一种应用于高通量测序同时检测T细胞和B细胞免疫组库的引物组合及试剂盒的制作方法

本发明属于分子生物学领域，特别是涉及一种应用于高通量测序同时检测t细胞和b细胞免疫组库的引物组合及试剂盒。
背景技术：
：t、b细胞基因座上大量的v(可变区)、d(多变区)、j(连接区)基因片段在t、b细胞受体的形成中会产生各种多样性重组。这种v-d-j基因的重组赋予了每一种t、b细胞自己独特的t、b细胞受体(tcr、bcr)，从而使得每一个tcr和bcr的序列能有效的成为一个t、b细胞克隆的唯一生物标志物。由于tcr和bcr基因的最大特点是v、d、j基因片段的随机重组，所以，针对未知基因序列，很难设计一个上游引物用于识别tcr、bcr基因的5’端序列，所以也无法利用pcr技术扩增tcr、bcr基因和测序。而另外一种tcr测序方法，多重引物pcr的方法，只能测序tcr基因中的部分序列信息，这样使得测序基因信息不完整。另外，多重引物pcr方法的引物是根据已知v，j基因设计的，这种测序结果只局限于野生型的已知基因。但在癌症病人中，癌细胞的基因突变是很常见的，如果白血病癌细胞的bcr或tcr产生了突变，那么已知序列的引物就有可能无法识别突变后的基因，对检测结果来说，就容易造成假阴性。并且，多重引物pcr的免疫组库测序方法，仅仅对tcr或者bcr测序，就已经需要几十对的引物，如果同时检测tcr和bcr的话，庞大的引物数量会让整个pcr扩增的效率和特异性变得很差。所以，目前还没有一个技术可以在一次实验操作中同时检测tcr和bcr，利用我们的方法(单对引物法)可以同时检测多个样本的tcr和bcr，节约实验时间和试剂、人工成本。该技术可以应用在免疫基因组学的研究中，不仅能够检测淋巴恶性肿瘤治疗后的微小残留病，还能够评判hsc移植后的免疫重建、食物过敏、免疫性疾病的检测等等。技术实现要素：为了解决以上技术问题，本发明提供一种应用于高通量测序同时检测t细胞和b细胞免疫组库的引物组合及试剂盒，基于高通量测序同时构建t细胞受体和b细胞受体文库构建的cdna接头和单对引物，通过从接头的上游引物到c区的下游引物，同时获得tcr和bcr基因序列的全长信息。本发明中引物组合能有效的扩增tcr基因的全序列，使tcr二代测序文库构建效率高效。试剂盒为用户提供了简单便捷的使用方法，效率稳定。能同时完成tcr和bcr的建库，建库的对象和组合(不同的链)。解决以上技术问题的一种应用于高通量测序同时检测t细胞和b细胞免疫组库的引物组合，其特征在于：所述引物组合包括xcr3’oligo(dt)引物，xcr5’oligo接头，xcr5’端接头引物，tcr-alpha链c区引物，tcr-beta链c区引物，bcr-heavy链c区引物中的iga、igg和igm，bcr-light链c区引物中的kappa和lambda，以及标签上下游引物；每种引物序列如下：xcr3’oligo(dt)引物：5’ttttttttttttttttttttga3’；xcr5’oligo接头：5’atgcatcggatcttcagcatgaacttrgrgrg3’；xcr5’端接头引物：5’gtctcgtgggctgggcgatgtgtatgagagacagcatgcatcggatcttcagcatga3’；tcr-alpha链c区引物：5’tcgtcgccagcgtcggaagtgtataagagacagtctcagctggtacatatcgatgtcagggt3’；tcr-beta链c区引物：5’tcgtcgccagcgtcggaagtgtataagagacagtcgcagcgtcagatgtgtataagagacag3’；bcr-heavy链c区引物：iga：5’tacgcgatatcgctctgcgctaactagtcgtactaggctcctgggttccgaagcc3’；igg：5’tacgcgatatcgctctgcgctaactagtcgtactagcgcctgagaaggacgacac3’；igm：5’tacgcgatatcgctctgcgctaactagtcgtactaggggaattcttctgggagac3’；bcr-light链c区引物：kappa:5’tacgcgatatcgctctgcgctaactagtcgtactaccttccactctatattggcctc3’；lambda:5’tacgcgatatcgctctgcgctaactagtcgtactagccactgtatccgctcccggg3’；标签上游引物：5’caagcagaagacggcatacgagat[index1]gtctcgtgggctgg3’；标签tcr下游引物：5’aatgatacggcgaccaccgagatctacac[index2]tcgtcgccagcgtc3’；标签bcr下游引物：5’aatgatacggcgaccaccgagatctacac[index3]tacgcgatatcgct3’；其中，所述index1为atctatcg、tcaggtga、cactagtt、gaattgcc、atgtacaa、gattcagt、ctgttcgt或tatacggc中的一种；index2为tagctact、attatagc、cccgtact、gggtataa、agcaggtg、tatacgta、cacctagt或gttgctac中的一种；index3为taatcgct、atattacc、cctatact、ggatgaaa、agtctttg、tagtggta、cacgatgt或gtatgaac中的一种；本发明中的一种应用于高通量测序同时检测t细胞和b细胞免疫组库的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含有如权利要求1或2所述的引物组合。本发明中的优化方案中所述试剂盒还包括pcr缓冲液、q5high-fidelity2xmastermix、去核酸酶水、ampurexpbeads和70％乙醇。进一步优化方案中，所述试剂盒包括：(1)pcr缓冲液：9.5μl；(2)阳性对照rna(1μg/μl)：10μl；(3)10μmtcr3’oligo(dt)引物：1.1μl；(4)10μmtcr5’端接头引物：2.2μl；(5)10μmtcrc区引物和10μmbcrc区引物：各1.1μl；(6)q5high-fidelity2xmastermix：55μl；(7)10μm标签上游引物：2.2μl；(8)10μmtcr标签下游引物和10μmbcr标签下游引物：各1.1μl；(9)去核酸酶水：105μl；(10)ampurexpbeads：88μl；(11)70％乙醇：165μl。所述pcr缓冲液由以下体系组成：试剂盒的制备为购买原料，然后组装成试剂盒。按照所需要比例，装入试管，封装成试剂盒。比如一个试剂盒可以分为做96个样本，48个样本两种规格等等。利用本发明中的引物组合及试剂盒，从而高通量测序同时检测t细胞和b细胞免疫组库，检测方法包括如下步骤：(1)获取人血液样本10ml于edta抗凝管；(2)利用淋巴细胞分离液ficoll-1077(美国sigma公司#10771)进行外周血单核细胞(pbmc)的分离；淋巴细胞分离液的作用在于可以从全血里分离淋巴细胞，因为t细胞为我们检测对象，t细胞属于淋巴细胞的一种，分离后的细胞群所获得的rna是除去了红细胞、血小板等细胞的rna的。所以建库使用的总rna内含t细胞rna模板纯度更高。(3)利用trizol的方法提取pbmc的总rna，所用试剂为rnazolrt(美国mrc公司#rn190)；trizol的方法提取rna,步骤如下：收获细胞，转移入1.5ml离心管中，加入1mltrizol，混匀，室温静置5min。加入0.2ml氯仿，振荡15s，静置2min。加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。4℃离心，12000g×10min，弃上清。加入1ml75％乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃离心，7500g×5min，弃上清。自然风干，加入50ul的depch2o溶解，得到淋巴细胞总rna。(4)rna反转录成cdna，并同时在cdna5’端添加接头,用于后面pcr扩增时5’端引物结合；在反转录时，同时添加接头，可以最小化rna在多步反应过程中的丢失。rna在操作中稳定性极差，非常容易降解，少量的步骤可以最大程度上减少降解，同时也节约了可用于扩增的cdna制备时间。接头即cdna5‘端的核酸接头,xcr5’oligo接头。(5)pcr1:通过1条上游引物、2条或2条以上的下游引物的方式扩增重组tcr和bcrcdna；(6)pcr2和纯化：为pcr1产物(扩增后的tcr序列)添加illumina高通量测序仪的上机接头和标签，同时为增加更多的上机基因量再次扩增；pcr反应结束后，利用磁珠进行dna纯化。pcr产物一般都含有过量的引物、taqdna酶及dntp。这些成分的存在将直接影响到后续的文库质检、测序反应等过程，纯化可以去除这些影响后续实验的副产物。同时，纯化的过程也是一个片段大小筛选的过程，本发明中的dna片段是在700bp左右，可利用不同体积的磁珠与pcr产物混合，磁珠/dna不同的体积比例可以吸附不同大小的片段，利用上述磁珠体积，可以成功去掉pcr扩增时的错误(误差)片段和引物双聚体，让我们的测序上机文库只有我们的测序目标dna片段，使得测序结果更加准确，减少误差。如图3所示，通过文库质检只发现了一个片段的峰。(7)进行高通量测序：将所得的cdna文库通过illuminamiseq平台进行测序，测序模式为pe300，文库变性浓度为2nm，上机浓度为20pm，并通过生物信息学分析高通量测序结果；通过本发明的xcr5’端接头、pcr引物以及测序文库制备方法获得的上百万条的tcr和bcr序列，该技术可以应用在免疫基因组学的研究中，不仅能够检测淋巴恶性肿瘤治疗后的微小残留病，还能够评判hsc移植后的免疫重建、食物过敏、免疫性疾病的检测等等。本发明中所述步骤(4)中按照以下比例混合每一个rna样本：试剂体积1x(μl)，rna8，tcr3’oligo(dt)引物(10μm)1，孵化于72℃3分钟，接着4℃1分钟。按照以下比例制备pcr反应缓冲液混合pcr反应缓存液与rna样本，按照下面反应程序开始cdna反转录42℃60分钟70℃10分钟4℃永久反应结束后，就可获得已在5’端添加了接头的总cdna(如图1)。所述步骤(5)中具体步骤如下：按照以下比例制备反应体系：按照上述的反应体系制备反应体系，混合上述5样试剂于pcr试管，混匀，离心数秒，把管壁上的液体残留离心于管底。放置试管于pcr扩增仪中，按照上述反应程序开始运行。所述步骤(5)中pcr1反应程序为:95℃3分钟；95℃30秒；65℃1分钟，25循环；72℃1分钟；4℃永久。所述步骤(6)中具体步骤如下：按照以下比例制备反应体系：所述步骤(6)中pcr2反应程序为:94℃3分钟；94℃30秒；55℃30秒，18循环；72℃20分钟，72℃1分钟，4℃永久。所述步骤(6)中具体纯化步骤如下：(1)添加80μlampurexpbeads进入pcr2反应产物，混匀。(2)在室温孵化10分钟。c、放置磁珠-pcr2产物混合物试管于磁力架上，等待所有磁珠吸附于磁力架上后，用移液器吸去所有上清液，丢弃。(3)添加150μl70％乙醇于磁珠上，孵化30秒，用移液器吸去所有上清液，丢弃。(4)重复第四步2次。(5)打开试管盖，等待5分钟，待磁珠风干，没有任何乙醇残留于试管内。(6)把试管从磁力架上取下，并添加50μl去核酸酶水，利用移液器吹打悬浮磁珠。(7)把试管放回磁力架，等待所有磁珠都吸附于磁力架后，转移上清液于新的试管中。上清液里就包含了纯化之后的pcr2产物。本发明基于高通量测序技术，tcr测序单对引物的文库构建方法，通过在获得t细胞rna后，在进行rna至cdna反转录的同时，给cdna的5’端添加一个接头，从而通过这个已知序列的接头设计tcr扩增上游引物，再配合tcr基因3’端c区基因(不变区)设计下游引物，从而达到扩增整个tcr序列全长基因的目的。因此，提供一种基于高通量测序技术同时构建t细胞受体和b细胞受体检测手段是十分有意义的，有效的节约实验时间和试剂、人工成本。本发明提供基于高通量测序同时构建tcr和bcr文库的接头，引物及方法的有益效果为：同时获得了人tcr(alpha链或beta链)和bcr(heavy链或light链)全基因序列；本发明在高通量测序平台的基础上，通过同时对人tcr和bcr基因测序结果进行全面的生物信息学分析，获得了tcr和bcr在vdj重组时的基因偏好性，vdj基因组合信息，免疫组克隆种类信息，免疫组多样性信息，免疫组的所有cdr1、cdr2、cdr3的核酸序列和氨基酸序列信息，基因上的突变信息，等。正是这些因素形成数量庞大且种类多样的免疫组库。附图说明图1本发明中rna反转录cdna示意图图2为本发明中利用两次pcr扩增tcr和bcrcdna并添加测序上机接头示意图图3为本发明中测序文库质检结果。图4为本发明中tcr测序结果进行生物信息学分析比对，找出每条序列的信息(部分)图5为本发明中bcr测序结果进行生物信息学分析比对，找出每条序列的信息(部分)具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细描述，引物是通过美国invitrogen公司合成的:实施例1利用本发明中的引物组合及试剂盒进行高通量测序检测，从而同时检测t细胞受体和b细胞受体，具体步骤包括如下步骤：(一)获取人血液样本10ml于edta抗凝管；(二)利用淋巴细胞分离液ficoll-1077(美国sigma公司#10771)进行外周血单核细胞(pbmc)的分离；(三)利用trizol的方法提取pbmc的总rna，所用试剂为rnazolrt(美国mrc公司#rn190)；(四)利用2.0fluorometer(美国thermofisherscientific公司#q32866)，配合rnahsassaykit试剂盒(美国thermofisherscientific公司#q32852)测定rna浓度，然后用于反转录rna；(五)rna反转录成cdna，并在cdna5’端添加接头用于后面pcr扩增时5’端引物结合，具体步骤如下，所使用到的试剂：xcr3’oligo(dt)引物(10μm)5x反转录缓冲液(250mmtris-hcl(ph8.3),375mmkcl,15mmmgcl2)二硫苏糖醇，dtt(20mm)美国thermoscientific#r0861dntpmix(10mm)美国invitrogen#18427088rnaseout(40u/μl)美国invitrogen#10777019xcr5’oligo接头(10μm)superscriptiirt(200u/μl)美国invitrogen#18064022按照以下比例混合每一个rna样本：试剂体积1x(μl)rna8xcr3’oligo(dt)引物(10μm)1孵化于72℃3分钟，接着4℃1分钟。按照以下比例制备pcr反应缓冲液试剂体积1x(μl)5x反转录缓冲液3.5dtt(20mm)1dntp(10mm)1rnaseout1xcr5’oligo接头(10μm)1superscriptiirt1混合pcr反应缓存液与rna样本，按照下面反应程序开始rna反转录42℃60分钟70℃10分钟4℃永久反应结束后，就可获得已在5’端添加了接头的总cdna(如图1)(六)pcr(pcr1)。通过“单对”引物的方式，或通过1条上游引物、2条或2条以上的下游引物的方式，同时扩增重组tcr和bcrcdna，具体步骤如下：所使用到的试剂：q5high-fidelity2xmastermix(美国neb#m0492l)xcr5’端接头引物(上游引物)tcrc区引物(下游引物)bcrc区引物(下游引物)去核酸酶水(美国thermoscientificam9914g)按照以下比例制备反应体系：pcr1反应程序为:(七)pcr(pcr2)。为pcr1产物(扩增后的tcr与bcr序列)添加illumina高通量测序仪的上机接头和标签，同时为增加更多的上机基因量再次扩增。具体步骤如下：所使用到的试剂：q5high-fidelity2xmastermix(美国neb#m0492l)标签上游引物标签tcr下游引物标签bcr下游引物去核酸酶水(美国thermoscientificam9914g)按照以下比例制备反应体系：pcr2反应程序为:(八)pcr2产物纯化。上述pcr反应结束后，利用磁珠进行dna纯化，具体步骤如下：所使用到的试剂：agencourtampurexpbeads(美国beckman#a63882)具体纯化步骤如下：1.添加80μlampurexpbeads进入pcr2反应产物，混匀。2.在室温孵化10分钟。3.放置磁珠-pcr2产物混合物试管于磁力架上，等待所有磁珠吸附于磁力架上后，用移液器吸去所有上清液，丢弃。4.添加150μl75％乙醇于磁珠上，孵化30秒，用移液器吸去所有上清液，丢弃。5.重复第四步2次。6.打开试管盖，等待5分钟，待磁珠风干，没有任何乙醇残留于试管内。7.把试管从磁力架上取下，并添加50μl去核酸酶水，利用移液器吹打悬浮磁珠。8.把试管放回磁力架，等待所有磁珠都吸附于磁力架后，转移上清液于新的试管中。上清液里就包含了纯化之后的pcr2产物。(九)文库纯化结束后，利用agilent2100bioanalyzer(美国agilent公司#g2939aa)检测文库的纯度和大小，使用的试剂盒是agilentdna1000kit(美国agilent公司#5067-1504)，检测结果如图3所示，文库大小在768bp左右的范围，并且文库纯度相当高，并未见到其他非特异性扩增序列。(十)利用2.0fluorometer(美国thermofisherscientific公司#q32866)，配合dsdnahsassaykit试剂盒(美国thermofisherscientific公司#q32851)测定dna文库浓度，并送公司进行高通量测序。将所得的cdna文库通过illumina平台(美国illumina公司)进行测序，测序模式为pe300，文库变性浓度为2nm，上机浓度为20pm，并通过生物信息学分析高通量测序结果。材料及试剂说明健康自愿受试者知情同意。非特殊说明，本发明采用的试剂均为市售商品，本发明实施例采用的数据库均为公开的在线数据库。具体地，本发明反转录5’端接头序列、引物序列如下(5’-3’)：反转录步骤xcr3’oligo(dt)引物：5’ttttttttttttttttttttga3’xcr5’oligo接头：5’atgcatcggatcttcagcatgaacttrgrgrg3’pcr1步骤xcr5’端接头引物：5’gtctcgtgggctgggcgatgtgtatgagagacagcatgcatcggatcttcagcatga3’tcr-alpha链c区引物：5’tcgtcgccagcgtcggaagtgtataagagacagtctcagctggtacatatcgatgtcagggt3’tcr-beta链c区引物：5’tcgtcgccagcgtcggaagtgtataagagacagtcgcagcgtcagatgtgtataagagacag3’bcr-heavy链c区引物：iga：5’tacgcgatatcgctctgcgctaactagtcgtactaggctcctgggttccgaagcc3’igg：5’tacgcgatatcgctctgcgctaactagtcgtactagcgcctgagaaggacgacac3’igm：5’tacgcgatatcgctctgcgctaactagtcgtactaggggaattcttctgggagac3’bcr-light链c区引物：kappa:5’tacgcgatatcgctctgcgctaactagtcgtactaccttccactctatattggcctc3’lambda:5’tacgcgatatcgctctgcgctaactagtcgtactagccactgtatccgctcccggg3’。pcr2步骤标签上游引物：5’caagcagaagacggcatacgagat[index1]gtctcgtgggctgg3’标签tcr下游引物：5’aatgatacggcgaccaccgagatctacac[index2]tcgtcgccagcgtc3’标签bcr下游引物：5’aatgatacggcgaccaccgagatctacac[index3]tacgcgatatcgct3’rg＝rna核苷酸标签引物中下划线部分为illumina测序标签序列，[]内序列可更换为下表序列，用于同时检测多个样本时，利用不同的index1-index2或者index1-index3组合和生物信息学算法区分多个样本的t细胞受体(tcr)与b细胞受体(bcr)测序结果。引物设计：针对rna反转录时在5’端添加的接头序列和tcr于bcrc区基因进行分析，采用oligo7.36和primerpremier6.0对引物二聚体以及茎环错配进行分析，在5’端人工接头设置了上游引物，针对c基因下游设计反向引物，扩增tcr与bcr全长转录子区域序列，其中包含了tcr与bcr免疫组库的fr1,cdr1,fr2,cdr2,fr3,cdr3,fr4区域。采用本发明的pbmcrna5’端接头、引物以及文库构建后，高通量测序得到大约几百万条tcr和bcr序列。测序结果进行生物信息学分析(生物信息分析采用bowtie2aligner(ver.2.1.0)，tcr和bcr数据库匹配来源于国际免疫基因信息系统www.imgt.org)，部分分析比对结果如图4、5所示。通过生物信息学分析，可以准确的知道每条tcr和bcr序列的信息，氨基酸信息，条数以及所占比例。经过tcr和bcr对比分析，本发明获得了高通量测序序列tcr和bcr代表性克隆的统计分析结果，结果如图4(tcr)和5(bcr)所示。上述结果表明，利用本发明的方法同时构建tcr和bcr文库能够覆盖tcr和bcr基因的多样性信息，提高低拷贝数免疫细胞克隆的检出率和节约时间、试剂和人工成本。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表sequencelisting<110>孙涛<120>一种应用于高通量测序同时检测t细胞和b细胞免疫组库的引物组合及试剂盒<160>34<170>patentinversion3.3<210>1<211>22<212>dna<213>人工合成<220><223>xcr3’oligo(dt)引物<400>1ttttttttttttttttttttga22<210>2<211>32<212>dna<213>人工合成<220><223>xcr5’oligo接头<400>2atgcatcggatcttcagcatgaacttrgrgrg32<210>3<211>57<212>dna<213>人工合成<220><223>xcr5’端接头引物<400>3gtctcgtgggctgggcgatgtgtatgagagacagcatgcatcggatcttcagcatga57<210>4<211>62<212>dna<213>人工合成<220><223>tcr-alpha链c区引物<400>4tcgtcgccagcgtcggaagtgtataagagacagtctcagctggtacatatcgatgtcagggt62<210>5<211>62<212>dna<213>人工合成<220><223>tcr-beta链c区引物<400>5tcgtcgccagcgtcggaagtgtataagagacagtcgcagcgtcagatgtgtataagagacag62<210>6<211>55<212>dna<213>人工合成<220><223>bcr-heavy链c区引物-iga<400>6tacgcgatatcgctctgcgctaactagtcgtactaggctcctgggttccgaagcc55<210>7<211>55<212>dna<213>人工合成<220><223>igg<400>7tacgcgatatcgctctgcgctaactagtcgtactagcgcctgagaaggacgacac55<210>8<211>55<212>dna<213>人工合成<220><223>igm<400>8tacgcgatatcgctctgcgctaactagtcgtactaggggaattcttctgggagac55<210>9<211>57<212>dna<213>人工合成<220><223>bcr-light链c区引物-kappa<400>9tacgcgatatcgctctgcgctaactagtcgtactaccttccactctatattggcctc57<210>10<211>56<212>dna<213>人工合成<220><223>lambda<400>10tacgcgatatcgctctgcgctaactagtcgtactagccactgtatccgctcccggg56<210>11<211>46<212>dna<213>人工合成<220><223>标签上游引物<400>11caagcagaagacggcatacgagatatctatcggtctcgtgggctgg46<210>12<211>46<212>dna<213>人工合成<220><223>标签上游引物<400>12caagcagaagacggcatacgagattcaggtgagtctcgtgggctgg46<210>13<211>46<212>dna<213>人工合成<220><223>标签上游引物<400>13caagcagaagacggcatacgagatcactagttgtctcgtgggctgg46<210>14<211>46<212>dna<213>人工合成<220><223>标签上游引物<400>14caagcagaagacggcatacgagatgaattgccgtctcgtgggctgg46<210>15<211>46<212>dna<213>人工合成<220><223>标签上游引物<400>15caagcagaagacggcatacgagatatgtacaagtctcgtgggctgg46<210>16<211>46<212>dna<213>人工合成<220><223>标签上游引物<400>16caagcagaagacggcatacgagatgattcagtgtctcgtgggctgg46<210>17<211>46<212>dna<213>人工合成<220><223>标签上游引物<400>17caagcagaagacggcatacgagatctgttcgtgtctcgtgggctgg46<210>18<211>46<212>dna<213>人工合成<220><223>标签上游引物<400>18caagcagaagacggcatacgagattatacggcgtctcgtgggctgg46<210>19<211>51<212>dna<213>人工合成<220><223>标签tcr下游引物<400>19aatgatacggcgaccaccgagatctacactagctacttcgtcgccagcgtc51<210>20<211>51<212>dna<213>人工合成<220><223>标签tcr下游引物<400>20aatgatacggcgaccaccgagatctacacattatagctcgtcgccagcgtc51<210>21<211>51<212>dna<213>人工合成<220><223>标签tcr下游引物<400>21aatgatacggcgaccaccgagatctacaccccgtacttcgtcgccagcgtc51<210>22<211>51<212>dna<213>人工合成<220><223>标签tcr下游引物<400>22aatgatacggcgaccaccgagatctacacgggtataatcgtcgccagcgtc51<210>23<211>51<212>dna<213>人工合成<220><223>标签tcr下游引物<400>23aatgatacggcgaccaccgagatctacacagcaggtgtcgtcgccagcgtc51<210>24<211>51<212>dna<213>人工合成<220><223>标签tcr下游引物<400>24aatgatacggcgaccaccgagatctacactatacgtatcgtcgccagcgtc51<210>25<211>51<212>dna<213>人工合成<220><223>标签tcr下游引物<400>25aatgatacggcgaccaccgagatctacaccacctagttcgtcgccagcgtc51<210>26<211>51<212>dna<213>人工合成<220><223>标签tcr下游引物<400>26aatgatacggcgaccaccgagatctacacgttgctactcgtcgccagcgtc51<210>27<211>51<212>dna<213>人工合成<220><223>标签bcr下游引物<400>27aatgatacggcgaccaccgagatctacaccacgatgttacgcgatatcgct51<210>28<211>51<212>dna<213>人工合成<220><223>标签bcr下游引物<400>28aatgatacggcgaccaccgagatctacactaatcgcttacgcgatatcgct51<210>29<211>51<212>dna<213>人工合成<220><223>标签bcr下游引物<400>29aatgatacggcgaccaccgagatctacacatattacctacgcgatatcgct51<210>30<211>51<212>dna<213>人工合成<220><223>标签bcr下游引物<400>30aatgatacggcgaccaccgagatctacaccctatacttacgcgatatcgct51<210>31<211>51<212>dna<213>人工合成<220><223>标签bcr下游引物<400>31aatgatacggcgaccaccgagatctacacggatgaaatacgcgatatcgct51<210>32<211>51<212>dna<213>人工合成<220><223>标签bcr下游引物<400>32aatgatacggcgaccaccgagatctacacagtctttgtacgcgatatcgct51<210>33<211>51<212>dna<213>人工合成<220><223>标签bcr下游引物<400>33aatgatacggcgaccaccgagatctacactagtggtatacgcgatatcgct51<210>34<211>51<212>dna<213>人工合成<220><223>标签bcr下游引物<400>34aatgatacggcgaccaccgagatctacacgtatgaactacgcgatatcgct51当前第1页12