1.ES细胞基因打靶技术制备基因修饰小鼠的改进方法,包括如下步骤:
(1)提供小鼠的2-细胞胚胎,
(2)将所述的2-细胞胚胎在清洗若干次后,在37℃,5%CO2的条件下培养12-24小时;
(3)将步骤(2)培养的胚胎和准备好的ES细胞转移到同一注射皿中的液滴内,将所述注射皿放置在显微镜下进行显微注射;在高倍镜下,用斜口的注射针连续吸多个ES细胞到注射针里,挑选形态较好的胚胎,将注射针的针头插入胚胎的卵裂球间隙内,推动注射器,将注射针内的ES细胞推到胚胎内,最后拔出针;
(4)将注射后的胚胎转移至胚胎培养基中培养,在37℃,5%CO2的条件下培养24小时;
(5)选取前述步骤(4)中发育良好的胚胎,移植到2.5d的代孕鼠子宫内;
(6)当代孕鼠产下小仔F0后,对出生小鼠进行统计和鉴定。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(2)中,将所述的2-细胞胚胎在M2培养液滴中清洗多遍,接着将2-细胞胚胎转移到微滴培养皿中,然后用平衡好的M16培养液清洗2-细胞胚胎多遍后,最后将2-细胞胚胎放置于一个干净液滴内。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(3)显微注射具体包括如下步骤:
S1.在高倍镜下选择单个ES细胞,用斜口的注射针连续吸多个细胞到注射针里,挑选形态较好的胚胎,用固定针吹吸胚胎,旋转胚胎直至将一个较大间隙调节在3点方向。用固定针负压固定胚胎,调节显微镜确定胚胎的边缘,同时要确保胚胎固定牢固;
S2.将注射针的尖端与胚胎的中心点安排在同一聚焦平面上,用注射针尖轻轻地接触胚胎表面;
S3.将注射针的针头插入胚胎的卵裂球间隙内,缓慢推动油压注射器,将注射针内的ES细胞推到胚胎内,每个胚胎注射6-8个ES细胞;
S4.注射完毕后将注射针缓慢拔出。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(3)中注射皿中的液滴为注射液,所述步骤(4)中的改良胚胎培养基;它们的组分相同,如下组成:
其中NEAA(100×)的成分为:
其中,所述小分子物质为C、H、F、N、O、S类化学成分组成的氨基芳香烃类,其范围在C(11-25)H(9-30)F(2-8)N(1-10)O(2-8)S(1-5)。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(3)中注射皿中的液滴为注射液,所述步骤(4)中的改良胚胎培养基;它们的组分相同,如下组成:
其中NEAA(100×)的成分为:
其中,所述小分子物质为C、H、F、N、O、S类化学成分组成的氨基芳香烃类,其范围在C(11-25)H(9-30)F(2-8)N(1-10)O(2-8)S(1-5)。
6.根据权利要求4或5所述的方法,其特征在于,所述小分子物质选自XAV939、PD184352、A0-6301、PD184352、AZD6244、CT99021、GSK1120212、PS-341组分中的两种或两种以上。
7.根据权利要求4或5所述的方法,其特征在于,所述的无血清培养体系pH:7.0-7.4;渗透压:260-320mOsm/kg;细菌、真菌检测:阴性;衣原体、支原体检测:阴性;内毒素:<0.5EU/mL。