一种新型有机配体及其制备方法、新型钌配合物和荧光探针与流程
本发明属于配合物技术领域，具体涉及一种有机配体及其制备方法、新型钌配合物和荧光探针。
背景技术：
荧光探针是指那些能够选择性结合某种被分析物，随之体系的荧光光谱发生一定变化的分子。在分子探针设计时，通过化学结构、环境及分子间作用的变化来调控发光信号，从而发挥对被测物的检测作用。Re(I)、Ru(II)、Ir(III)、Pt(II)配合物为一类过渡金属配合物，由于其在荧光生物成像方面较好的应用价值常被用于分子探针的发光基团，这类荧光探针由于其特殊的光物理和光化学特性而具有消耗低、灵敏度高、动态响应范围宽的优点，被广泛的应用于各学科领域。近几年来，关于过渡金属荧光探针的研究发展迅速，多种荧光探针已被设计合成并应用于DNA、蛋白质、气体传感器等领域中。
然而，现有荧光分子探针普遍存在荧光发射不稳定寿命短和水溶性差的问题，不能很好的应用于生物医学研究中的荧光生物成像。因此，研发一种新型荧光探针是本领域技术人员亟待解决的技术问题。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种荧光发射稳定的新型荧光探针。为实现上述目的，本发明的具体技术方案如下：
本发明提供了一种新型有机配体，具有通式(Ⅰ)所示的结构：
本发明还提供了一种新型有机配体的制备方法，包括：
将5-氟吲哚甲酸、二氯亚砜和5-氨基-1,10-邻菲罗啉在反应溶剂中混合反应，得到权利要求1所述的新型有机配体。
优选的，所述反应溶剂为苯或吡啶。
本发明还提供了一种新型钌配合物，包括式(Ⅱ)所示的化合物和/或式(Ⅱ)所示的化合物的水合物，
Ru[M2(fpic)]X2 (Ⅱ)；
其中，M为1,10-邻菲罗啉或2,2'-联吡啶；
X为无机盐阴离子；所述无机盐阴离子为ClO4-、NO3-或Br-；
fpic为有机配体，所述有机配体具有如通式(Ⅰ)所示的结构：
优选的，所述新型钌配合物中，M为1,10-邻菲罗啉时，阳离子部分的分子结构式如式(III)所示：
所述新型钌配合物中，M为2,2'-联吡啶时，阳离子部分的分子结构式如式(IV)所示：
本发明还提供了一种新型钌配合物的制备方法，包括：
将上述新型有机配体或上述制备方法制备的新型有机配体、钌的有机配合物和乙醇混合，回流，冷却至室温，过滤后加入无机盐溶液，析出沉淀，得到上述的新型钌配合物。
优选的，所述钌的有机配合物为二(2,2'-联吡啶)-二氯-二水合钌或二(1,10-邻菲罗啉)-二氯-二水合钌。
优选的，所述回流为在氮气条件下回流，所述回流时间为6h。
优选的，所述无机盐溶液为NaClO4水溶液。
本发明还提供了一种荧光分子探针，包括：上述新型钌配合物和/或所述新型钌配合物的制备方法制备得到的新型钌配合物。
本发明还提供了一种药物组合物，包括：所述的新型钌配合物和/或所述新型钌配合物的制备方法制备得到的新型钌配合物。
本发明还提供了所述有机配体或所述新型钌配合物或所述药物组合物在制备抗癌药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种新的有机配体，结构新颖，与有机钌配合物反应可合成一种新型钌配合物结构新颖；所述钌配合物具有较好的水溶性，光学性质优良，激发态寿命长，生物相容性好，合成步骤简单，可作为一种新型荧光分子探针，应用于生命科学研究中的荧光生物成像领域。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为Ru[(phen)2(fpic)](ClO4)2·2H2O在水中的荧光强度测定结果；
图2为Ru[(bpy)2(fpic)](ClO4)2·2H2O在水中的荧光强度测定结果；
图3为Ru[(phen)2(fpic)](ClO4)2·2H2O在水中的荧光寿命测定结果；
图4为Ru[(bpy)2(fpic)](ClO4)2·2H2O在水中的荧光寿命测定结果；
图5为Ru[(phen)2(fpic)](ClO4)2·2H2O在乙腈中的荧光强度测定结果；
图6为Ru[(bpy)2(fpic)](ClO4)2·2H2O在乙腈中的荧光强度测定结果；
图7为Ru[(phen)2(fpic)](ClO4)2·2H2O在乙腈中的荧光寿命测定结果；
图8为Ru[(bpy)2(fpic)](ClO4)2·2H2O在乙腈中的荧光寿命测定结果；
图9为Ru[(phen)2(fpic)](ClO4)2·2H2O和DNA结合后的荧光寿命测定结果；
图10为Ru[(bpy)2(fpic)](ClO4)2·2H2O和DNA结合后的荧光寿命测定结果。
具体实施方式
本发明公开了一种有机配体fpic，具有通式(Ⅰ)所示的结构：
本发明公开了一种可作为荧光分子探针的新型钌配合物，所述新型钌配合物为Ru[M2(fpic)]X2，其中，M为1,10-邻菲罗啉或2,2'-联吡啶；X为不影响配合物水溶性的离子，优选为NO32-、Br-等无机盐阴离子，更优选为ClO4-。
结构式如式(Ⅰ)所示的化合物为该新型钌配合物的主要配体fpic，5-Fluoro-1H-indole-2-carboxylic acid-1,10-phenanthrolin-5-ylamide(译为：5-氟-1-吲哚-2-乙酰基-1,10-邻菲咯啉-5-胺)，是一种新型有机配体；
fpic的制备方法具体为：将5-氟吲哚甲酸加入到苯或吡啶中，缓慢滴加二氯亚砜，加热回流，浓缩至晶体析出，然后加入5-氨基-1,10-邻菲罗啉，搅拌，收集沉淀，干燥。其化学反应式为：
配体fpic、钌的有机配合物和反应溶剂乙醇混合，在氮气条件下回流6h，冷却至室温，过滤，在滤液中加入NaClO4水溶液，析出沉淀，抽滤，洗涤，干燥，得到所述钌配合物。
所述钌的有机配合物为二(1,10-邻菲罗啉)-二氯-二水合钌时，所述新型钌配合物的分子结构如式(a)所示：
所述钌的有机配合物为二(2,2'-联吡啶)-二氯-二水合钌，所述新型钌配合物的分子结构如式(b)所示：
本发明提供的新型钌配合物具备较好的水溶性、稳定的荧光发射、较高的荧光量子效率，可作为一种新型的长寿命荧光分子探针，应用于荧光生物成像技术，具有广泛的应用前景。将所述新型钌配合物开发为能够用于活体成像的探针，实时原位的提供被测物质在活体内的动态过程将对于生命科学中的荧光分子检测研究起到了很好的促进作用。
下面将结合本发明具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例只是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本领域技术人员应当理解，对本发明的具体实施例进行修改或者对部分技术特征进行同等替换，而不脱离本发明技术方案的精神，均应涵盖在本发明保护的范围中。
实施例1有机配体fpic的合成
把5-氟吲哚-2-甲酸(1.27g，9.0mmol)加入到苯中，加热回流，缓慢滴加二氯亚砜，并将该悬浮液加热回流min；然后，将混合物真空浓缩直至淡黄绿色晶体析出，得到5-氟吲哚-2-酰氯。将5-氟吲哚-2-酰氯的苯溶液逐滴滴加到5-氨基-1,10-邻菲咯啉(1.9g，9.0mmol)的吡啶溶液中，并将所得混合物在室温下搅拌过夜；静置沉淀，过滤并收集沉淀，然后在乙醇溶液中结晶，得土黄色固体，产量为2.918g，产率91％。
Fpic-1H NMR(400MHz,DMSO,ppm):δ12.04(3H,s),10.96(3H,s),9.25(4H,d,J＝3.3Hz),9.22-9.14(3H,m),8.97-8.72(7H,m),8.35(3H,s),8.16-7.95(7H,m),7.62(3H,d,J＝1.5Hz),7.57-7.40(8H,m),7.26(1H,d,J＝17.4Hz),7.20-6.99(4H,m),5.37-2.06(95H,m),2.50(18H,d,J＝1.6Hz),2.35(21H,dd,J＝119.7,52.0Hz),2.10-0.52(3H,m)。
实施例2配合物Ru[(phen)2(fpic)](ClO4)2·2H2O的制备
将0.568g(1mmo1)的Ru(phen)2Cl2·2H2O、0.356g(1mmo1)的fpic加入三口烧瓶中，再加入乙醇，将所得的混合物在氮气条件下回流6h，冷却至室温，过滤。在滤液中加入NaClO4，静置、抽滤，沉淀用水、乙醚洗涤数次后真空干燥，得橙红色固体产物，产量为2.918g，产率为75％。
Ru[(phen)2(fpic)]-1H NMR(400MHz,DMSO,ppm):δ11.98(22H,d,J＝18.2Hz),10.95(20H,s),8.93-8.73(129H,m),8.62(23H,s),8.40(84H,s),8.23-8.00(126H,m),7.99-7.70(130H,m),7.67-7.38(79H,m),7.28(7H,s),7.13(28H,dtd,J＝24.7,9.2,2.5Hz),3.35(629H,s),2.47(303H,d,J＝29.2Hz),2.36-1.23(33H,m),1.61(21H,d,J＝304.8Hz),1.23(11H,s),1.00(9H,d,J＝118.3)。
实施例3配合物Ru[(bpy)2(fpic)](ClO4)2·2H2O的制备
将0.480g(1mmo1)的Ru(bpy)2Cl2·2H2O、0.356g(1mmo1)的fpic加入三口烧瓶中，再加入乙醇，将所得的混合物在氮气条件下回流6h，冷却至室温，过滤。在滤液中加入NaClO4，静置、抽滤，沉淀用水、乙醚洗涤数次后真空干燥，得橙红色固体产物，产量为2.918g，产率为78％。
Ru[(bpy)2(fpic)]-1H NMR(400MHz,DMSO,ppm):δ12.00(1H,s),10.94(1H,s),8.93-8.68(7H,m),8.62(1H,s),8.30-8.01(7H,m),8.01-7.68(5H,m),7.68-7.50(8H,m),7.39(2H,dd,J＝12.3,5.2Hz),7.26-7.04(1H,m),3.36(94H,s),2.42(13H,d,J＝69.8Hz),2.10-1.96(1H,m),1.23(1H,s)。
实施例4
分别配制浓度均为10umol/L的Ru[(phen)2(fpic)](ClO4)2·2H2O和Ru[(bpy)2(fpic)](ClO4)2·2H2O的水溶液，用紫外可见分光光度计测定其吸光度并绘制吸收光谱曲线，从而获得配合物的特征吸收峰波长，以波长作为激发波长，然后采用荧光光谱仪分别测试两种配合物的荧光强度及荧光寿命。
如图1至图4所示，这两种配合物在水中均发出强烈的荧光，其荧光强度分别为3.87×106cps、2.26×106cps。而且，以水为溶剂时，这两种配合物的荧光寿命都符合双指数衰减曲线，其中，Ru[(phen)2(fpic)](ClO4)2·2H2O的荧光寿命为215.45ns、590.76ns，Ru[(bpy)2(fpic)](ClO4)2·2H2O的荧光寿命为306.52ns、544.82ns。
实施例5
采用乙腈分别配制浓度均为10umol/L的Ru[(phen)2(fpic)](ClO4)2·2H2O和Ru[(bpy)2(fpic)](ClO4)2·2H2O的乙腈溶液，用紫外可见分光光度计测定其吸光度并绘制吸收光谱曲线，从而获得配合物的特征吸收峰波长，以波长作为激发波长，然后采用荧光光谱仪分别测试两种配合物的荧光强度及荧光寿命。
如图5至图8所示，这两种配合物在乙腈中均发出强烈的荧光，其荧光强度分别为1.31×106cps、8.96×105cps。而且，以乙腈为溶剂时，这两种配合物的荧光寿命都符合双指数衰减曲线，其中，Ru[(phen)2(fpic)](ClO4)2·2H2O的荧光寿命为111.81ns、301.71ns，Ru[(bpy)2(fpic)](ClO4)2·2H2O的荧光寿命为144.18ns、224.07ns。
实施例6
配制含5mM Tris和50mM NaCl(盐酸调pH值至7.0)的缓冲液。取适量缓冲溶液加入适量DNA，配成5mg/mL DNA母液。
取适量缓冲溶液配成10umol/L的Ru[(phen)2(fpic)](ClO4)2·2H2O的溶液，滴加5mg/mL DNA母液，加入DNA后，测定配合物的荧光强度，接着继续滴加DNA溶液，直至滴加至荧光强度基本不变，测试其荧光寿命。同理，测试10umol/L Ru[(phen)2(fpic)](ClO4)2·2H2O的DNA滴定曲线及荧光寿命。
如图9和图10所示，在结合DNA后，这两种配合物的荧光寿命仍然保持双指数衰减模式。其中，Ru[(phen)2(fpic)](ClO4)2·2H2O的荧光寿命增加至519.23ns、1552.49ns，说明配合物Ru[(phen)2(fpic)](ClO4)2·2H2O结合DNA后的荧光寿命是结合前的2-3倍；Ru[(bpy)2(fpic)](ClO4)2·2H2O的荧光寿命增加至538.26ns、1384.27ns，说明配合物Ru[(bpy)2(fpic)](ClO4)2·2H2O结合DNA后的荧光寿命是结合前的1-2倍。
与DNA作用后，这两个配合物的荧光强度均明显增强，随着DNA浓度的增加，俩配合物的荧光逐渐增强，配合物Ru[(phen)2(fpic)](ClO4)2·2H2O在滴加至440ul DNA母液时达到饱和，荧光强度增加了约13.2％，配合物Ru[(bpy)2(fpic)](ClO4)2·2H2O在滴加至380ul DNA母液时达到饱和，荧光强度增加了约25.6％，说明这两个配合物与DNA结合后，荧光强度与荧光寿命都有一定幅度的增强。
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