一种高效烟草花粉活力检测方法与流程

本发明涉及一种高效烟草花粉活力检测方法，属于烟草良种繁育技术领域。

背景技术：

在烟草杂交制种中，通常需要早期采集父本花粉，经过一段时间储藏，当花粉需求量较大时，可保障花粉的充足供应；或为了减少父本种植量，当年采集的花粉经低温干燥储藏可多年使用，经过长期储藏的花粉在使用之前，都必须做花粉活力检测，花粉活力鉴定方法的选择显得至关重要。

据资料报道，花粉活力鉴定方法主要分三类：一类是染色法，如氯化三苯基四氮唑(ttc)染色法、碘钾(i-ki)染色法、荧光染色法、甲基兰染色法等；二类是花粉离体萌发测定法，如葡萄糖花粉萌发培养法、蔗糖花粉萌发培养法等；三类是花粉授粉结实检测法。碘钾(i-ki)染色法、荧光染色法由于能使未成熟和衰老的花粉着色，而这些花粉不一定具有受精能力，致使花粉活力测定值偏高；花粉授粉结实检测法是根据结实情况判断花粉活性，结果比较准确，但由于授粉到每个柱头的花粉量较多，无法定量判断花粉的活力；花粉离体萌发培养检测花粉活力是目前得到认可的较为准确的检测方法。

烟草花粉活力是指烟草花粉在特定条件下进行离体培养能够萌发并形成有效花粉管(花粉管长度在花粉粒直径1倍以上)，试验过程中发现在花粉离体培养液中添加适宜浓度的硼酸和钙离子能有效促进花粉管的形成。烟草花粉活力用百分数表示，即所检测花粉能形成有效花粉管的花粉粒数占总花粉粒数的百分比。

技术实现要素：

本发明提供一种高效烟草花粉活力检测方法。采用该方法，可以快速准确检测烟草花粉活力，在烟草杂交制种过程中，为花粉的采集、储藏利用提供技术保障。

技术方案具体步骤如下：

1)花粉萌发培养液的配制：分别取蔗糖100g、硼酸150mg、氯化钙20mg分别用蒸馏水溶解，定溶于1l的定溶瓶中备用；或取葡萄糖30g、硼酸50mg、氯化钙20mg用蒸馏水溶解，定溶于1l的定溶瓶中备用。两种配方可任选其一。

2)载玻片的制作：取1-2滴培养液滴于凹形载玻片上，将少量待检花粉与培养液均匀混合，盖上盖玻片。每批次制作三个载玻片。

3)花粉萌发培养：将步骤2)中载玻片，放入垫有湿滤纸的培养皿，再将培养皿置于25℃恒温培养箱内，暗箱保湿培养3h。

4)花粉活力观察：将步骤3)中载玻片置于三目生物显微镜下观察，显微倍数为100倍。每次观察4个视野，在每个视野内分别统计花粉粒总数和能够萌发并生长出有效花粉管的花粉粒数。

5)花粉活力统计：计算步骤4)中每个载玻片各个视野观察到的能够萌发并生长出有效花粉管的花粉粒数的总和占各个视野观察到的花粉粒数总和的百分比，即得到每个载玻片的花粉活力，计算3个载玻片的花粉活力的平均值，即得到该批次烟草花粉活力。计算公式为：

每个载玻片花粉活力％＝(∑每个视野能够萌发并生长出有效花粉管的花粉粒数/∑每个视野花粉粒总数)×100。

每批次花粉的花粉活力％＝∑每个载破片花粉活力/3。

本发明方法中，花粉萌发是指花粉在培养过程中能够形成有效花粉管，花粉管的长度须达花粉粒直径1倍以上，花粉管长度小于花粉粒直径即视为无花粉活力。花粉活力分为4个级别：

花粉活力差：≤40％。

花粉活力较差：＞40％，≤60％。

花粉活力中等：＞60％，≤80％

花粉活力强：＞80％。

有益效果

(1)以本发明方法检测烟草花粉活力，可以快速准确检测花粉活力大小。

(2)经本发明检测的花粉可以保障花粉的质量，提高杂交制种的座果率，排出因花粉质量问题造成制种产量损失的可能。

(3)本发明较其他检测方法便于观察计数，结果准确可靠，优势更明显。

本发明适用于烤烟、白肋烟、马里兰烟等烟草花粉活力检测。

附图说明

图1是ttc染色法花粉粒染色显微镜观察图。

图2是实施例中各处理方法的花粉活力柱形图。

图3是10％蔗糖+150mg/l硼酸+20mg/cacl2培养花粉粒萌发显微镜观察图。

图4是3％葡萄糖+50mg/l硼酸+20mg/cacl2培养花粉粒萌发显微镜观察图。

图中，1为着色具有活力的花粉粒，2为未着色无活力的花粉粒，3为正常萌发并能形成有效花粉管的花粉粒，4为未萌发无活力的花粉粒。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的实施方式不限于此。下述实施方式中所使用实施步骤如无特殊说明，均为常规方法。

共设15种不同的花粉检测鉴定方法以及不同的培养时间、培养温度(处理设计方法见表1.)。供试材料为burley37新鲜花粉，每处理设三次重复，每重复观察4个视野。

表1不同花粉检测鉴定处理方法

按照不同的处理方法，分别配制培养液，制作载玻片，恒温保湿暗箱培养，在三目生物显微镜下观察，每个载玻片观察4个视野，统计各处理方法的花粉活力。

ttc染色法是利用有活性花粉粒在呼吸作用过程中产生的nadh2或nadph2将无色的ttc还原成红色的ttf而使花粉粒染成红色，无活力的花粉呼吸作用较弱，ttc的颜色变化不明显，不能使花粉粒着色，见图1。ttc染色法更适用于新鲜花粉的活力检测，对于过分干燥或经长期干燥低温保存的花粉其花粉呼吸作用较弱，染色效果不理想。其特点是简便快捷，但重复性差，色度的深浅不易分辨，影响对花粉活力的判断。

葡萄糖及蔗糖萌发发芽检测法是比较可靠和准确的烟草花粉活力鉴定方法，但需要加入适宜浓度的硼酸和钙离子，以促进花粉管的形成，判定花粉活力。在未加入硼酸和钙离子的葡萄糖及蔗糖溶液中培养花粉，只能使花粉粒的萌发孔形成小凸起，或花粉粒膨胀后破裂，内容物溢出，形成花粉管的数量较少，无法判定花粉真实活力。

从上述实验结果(见图2)可以看出，处理a(ttc法)检测新鲜花粉活力较高，可达74.8％，比较接近实际新鲜花粉活力水平，但实验的重复性差，着色深浅不易分辨，按照此方法检测出的花粉活力可信度不高；处理n、o两种方法检测新鲜花粉活力可达86.8％、91.3％，与实际新鲜花粉活力非常相近，实验结果认为采用该两种处理方法检测出的花粉活力可信度高。其余方法检测出新鲜花粉活力在6.6％-45.4％之间，与实际新鲜花粉活力水平相差较大，其检测结果准确性差。

综合分析实验结果，培养液采用10％蔗糖+150mg/l硼酸+20mg/cacl2(见图3)或3％葡萄糖+50mg/l硼酸+20mg/cacl2(见图4)，制作载玻片，在25℃恒温培养箱内，暗箱保湿培养3h的处理方法是鉴定花粉活力最好，最可靠的方法。

上述实施例仅为本发明的较佳方式，凡采用本发明申请专利范围所做的等同替换或均等变化应属本发明的涵盖范围。