到稳定的阳性结果，说明本发明试剂盒的容错率高、稳定性强。3.从图4的结果可以看出，非本试剂盒检测范围内的其他阴道内微生物（金黄色葡萄球菌、卷曲乳杆菌、詹式乳杆菌、惰性乳杆菌、支原体菌株、加德纳菌、阴道毛滴虫、近平滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌、乳酒念珠菌）不会产生假阳性结果，且本试剂盒可检测的热带念珠菌、光滑念珠菌、白色念珠菌的检测相互之间不产生干扰，说明本试剂盒的特异性强。4.从图5、6、7的结果可以看出，对热带念珠菌和光滑念珠菌、白色念珠菌进行了重复实验，均得到相应的“s”型扩增曲线，说明本试剂盒的灵敏度高。5.从图8、9、10的结果可以看出，混合感染型的样本中不同致病病原体相互之间不造成干扰，检测结果无误，说明本试剂盒的特异性好、稳定性强。综上，本发明试剂盒的扩增效果好，特异性强，容错率高，稳定性强，灵敏度高。sequencelisting<110>广州和实生物技术有限公司<120>一种念珠菌基因分型即时检测试剂盒<130>2016<160>9<170>patentinversion3.5<210>1<211>24<212>dna<213>人工序列<400>1tcaacaacggatctcttggttctc24<210>2<211>34<212>dna<213>人工序列<400>2aattgtggtggccactagcaaaataagcgttttg34<210>3<211>47<212>dna<213>人工序列<400>3catcgatgaagaacgcagcgaaatgcgatagtaatrtgaattgcaga47<210>4<211>24<212>dna<213>人工序列<400>4aactttcaacaacggatctcttgg24<210>5<211>37<212>dna<213>人工序列<400>5tcaacaccgagttggtaaaacctaatacagtattaac37<210>6<211>36<212>dna<213>人工序列<400>6cgtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgccc36<210>7<211>25<212>dna<213>人工序列<400>7atcgaatctttgaacgcacattgcg25<210>8<211>34<212>dna<213>人工序列<400>8atatacgtggtggacgttaccgccgcaagcaatg34<210>9<211>46<212>dna<213>人工序列<400>9catcgatgaagaacgcagcgaaagcatacgtaatrtgaattgcaga46当前第1页12