本公开涉及生物技术领域，具体地，涉及一种植物病害生物防治菌株的筛选方法。
背景技术：
环境污染和农产品农药残留超标是当前社会普遍关注的重要和热点问题，对人民生活具有重要影响。应用微生物菌株防治农作物病虫害是减轻环境污染，生产有机、绿色食品的有效途径。但目前能够大规模应用的生物农药或技术明显不够，还不能满足国家替换或大量减少化学农药施用的需求。高效生物防治菌株是大规模应用的生物农药创制的关键，因此，快速有效地筛选获得能够开发应用的生物防治菌株的技术或方法具有重要价值。
目前对于植物病害生物防治菌株的筛选，国内外一般都采用离体抑菌作用作为初筛，然后再通过盆栽防病试验进行复筛，再通过田间试验进行再筛确定。该筛选程序的最大优点是初筛简单、快速、成本低。但是大量筛选的实践证明，初筛结果与盆栽试验结果、田间实验结果相关性不强。主要表现在初筛抑菌效果好的菌株，盆栽试验、田间试验效果并不一定好，甚至没有效果。而有的离体抑菌效果不好或没有效果的菌株，盆栽试验、田间试验效果反而很好。导致这些结果的原因研究发现与菌株在环境中的定殖能力密切相关，离体拮抗效果好的菌株，有些在环境中的定殖并不好，导致防病效果不好。另外，近年研究发现，有些菌株具有诱导植物抗病的能力，这就涉及到了植物、生防菌、病原菌三者之间的关系，离体筛选只涉及到生防菌与病原菌二者之间的关系，故不能很好地反映出生防菌株的防治潜力。基于以上原因，有些研究者提出采用盆栽试验代替离体筛选，该方法筛选获得的菌株一般与田间试验效果相关性较好。但是，盆栽试验工作量大，试验时间长，对于大量菌株的筛选并不适用。因为现在要获得一株具有开发应用潜力的菌株，通常需筛选成千上万株候选菌株，故该方法不能满足大量筛选的要求。因此，研究开发出能够简便、快速的生物防治菌株筛选方法具有重要价值。
技术实现要素：
本公开的目的是提供一种植物病害生物防治菌株的筛选方法，该方法可以简便快速地筛选出生物防治潜力菌株。
为了实现上述目的，本公开提供了一种植物病害生物防治菌株的筛选方法，所述筛选方法包括如下步骤：s1.于27-29℃将植物种子置于清水中浸泡3-5小时；同时培养生物防治候选菌株获得新鲜的细菌菌液或者真菌孢子；s2.将所述浸泡后的植物种子使用1-2％羟甲基纤维素钠(w/v)胶体处理后稍干燥，所述干燥后的植物种子蘸取所述生物防治候选菌株的细菌菌液或者真菌孢子液，将所述带有菌液或者孢子液的植物种子于铺有纱布的培养皿中27-29℃培养至长出子叶和根，然后光照培养得到备用植物幼苗；s3.将所述植物幼苗移植到灭菌培养基中培养，培养40-50小时后接种植物病害病原菌继续培养15-25天；然后根据植物病害的发生发展情况来筛选防效较高的生物防治菌株。
通过上述技术方案，本公开提供的生物防治菌株的筛选方法可以有效减少菌株筛选的工作量，同时筛选大批量的菌株并且简便可靠，通过本公开方法筛选出的高防效菌株在盆栽试验中的防治效果普遍较好，具有开发应用的潜力。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
具体实施方式
以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
本公开提供了一种植物病害生物防治菌株的筛选方法，所述筛选方法包括如下步骤：s1.于27-29℃将植物种子置于清水中浸泡3-5小时；同时培养生物防治候选菌株获得新鲜的细菌菌液或者真菌孢子；s2.将所述浸泡后的植物种子使用1-2％羟甲基纤维素钠(w/v)胶体处理后稍干燥，所述干燥后的植物种子蘸取所述生物防治候选菌株的细菌菌液或者真菌孢子液，将所述带有菌液或者孢子液的植物种子于铺有纱布的培养皿中27-29℃培养至长出子叶和根，然后光照培养得到备用植物幼苗；s3.将所述植物幼苗移植到灭菌培养基中培养，培养40-50小时后接种植物病害病原菌继续培养15-25天；然后根据植物病害的发生发展情况来筛选防效较高的生物防治菌株。
通过上述技术方案，本公开提供的生物防治菌株的筛选方法可以有效减少菌株筛选的工作量，同时筛选大批量的菌株并且简便可靠，通过本公开方法筛选出的高防效菌株在盆栽试验中的防治效果较好，具有开发应用的潜力。
优选地，为了使菌株具有较好的活力，有利于菌株的存活，步骤s1中，所述新鲜的细菌菌液为于26-30℃的液体培养基中100-300rpm振荡培养1-3天的候选生物防治细菌菌液，所述新鲜的真菌孢子为通过将候选生物防治真菌接种于pda培养基上并直接收集产生的孢子得到的。
优选地，步骤s3中，所述灭菌培养基为半量ms培养基，该培养基适合于植物幼苗的生长，适用于本筛选方法。
优选地，步骤s3中，所述培养温度为25-28℃，该温度下有利于植物幼苗的生长和病害的发生、发展。
优选地，所述植物病害病原菌为真菌，本公开所述的生物防治菌株的筛选方法尤其适用于植物病害病原菌为真菌的情况。
优选地，所述真菌为于27-29℃且液体培养基中100-200rpm振荡培养2-4天的植物病原真菌。
优选地，所述液体培养植物病原真菌的用量为每试管苗1-2ml，有利于生物防治菌株的筛选。
优选地，所述植物为黄瓜；更优选地，所述黄瓜为中农6号。中农6号品种的黄瓜植株是易感黄瓜枯萎病的黄瓜品种，发病症状明显，有利于生物防治菌株的筛选。
优选地，所述植物病害病原菌为黄瓜枯萎病菌。
下面通过实施例进一步阐述本公开，但是需要理解的是本公开并不因此受到限制。
本公开中所使用黄瓜枯萎病菌(fusariumoxsporum)菌株来源于感染了黄瓜枯萎病菌的黄瓜植株。选取黄瓜枯萎病症状明显的黄瓜植株根茎部，切取病健交界部小块组织培养分离纯化得到黄瓜枯萎病菌株，对其进行致病性试验发现该黄瓜枯萎病菌株的致病性极强，用于本公开中生物防治菌株的筛选。
实施例1
本实施例为本公开筛选方法用于黄瓜枯萎病(f.oxsporum)的生物防治菌株的筛选，黄瓜枯萎病菌(f.oxsporum)为黄瓜的致病性真菌。本实施例中所述生物防治候选菌株共300株，分为3次筛选，每次100株；所用的筛选植物为黄瓜，品种为中农6号(购自中国农业科学院蔬菜花卉研究所公司)。其具体步骤如下：
将中农6号的黄瓜种子温水洗净后，于28℃将黄瓜种子在清水中浸泡4小时；在种子浸泡期间，培养生物防治候选真菌菌株获得新鲜的真菌孢子；所述黄瓜枯萎病生物防治候选真菌菌株300株，分别使用菌块接种于pda固体培养基上培养7天至产孢备用。
将经过清水浸泡后的黄瓜种子使用1％羟甲基纤维素钠(w/v)处理后稍干燥，所述干燥后的黄瓜种子分别蘸取所述生物防治候选真菌菌株的孢子液，每菌株使用5粒黄瓜种子以重复试验减小误差；将所述带有孢子液的植物种子分别置于铺有纱布的培养皿，所述纱布和培养皿均为无菌，期间滴加灭菌水保湿；所述黄瓜种子于28℃培养4天至长出子叶和根，然后自然光照培养得到备用黄瓜幼苗。
将携带有候选生物防治菌株的各黄瓜幼苗分别移植到规格100×10mm的试管中并且在自然光下、25-28℃培养2天，试管中装有10ml半量ms培养基；然后向试管内加入1ml的黄瓜枯萎病菌菌液，所述黄瓜枯萎病菌菌液为接种黄瓜枯萎病菌于28℃、pd液体培养基中，150rpm振荡培养3天的新鲜黄瓜枯萎病菌；黄瓜幼苗接种黄瓜枯萎病菌后继续于28℃、自然光照的条件下培养20天。以不接种病原菌和生物防治候选菌株的黄瓜幼苗作为对照1，接种病原菌但不接种生物防治候选菌株的黄瓜幼苗作为对照2。
调查接种了不同生物防治候选菌株的黄瓜幼苗的病情分级，各黄瓜幼苗病情分级如表1所示；根据接种某菌株的黄瓜幼苗病情分级计算接种该菌株的黄瓜幼苗病情指数，病情指数的计算如式(1)所示，根据病情指数计算每个生物防治候选菌株的相对防治效果，相对防治效果的计算见式(2)，筛选出茎叶部分和根部分的相对防治效果均高于50％的菌株作为生物防治潜力菌株，筛选结果见表2所示。
病情指数＝[100×∑(各级病株数×该病情分级值)]/(5×5)式(1)
表1
表2
经表2可以看出，本公开的筛选方法可以排除多数不具有开发价值的菌株，从候选菌株中筛选得到相对防治效果大于50％的菌株的概率约为5％-10％。
对比例1
本对比例为离体平板抑菌筛选方法，该筛选方法为目前生物防治菌株的常用筛选方法，用于黄瓜枯萎病(f.oxsporum)的生物防治菌株地筛选，其中黄瓜枯萎病菌(f.oxsporum)为黄瓜的致病性真菌。其具体步骤如下：
将黄瓜枯萎病菌接种于pda培养基上28℃条件下培养5天，用5mm打孔器打取菌落边缘菌块；将打孔器取得的黄瓜枯萎病菌圆形菌块接种于新的pda平板距培养皿边缘1cm处，28℃条件下培养3天后在黄瓜枯萎病菌圆形菌块正对面距培养皿边缘1cm处接种实施例1中的300株候选生物防治真菌菌株，继续于28℃培养5天。观察候选各生物防治真菌菌株是否抑制黄瓜枯萎病菌生长；若候选菌株抑制了黄瓜枯萎病菌的生长，测量病原菌菌落半径(mm)。对照组仅接种黄瓜枯萎病菌。以上试验重复3次。离体抑菌效果的计算见式(3)，其中离体抑菌效果表示为抑制率(％)。生物防治候选菌株的筛选结果见表3。
表3
经表3可以看出，离体平板抑菌筛选方法筛选得到拮抗作用达到50％以上的候选菌株的概率达到30-40％，然而实际上在长期的研究中发现，随机筛选得到生物防治菌株的比例不可能达到30-40％，也就是离体平板抑菌筛选方法排除不具有生物防治效果的菌株的效果并不好。
测试实施例1
本测试实施例用于测试实施例1与对比例1中筛选得到的生物防治菌株在盆栽试验中的防治效果以及实施例1与对比例1中筛选方法的相关性。
(1)盆栽试验验证实施例1和对比例1筛选的生物防治菌株的效果。将实施例1中得到的防效大于50％的菌株，即第一批试验得到的8株、第二批试验得到的6株和第三批试验得到的6株生物防治菌株，对比例1中抑制率大于50％的菌株，即第一批得到的36株中随机选取效果最好的8株、第二批得到的40株中随机选取效果最好的6株和第三批中得到的34株中随机选取效果最好的6株生物防治菌株用于盆栽防病试验，检测筛选得到的生物防治菌株对黄瓜枯萎病的防治效果。盆栽试验可采用本领域技术人员常规使用的盆栽试验方法，具体可参照中华人民共和国农业行业标准ny/t1156.7-2006《农药室内生物测定试验准则杀菌剂第7部分防治黄瓜霜霉病试验盆栽法》进行。同时以仅接种病原菌黄瓜苗作为对照组，防效的计算见式(4)。具体结果见表4。
表4
经表4中实施例1与对比例1中的生物防治菌株在盆栽试验中的防治效果可以看出，对比例1中的筛选方法筛选得到的生物防治菌株用于盆栽试验的防治效果并不好，也就是说对比例1中筛选得到的菌株与盆栽试验的结果相关性不高，这对于开发具有实际使用价值的生物农药来说是不利的。而本公开筛选方法筛选得到的菌株与盆栽试验的结果相关性较好，最低防效达到了40％以上，最好的防效均达到了68.5％以上。其中，实施例1中筛选得到的相对防治效果高于70％的生物防治菌株在盆栽试验中的防治效果更好，具体结果见表5。
表5
经表5实施例1中相对防治效果达到70％的生物生物防治菌株的具有更好的防效，平均防效达到66.97％，最高防效达到78.3％。
(2)实施例1中筛选方法与对比例1中筛选方法的相关性分析。将实施例1中第一批试验得到的8株、第二批试验得到的6株和第三批试验得到的6株生物防治菌株用对比例1中的方法分析其离体抑菌效果，离体抑菌效果的计算参照对比例1。具体结果见表6。
表6
经表5中离体抑菌效果筛选与实施例1中筛选方法比较可以看出，本实施例1的筛选方法筛选得到的菌株离体抑菌效果并不好，显示实施例1的筛选方法与对比例1的筛选方法相关性不好，现有的对比例1中的生物防治菌株筛选方法存在缺陷。
本公开提供的生物防治菌株的筛选方法可以有效减少菌株筛选的工作量，同时筛选大批量的菌株并且简便可靠，通过本公开方法筛选出的高防效菌株在盆栽试验中的防治效果较好，具有开发应用的潜力。
以上详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。