本发明涉及包含交联的多糖的水凝胶的领域以及此类水凝胶在医学应用和/或化妆品应用中的用途。更具体地，本发明涉及由交联的糖胺聚糖，特别是交联的透明质酸、软骨素或硫酸软骨素制成的水凝胶。
发明背景
吸水凝胶或水凝胶在生物医学领域被广泛使用。它们通常经过聚合物的化学交联成无限网络而制备。虽然许多多糖吸收水直到它们被完全溶解，但相同的多糖的交联的凝胶通常可以吸收一定量的水直到它们被饱和，即，它们具有有限的液体保留能力、或溶胀度。
透明质酸、软骨素和硫酸软骨素是众所周知的生物相容性聚合物。它们是天然存在的、属于糖胺聚糖(gag)的组的多糖。所有gag是带负电的杂多糖链，其具有吸收大量水的能力。
透明质酸(ha)是用于医学用途和化妆品用途的最广泛使用的生物相容性聚合物之一。ha是天然存在的、属于糖胺聚糖(gag)的组的多糖。透明质酸和衍生自透明质酸的产品在生物医学领域和化妆品领域中被广泛使用，例如在弹性手术(viscosurgery)期间和作为皮下填充剂(dermalfiller)。
硫酸软骨素(cs)是哺乳动物的结缔组织中发现的高度丰富的gag，它在结缔组织中与其他硫酸化的gag一起作为蛋白多糖的一部分与蛋白质结合。先前已经表明，由于含有cs的水凝胶与天然细胞外基质相似，因此其可以在生物医学应用中被成功地使用(lauder,r.m.,complementthermed17:56-62,2009)。硫酸软骨素还被用于治疗骨关节炎，例如作为膳食补充剂。
糖胺聚糖的交联延长了构成网络的可降解聚合物的持续时间，这在很多应用中是有用的。然而，交联也会降低糖胺聚糖的天然性质。因此，通常希望通过有效交联来保持低程度的修饰，以保存糖胺聚糖本身的天然性质和效果。
发明概述
本发明的目的是提供具有糖胺聚糖(gag)作为可溶胀聚合物的水凝胶。
本发明的另外的目的是提供用于交联gag分子的方法，该方法具有对gag分子的天然性质的降低的影响。
本发明的目标还是提供用于通过温和且有效的途径制备gag分子的水凝胶的方法。
对于从本公开内容将是明显的这些目的和其他目的，本发明根据第一方面提供了包含糖胺聚糖分子作为可溶胀聚合物的水凝胶产品，其中糖胺聚糖分子经由交联部被共价地交联，所述交联部包含选自由以下组成的组的间隔基团：二糖、三糖、四糖、和寡糖。
关于本文所述的制备水凝胶产品的本发明的工艺，术语“交联剂”是指具有两个或更多个官能团的分子，所述官能团特别是附接至非反应性间隔基团上的亲核官能团(nucleofilefunctionalgroup)，所述非反应性间隔基团特别是二糖、三糖、四糖、或寡糖。两个或更多个官能团中的每一个能够与gag分子上的羧酸基团反应以形成稳定的共价键。优选地，交联剂由两个或更多个官能团和间隔基组成。
关于本文所述的本发明的水凝胶产品，术语“交联部”是指交联后gag分子通过其被共价连接的交联剂的部分或残基。交联部通常由以下组成：i)间隔基团和ii)在交联剂的官能团与gag上的羧酸基团反应之后形成的结合基团。间隔基团可以例如包括透明质酸四糖残基、透明质酸六糖残基、海藻糖残基、乳糖残基、麦芽糖残基、蔗糖残基、纤维二糖残基或棉子糖残基。
经由包含选自由二糖、三糖、四糖、和寡糖组成的组的间隔基团的交联剂的交联，提供了完全基于碳水化合物类型结构或其衍生物的水凝胶产品，其最小化交联对糖胺聚糖的天然性质的干扰。二糖、三糖、四糖、或寡糖优选地在结构和分子量方面被明确定义。优选地，间隔基选自一种特定的二糖结构、三糖结构、四糖结构、或寡糖结构。优选地，二糖、三糖、四糖、或寡糖是单分散的或具有窄分子量分布。使用基于明确定义的二糖、三糖、四糖、或寡糖的交联剂连同高效的缩合反应允许产品以受控的方式被组装。交联剂本身也可以有助于水凝胶的维持的或提高的性能，例如当采用与透明质酸相关的结构(例如二氨基透明质酸四糖)交联时，或者当采用具有高保水性的结构(例如海藻糖)交联时。
gag可以是例如硫酸化的或非硫酸化的糖胺聚糖，例如透明质素(hyaluronan)、硫酸软骨素、硫酸乙酰肝素、细菌肝素前体(heparosan)、肝素、硫酸皮肤素和硫酸角质素。在一些实施方案中，gag是透明质酸、软骨素或硫酸软骨素。在优选的实施方案中，gag是透明质酸。
在优选的实施方案中，gag是天然的gag。结合本发明使用的gag优选地为天然存在的gag。gag优选地以其天然的状态被使用。即，gag的化学结构优选地没有通过添加官能团或类似物被改变或修饰。使用处于其天然的状态的gag是优选的，因为这将提供更接近地类似天然分子的交联的结构，这保存了gag本身的天然性质和效果，并且当交联的gag被引入体内时可以最小化免疫响应。
共价地交联的gag分子优选地由碳水化合物型结构或其衍生物组成或基本上由碳水化合物型结构或其衍生物组成。这意味着交联的gag分子优选地不含或基本不含合成的非碳水化合物结构或连接基。这可以通过使用处于天然的状态的gag连同交联剂来实现，所述交联剂由碳水化合物型结构或其衍生物组成或基本上由碳水化合物型结构或其衍生物组成。交联剂的官能团然后被直接共价地结合到gag的羧基基团上。因此优选地，共价地交联的gag的交联部由或基本上由二糖间隔基团、三糖间隔基团、四糖间隔基团、和寡糖间隔基团组成。
根据第二方面，本发明提供了制备水凝胶产品的工艺，水凝胶产品包含交联的糖胺聚糖分子，该工艺包括以下步骤：
(a)提供糖胺聚糖分子的溶液；
(b)用偶联剂活化糖胺聚糖分子上的羧基基团以形成活化的糖胺聚糖分子；
(c)使用包含选自由二糖、三糖、四糖、和寡糖组成的组的间隔基团的双亲核官能的交联剂(dinucleophilefunctionalcrosslinker)或多亲核官能的交联剂，经由活化的糖胺聚糖分子的活化的羧基基团来交联活化的糖胺聚糖分子，以得到交联的糖胺聚糖分子。
本发明涉及糖胺聚糖分子通过共价键，优选地酰胺键的交联，该交联通常使用用于糖胺聚糖分子主链上的羧基基团的活化剂和包含选自由二糖、三糖、四糖、和寡糖组成的组的间隔基团的双亲核官能的交联剂或多亲核官能的交联剂。根据本发明的方法的交联可以通过温和且有效的途径来实现，得到高产率且gag分子的降解最小。
双亲核官能的交联剂或多亲核官能的交联剂包含选自由二糖、三糖、四糖、和寡糖组成的组的间隔基团，所述间隔基团保留在gag分子之间的交联部中。双亲核官能的或多亲核官能的二糖、三糖、四糖和寡糖包含至少两个与其附接的亲核官能团。至少两个亲核官能团优选地由选自由以下组成的组的间隔基团来分开：二糖、三糖、四糖、和寡糖。
双亲核官能的交联剂或多亲核官能的交联剂包含能够与gag的官能性羧基基团反应的两个或更多个官能团，所述反应导致共价键优选地酰胺键的形成。亲核官能团优选地能够与糖胺聚糖分子上的羧基基团反应以形成酰胺键。在一些实施方案中，二糖、三糖、四糖和寡糖的亲核官能团选自由以下组成的组：伯胺、肼、酰肼、肼基甲酸酯(carbazate)、半卡巴肼(semi-carbazide)、氨基硫脲、硫代肼基甲酸酯(thiocarbazate)和氨氧基(aminoxy)。
双亲核官能的或多亲核官能的二糖、三糖、四糖和寡糖可以衍生自亲核官能性多糖，例如衍生自甲壳质的壳二糖。双亲核官能的或多亲核官能的二糖、三糖、四糖和寡糖也可以是通过引入两个或更多个亲核官能团而被修饰的二糖、三糖、四糖和寡糖。
双亲核官能的交联剂或多亲核官能的交联剂的优选的组包括同双官能的或异双官能的伯胺、肼、酰肼、肼基甲酸酯、半卡巴肼、氨基硫脲、硫代肼基甲酸酯和氨氧基。
在某些实施方案中，活化步骤(b)和交联步骤(c)同时发生。在其他实施方案中，活化步骤(b)发生在交联步骤(c)之前并且与交联步骤(c)分开地发生。
在优选的实施方案中，步骤(c)还包括提供交联的gag分子的颗粒，所述颗粒具有在0.01mm-5mm、优选地0.1mm-0.8mm的范围内的平均尺寸。
在一个优选的实施方案中，步骤(b)的偶联剂是肽偶联试剂。肽偶联试剂可以选自由以下组成的组：基于三嗪的偶联试剂、碳二亚胺偶联试剂、咪唑鎓衍生的偶联试剂、oxyma和comu。优选的肽偶联试剂是基于三嗪的偶联试剂，包括由4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(dmtmm)和2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪(cdmt)组成的组，优选地dmtmm。另一种优选的肽偶联试剂是碳二亚胺偶联试剂，优选地与n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)结合的n-(3-二甲氨基丙基)-n’-乙基碳二亚胺(edc)。
根据相关的方面，本发明还提供水凝胶产品作为药物的用途，例如在处理软组织紊乱中的用途。提供了通过向患者施用治疗有效量的水凝胶产品来处理患有软组织紊乱的患者的方法。还提供了通过向患者施用治疗有效量的水凝胶产品而向患者提供矫正处理或美学处理的方法。
本发明的其他方面和优选的实施方案依据本发明的以下详细公开内容和所附权利要求将是明显的。
优选的实施方案的分项清单
1.一种水凝胶产品，所述水凝胶产品包含糖胺聚糖分子作为可溶胀聚合物，其中糖胺聚糖分子经由交联部被共价地交联，所述交联部包含选自由以下组成的组的间隔基团：二糖、三糖、四糖、和寡糖。
2.根据实施方案1的水凝胶产品，其中糖胺聚糖分子选自由以下组成的组：透明质酸、软骨素和硫酸软骨素、及其混合物。
3.根据实施方案2的水凝胶产品，其中糖胺聚糖分子是透明质酸。
4.根据前述实施方案中任一项的水凝胶产品，其中至少75％的交联部包含选自由以下组成的组的间隔基团：二糖、三糖、四糖、和寡糖。
5.根据实施方案4的水凝胶产品，其中至少90％的交联部包含选自由以下组成的组的间隔基团：二糖、三糖、四糖、和寡糖。
6.根据实施方案5的水凝胶产品，其中至少95％的交联部包含选自由以下组成的组的间隔基团：二糖、三糖、四糖、和寡糖。
7.根据前述实施方案中任一项的水凝胶产品，其中间隔基团是透明质酸四糖残基、透明质酸六糖残基、海藻糖残基、乳糖残基、麦芽糖残基、蔗糖残基、纤维二糖残基或棉子糖残基。
8.根据实施方案7的水凝胶产品，其中间隔基团是透明质酸四糖残基或透明质酸六糖残基。
9.根据实施方案7的水凝胶产品，其中间隔基团是海藻糖残基、乳糖残基、麦芽糖残基、蔗糖残基、纤维二糖残基或棉子糖残基。
10.根据前述实施方案中任一项的水凝胶产品，其中间隔基团选自由以下组成的组：二糖、三糖、和四糖。
11.根据前述实施方案中任一项的水凝胶产品，其中交联部通过酰胺键被结合到糖胺聚糖分子上。
12.根据前述实施方案中任一项的水凝胶产品，其中在糖胺聚糖分子和交联部之间的至少75％的键是酰胺键。
13.根据实施方案12的水凝胶产品，其中在糖胺聚糖分子和交联部之间的至少90％的键是酰胺键。
14.根据实施方案13的水凝胶产品，其中在糖胺聚糖分子和交联部之间的至少95％的键是酰胺键。
15.根据前述实施方案中任一项的水凝胶产品，其中在糖胺聚糖分子和交联部之间的少于5％的键是酯键。
16.根据实施方案15的水凝胶产品，其中在糖胺聚糖分子和交联部之间的少于1％的键是酯键。
17.根据前述实施方案中任一项的水凝胶产品，其中交联的糖胺聚糖分子呈凝胶颗粒的形式，所述凝胶颗粒具有在0.01mm-5mm、优选地0.1mm-0.8mm的范围内的平均尺寸。
18.根据前述实施方案中任一项的水凝胶产品，呈可注射制剂的形式。
19.一种制备水凝胶产品的工艺，水凝胶产品包含交联的糖胺聚糖分子，所述工艺包括以下步骤：
(a)提供糖胺聚糖分子的溶液；
(b)用偶联剂活化糖胺聚糖分子上的羧基基团以形成活化的糖胺聚糖分子；
(c)使用包含选自由二糖、三糖、四糖、和寡糖组成的组的间隔基团的双亲核官能的交联剂或多亲核官能的交联剂，经由活化的糖胺聚糖分子的活化的羧基基团来交联活化的糖胺聚糖分子，以得到交联的糖胺聚糖分子。
20.根据实施方案19的工艺，其中步骤(c)的交联在糖胺聚糖分子和交联剂之间提供酰胺键。
21.根据实施方案19-20中任一项的工艺，其中活化步骤(b)和交联步骤(c)同时发生。
22.根据实施方案19-21中任一项的工艺，其中偶联剂和交联剂同时被添加到糖胺聚糖中。
23.根据实施方案19-20中任一项的工艺，其中活化步骤(b)发生在交联步骤(c)之前并且与交联步骤(c)分开地发生。
24.根据实施方案19-23中任一项的工艺，其中步骤(c)还包括提供交联的糖胺聚糖的颗粒，所述颗粒具有在0.01mm-5mm、优选地0.1mm-0.8mm的范围内的平均尺寸。
25.根据实施方案19-24中任一项的工艺，其中糖胺聚糖分子选自由以下组成的组：透明质酸、软骨素和硫酸软骨素、及其混合物。
26.根据实施方案19-25中任一项的工艺，其中糖胺聚糖分子是透明质酸。
27.根据实施方案19-26中任一项的工艺，其中步骤(b)的偶联剂是肽偶联试剂。
28.根据实施方案27的工艺，其中肽偶联试剂选自由以下组成的组：基于三嗪的偶联试剂、碳二亚胺偶联试剂、咪唑鎓衍生的偶联试剂、oxyma和comu。
29.根据实施方案28的工艺，其中肽偶联试剂是基于三嗪的偶联试剂。
30.根据实施方案29的工艺，其中基于三嗪的偶联试剂选自由4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(dmtmm)和2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪(cdmt)组成的组。
31.根据实施方案30的工艺，其中基于三嗪的偶联试剂是dmtmm。
32.根据实施方案28的工艺，其中肽偶联试剂是碳二亚胺偶联试剂。
33.根据实施方案32的工艺，其中碳二亚胺偶联试剂是与n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)结合的n-(3-二甲氨基丙基)-n’-乙基碳二亚胺(edc)。
34.根据实施方案19-33中任一项的工艺，其中间隔基团是透明质酸四糖残基、透明质酸六糖残基、海藻糖残基、乳糖残基、麦芽糖残基、蔗糖残基、纤维二糖残基或棉子糖残基。
35.根据实施方案19-33中任一项的工艺，其中间隔基团是透明质酸四糖残基或透明质酸六糖残基。
36.根据实施方案19-33中任一项的工艺，其中间隔基团是海藻糖残基、乳糖残基、麦芽糖残基、蔗糖残基、纤维二糖残基或棉子糖残基。
37.根据实施方案19-36中任一项的工艺，其中间隔基团选自由以下组成的组：二糖、三糖、和四糖。
38.根据实施方案19-37中任一项的工艺，其中交联剂的亲核基团选自由以下组成的组：伯胺、肼、酰肼、肼基甲酸酯、半卡巴肼、氨基硫脲、硫代肼基甲酸酯和氨氧基。
39.根据实施方案38的工艺，其中二糖、三糖、四糖、和寡糖的亲核基团是伯胺。
40.根据实施方案39的工艺，其中交联剂是双亲核官能的交联剂。
41.根据实施方案40的工艺，其中交联剂选自由以下组成的组：二氨基透明质酸四糖、二氨基透明质酸六糖、二氨基海藻糖、二氨基乳糖、二氨基麦芽糖、二氨基蔗糖、壳二糖或二氨基棉子糖。
42.根据实施方案19-41中任一项的工艺，还包括以下步骤：
(d)使步骤(c)中获得的交联的糖胺聚糖分子经历碱处理。
43.通过根据实施方案19-42中任一项的工艺可获得的产品。
44.根据实施方案1-18和实施方案43中任一项的水凝胶产品用作药物。
45.根据实施方案44的水凝胶产品用于处理软组织紊乱。
46.根据实施方案1-18和实施方案43中任一项的水凝胶产品用于制造用于处理软组织紊乱的药物的用途。
47.一种处理患有软组织紊乱的患者的方法，所述方法是通过向患者施用治疗有效量的根据实施方案1-18和实施方案43中任一项的水凝胶产品。
48.一种向患者提供矫正处理或美学处理的方法，所述方法是通过向患者施用治疗有效量的根据实施方案1-18和实施方案43中任一项的水凝胶产品。
49.一种通过化妆处理皮肤的方法，所述方法包括向皮肤施用根据实施方案1-18和实施方案43中任一项的水凝胶产品。
发明详述
本发明提供了用于制备由交联的糖胺聚糖(gag)分子制成的水凝胶的有利工艺、所得水凝胶产品及其用途。gag是带负电的杂多糖链，其具有吸收大量水的能力。在根据本发明的水凝胶产品中，交联的gag分子是提供凝胶性质的可溶胀聚合物。本文所述的制备工艺对gag分子是温和的，但提供了有效的交联。
因此，本发明通过使用双亲核官能的交联剂或多亲核官能的交联剂在水性介质中的交联而提供了gag分子水凝胶，所述交联剂能够通过涉及使用偶联剂的反应与gag分子的羧酸基团直接形成共价键。
根据本发明的gag优选地选自由透明质酸、软骨素和硫酸软骨素组成的组。在优选的实施方案中，gag分子是透明质酸。透明质酸(ha)是用于医学用途和化妆品用途的最广泛使用的生物相容性聚合物之一。ha是天然存在的、属于糖胺聚糖(gag)的组的多糖。透明质酸和衍生自透明质酸的产品在生物医学领域和化妆品领域被广泛使用，例如在弹性手术期间和作为皮下填充剂。
除非另外提供，否则术语“透明质酸”涵盖具有各种链长和电荷状态以及具有各种化学修饰的透明质酸、透明质酸盐/酯(hyaluronate)或透明质素的所有变体和变体的组合。即，该术语还涵盖透明质酸与多种抗衡离子的多种透明质酸盐，例如透明质酸钠。透明质酸可以从动物源和非动物源的各种来源获得。非动物源的来源包括酵母以及优选地细菌。单个透明质酸分子的分子量典型地在0.1mda-10mda的范围内，但其他分子量是可能的。
术语“软骨素”是指具有由交替的非硫酸化的d-葡萄糖醛酸和n-乙酰基-d-半乳糖胺部分组成的二糖重复单元的gag。为了避免疑问，术语“软骨素”不涵盖任何形式的硫酸软骨素。
术语“硫酸软骨素”是指具有由交替的d-葡萄糖醛酸和n-乙酰基-d-半乳糖胺部分组成的二糖重复单元的gag。硫酸盐部分可以存在于各种不同的位置。优选的硫酸软骨素分子是4-硫酸软骨素(chondroitin-4-sulfate)和6-硫酸软骨素。
软骨素分子可以从动物源和非动物源的各种来源获得。非动物源的来源包括酵母以及优选地细菌。单个软骨素分子的分子量典型地在1kda-500kda的范围内，但其他分子量是可能的。
交联的gag包括gag分子链之间的交联部，这产生了通过共价交联部保持在一起的gag分子的连续网络。
gag分子链优选地经由交联剂被彼此交联，所述交联剂包含选自由以下组成的组的间隔基团：二糖、三糖、四糖、和寡糖。
优选的是，交联剂通过酰胺键被结合到糖胺聚糖分子上。
交联的gag产品优选地是生物相容性的。这意味着在被处理的个体中没有或仅非常温和的免疫应答发生。即，在被处理的个体中没有或仅非常温和的不合意的局部效应或全身效应发生。
根据本发明的交联的产品是凝胶或水凝胶。即，它在经历液体、典型地含水液体时可以被认为是水不溶性的、但大幅稀释的gag分子的交联体系。
按重量计凝胶主要包含液体并且可以例如包含90％-99.9％的水，但由于液体内三维交联的gag分子网络，它表现得像固体。由于其显著的液体含量，凝胶在结构上是柔性的并且类似于天然组织，这使得它在组织工程中作为支架和用于组织培养(tissueaugmentation)是非常有用的。它也可用于处理软组织紊乱以及用于矫正处理或美学处理。它优选地用作可注射制剂。
gag分子的交联可以通过用偶联剂活化，然后与交联剂反应来实现。gag分子浓度和交联的程度影响凝胶的机械性能，例如，弹性模量g’和稳定性性能。交联的gag分子凝胶可以用“修饰度”来表征。gag分子凝胶的修饰度范围通常在0.01摩尔％和15摩尔％之间。修饰度(摩尔％)描述结合至gag分子的交联剂的量，即，相对于重复的二糖单元的总摩尔量的结合的交联剂的摩尔量。修饰度反映了gag分子已经通过交联剂被化学修饰到什么程度。用于活化以及交联的反应条件以及用于确定修饰度的适合的分析技术都被本领域技术人员所熟知，他们可以容易地调整这些和其他相关因素并且由此提供合适的条件来获得期望的修饰度，并且验证所得产品关于修饰度的特征。
水凝胶产品还可以包含未交联的，即未结合至三维交联的gag分子网络的gag分子的部分。然而，优选的是，在凝胶组合物中的gag分子的按重量计至少50％、优选地按重量计至少60％、更优选地按重量计至少70％、并且最优选地按重量计至少80％形成交联的gag分子网络的部分。
交联的gag分子优选地以凝胶颗粒的形式存在。凝胶颗粒优选地具有在0.01mm-5mm、优选地0.1mm-0.8mm例如0.2mm-0.5mm或0.5mm-0.8mm的范围内的平均尺寸。
水凝胶产品可以存在于水溶液中，但它也可以以干燥的形式或沉淀的形式存在，例如，在乙醇中。水凝胶产品优选地是可注射的。
水凝胶产品可以通过包括以下步骤的工艺来制备：
(a)提供糖胺聚糖分子的溶液；
(b)用偶联剂活化糖胺聚糖分子上的羧基基团以形成活化的糖胺聚糖分子；
(c)使用包含选自由二糖、三糖、四糖、和寡糖组成的组的间隔基团的双亲核官能的交联剂或多亲核官能的交联剂，经由活化的糖胺聚糖分子的活化的羧基基团来交联活化的糖胺聚糖分子，以得到交联的糖胺聚糖分子。
根据本发明的gag优选地选自由透明质酸、软骨素和硫酸软骨素组成的组。在优选的实施方案中，gag分子是透明质酸。
在活化步骤(b)中，用偶联剂活化gag分子上的羧基基团以形成活化的gag分子。
在一个优选的实施方案中，肽偶联试剂选自由以下组成的组：基于三嗪的偶联试剂、碳二亚胺偶联试剂、咪唑鎓衍生的偶联试剂、oxyma和comu。
肽偶联试剂优选地是基于三嗪的偶联试剂，例如4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(dmtmm)和2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪(cdmt)。优选的基于三嗪的肽偶联试剂是dmtmm。
其他优选的肽偶联试剂是碳二亚胺偶联试剂，优选地是与n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)结合的n-(3-二甲氨基丙基)-n’-乙基碳二亚胺(edc)。
在交联步骤(c)中，活化的gag分子的交联使用交联剂经由它们的羧基基团发生。交联剂是包含选自由以下组成的组的间隔基团的双亲核官能的交联剂或多亲核官能的交联剂：二糖、三糖、四糖、和寡糖。交联剂经由gag主链上的羧基基团将gag链彼此连接。间隔基团可以是例如透明质酸四糖残基、透明质酸六糖残基、海藻糖残基、乳糖残基、麦芽糖残基、蔗糖残基、纤维二糖残基或棉子糖残基。通过术语“残基”在此是指化合物的结构分别与母体化合物透明质酸四糖、透明质酸六糖、海藻糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、纤维二糖或棉子糖相似但不相同。残基的结构可以不同于母体化合物的结构，因为它已被提供有两个或更多个亲核官能团，并且任选地经由所述亲核官能团被共价地连接至gag主链上的羧基基团。
双亲核官能的交联剂或多亲核官能的交联剂包含能够与gag的官能性羧基基团反应的两个或更多个官能团，所述反应导致共价键优选地酰胺键的形成。
双亲核官能的交联剂或多亲核官能的交联剂的优选的组包括同双官能的或异双官能的伯胺、肼、酰肼、肼基甲酸酯、半卡巴肼、氨基硫脲、硫代肼基甲酸酯和氨氧基。可用于本发明的这样的异双官能的交联剂的非限制性实例包括：
二氨基海藻糖(6,6’-二氨基-6,6’-二脱氧海藻糖)；
二氨基蔗糖(6,6’-二氨基-6,6’-二脱氧蔗糖)；
壳二糖(2,2’-二氨基-2,2’-二脱氧纤维二糖)；
二氨基乳糖(6,6’-二氨基-6,6’-二脱氧乳糖)；
“还原的n-去乙酰化透明质酸四糖”或
“还原的二氨基透明质酸四糖”；和
二氨基棉子糖(6,6”-二氨基-6,6”-二脱氧棉子糖)。
反应方案1a-1h示意性地说明了通过异双官能的伯胺(1a)、氨氧基(1b)、肼基甲酸酯(1c)、半卡巴肼(1d)、氨基硫脲(1e)、硫代肼基甲酸酯(1f)、肼(1g)和酰肼(1h)偶联的实例
方案1a
方案1b
方案1c
方案1d
方案1e
方案1f
方案1g
方案1h
双亲核官能的交联剂或多亲核官能的交联剂包含选自由二糖、三糖、四糖、和寡糖组成的组的间隔基团，所述间隔基团保留在gag分子之间的交联部中。
该工艺可以在水性介质中以一锅法进行，其包括使用合适的偶联剂将双亲核官能的交联剂或多亲核官能的交联剂直接共价偶联到天然的gag上的固有的羧酸基团。在优选的实施方案中，活化步骤(b)和交联步骤(c)同时发生。
在另一个实施方案中，活化步骤(b)发生在交联步骤(c)之前并且与交联步骤(c)分开发生。
用于产生交联的水凝胶的工艺通常包括制备gag分子例如透明质酸连同交联剂例如二氨基海藻糖、dath(相对于羧酸基团0.001-10摩尔当量的胺，或优选地0.001-1摩尔当量)和偶联剂例如dmtmm(相对于羧酸基团0.01-10摩尔当量，或优选地0.05-1摩尔当量)的混合物。在2-120小时、优选地4-48小时期间在5℃-50℃、优选地10℃-40℃、或者甚至更优选地20℃-35℃温育混合物，然后进行碱处理、中和、沉淀、洗涤和真空干燥，得到作为固体的交联的多糖。将沉淀物在含有nacl的磷酸盐缓冲液中溶胀以形成水凝胶，将水凝胶优选地微粉化成尺寸为0.01mm-5mm、优选地0.1mm-1mm的水凝胶颗粒。
所得水凝胶产品的典型应用包括制备用于处理软组织紊乱的可注射制剂，所述软组织紊乱包括但不限于矫正处理和美学处理。
在一个更具体的实施方案中，可以如下实现硫酸软骨素与dath的交联：
二氨基海藻糖(dath)是按照“syntheticcarbohydratepolymerscontainingtrehaloseresiduesinthemainchain:preparationandcharacteristicproperties”；keisukekurita,*naokomasuda,sadafumiaibe,kaorimurakami,shigeruishii,和shin-ichironishimurat；macromolecules1994,27,7544-7549中所描述的来合成的。
将硫酸软骨素(cs)(10kda-200kda)在falcon管中称重。通过将dath溶解在ph7.4的磷酸盐缓冲液中制备二氨基海藻糖(dath)的储备溶液。将dmtmm在容器中称重，并将dath溶液添加至dmtmm中。通过添加1.2mhcl或0.25mnaoh将dmtmm-dath溶液的ph调节至约7，并且然后将混合物添加到cs中。将内容物充分均质化，并然后在15℃-55℃温育持续2-48小时。压制所得材料通过1mm钢网两次，并在naoh中溶胀。将凝胶用1.2mhcl中和至ph7并用乙醇沉淀。将所得的沉淀物用100mm在70％乙醇中的nacl洗涤，用70％乙醇以及用乙醇洗涤。将所得固体在25℃真空干燥。将沉淀物在ph7.4的0.7％nacl磷酸盐缓冲液中溶胀并压制通过过滤网三次。将交联的cs-凝胶填充在注射器上并且杀菌。
在另一个更具体的实施方案中，可以如下实现ha与二氨基蔗糖的交联：
二氨基蔗糖是按照“libraryofmildandeconomicprotocolsfortheselectivederivatizationofsucroseundermicrowaveirradiation”；m.teresabarros,krasimirat.petrova,paulacorreia-da-silva和tateraom.potewar；greenchem.,2011,13,1897-1906中所描述的来制备。
将透明质酸(ha)(10kda-1000kda)在容器中称重。通过将二氨基蔗糖溶解在ph7.4的磷酸盐缓冲液中制备二氨基蔗糖的储备溶液。在容器中称重dmtmm，并将二氨基蔗糖溶液添加至dmtmm中。通过添加1.2mhcl或0.25mnaoh将dmtmm-二氨基蔗糖溶液的ph调节至约7，并且然后将混合物添加至ha。将内容物充分均质化，并然后在15℃-55℃温育持续2-48小时。压制所得材料通过1mm钢网两次，并在naoh中溶胀。将凝胶用1.2mhcl中和至ph7并用乙醇沉淀。将所得的沉淀物用100mm在70％乙醇中的nacl洗涤，用70％乙醇以及用乙醇洗涤。将所得固体在25℃真空干燥。将沉淀物在ph7.4的0.7％nacl磷酸盐缓冲液中溶胀并压制通过过滤网三次。将交联的ha-凝胶填充在注射器上并且杀菌。
在另一个更具体的实施方案中，可以如下实现ha与壳二糖的交联：
将透明质酸(ha)(10kda-1000kda)在容器中称重。通过将壳二糖(购自carbosynthltd.uk)溶解在ph7.4的磷酸盐缓冲液中制备壳二糖的储备溶液。将dmtmm在容器中称重，并将壳二糖溶液添加至dmtmm中。通过添加1.2mhcl或0.25mnaoh将dmtmm-壳二糖溶液的ph调节至约7，并且然后将混合物添加至ha。将内容物充分均质化，并然后在15℃-55℃温育持续2-48小时。压制所得材料通过1mm钢网两次，并在naoh中溶胀。凝胶用1.2mhcl中和至ph7，并然后用乙醇沉淀。将所得的沉淀物用100mm在70％乙醇中的nacl洗涤，用70％乙醇以及用乙醇洗涤。将所得固体在25℃真空干燥。将沉淀物在ph7.4的0.7％nacl磷酸盐缓冲液中溶胀并压制通过过滤网三次。将交联的ha-凝胶填充在注射器上并且杀菌。
在另一个更具体的实施方案中，可以如下实现ha与还原的二氨基ha-四糖的交联：
将透明质酸(ha)(10kda-1000kda)在容器中称重。通过将还原的二氨基ha-四糖溶解在ph7.4的磷酸盐缓冲液中制备还原的二氨基ha-四糖的储备溶液。在容器中称重dmtmm，并将还原的二氨基ha-四糖溶液添加至dmtmm中。通过添加1.2mhcl或0.25mnaoh将dmtmm和还原的二氨基ha-四糖溶液的ph调节至约7，并且然后将混合物添加至ha中。将内容物充分均质化，并且在15℃-55℃温育持续2-48小时。压制所得材料通过1mm钢网两次，并在naoh中溶胀。将凝胶用1.2mhcl中和至ph7并用乙醇沉淀。将所得的沉淀物用100mm在70％乙醇中的nacl洗涤，用70％乙醇以及用乙醇洗涤。将所得固体在25℃真空干燥。将沉淀物在ph7.4的0.7％nacl磷酸盐缓冲液中溶胀并压制通过过滤网三次。将交联的ha-凝胶填充在注射器上并且杀菌。
在另一个更具体的实施方案中，可以如下实现ha与二肼基甲酸酯海藻糖的交联：
将α,α-d-海藻糖(1当量)(无水)(carbosynthltd,uk)溶解在干燥的二甲基甲酰胺(dmf)中，并且随后添加三乙胺(2-6当量)。将烧瓶冷却至0℃(冰/水)并在n2气氛下。将氯甲酸4-硝基苯酯(2-6当量)滴加到烧瓶中。允许所得混合物在室温搅拌持续2-48小时，然后浓缩，通过fc纯化，并真空干燥。将产物溶解在dmf中并将肼一水合物(2-20当量)添加至溶液中，并在0℃-50℃搅拌持续4-48小时。然后将反应浓缩，通过fc纯化，并且真空干燥，得到α,α-d-6,6’-二脱氧-6,6’-二肼基甲酸酯海藻糖(二肼基甲酸酯海藻糖，dct)。
将透明质酸(ha)(10kda-1000kda)在容器中称重。通过将二肼基甲酸酯海藻糖(dct)溶解在ph7.4的磷酸盐缓冲液中制备dct的储备溶液。将dmtmm在容器中称重，并将dct溶液添加至dmtmm中。通过添加1.2mhcl或0.25mnaoh将dmtmm-dct溶液的ph调节至约7，并且然后将混合物添加至ha中。将内容物充分均质化，并且在15℃-55℃温育持续2-48小时。压制所得材料通过1mm钢网两次，并在naoh中溶胀。将凝胶用1.2mhcl中和至ph7并用乙醇沉淀。将所得的沉淀物用100mm在70％乙醇中的nacl洗涤，用70％乙醇以及用乙醇洗涤。将所得固体在25℃真空干燥。将沉淀物在ph7.4的0.7％nacl磷酸盐缓冲液中溶胀并然后压制通过过滤网三次。将交联的ha-凝胶填充在注射器上并且杀菌。
在另一个更具体的实施方案中，可以如下实现ha与二氨氧基海藻糖的交联：
将n-羟基邻苯二甲酰亚胺(2-10当量)和三苯基膦(2-10当量)添加至α,α-d-海藻糖(1当量)(无水)(carbosynthltd,uk)在无水thf中的搅拌的悬浮液中，并将混合物搅拌持续5-60分钟。然后在0℃-40℃滴加偶氮二羧酸二异丙酯(diad，2-10当量)，并将混合物在0℃-40℃搅拌持续2-48小时。真空除去溶剂，并将粗产物通过fc纯化并真空干燥。用肼一水合物(2-20当量)处理产物在meoh和ch2cl2的混合物中的悬浮液，并将混合物在0℃-40℃搅拌持续2-24小时，然后浓缩，通过fc纯化，并真空干燥，得到二氨氧基海藻糖。
将透明质酸(ha)(10kda-1000kda)在容器中称重。通过将二氨氧基海藻糖(daot)溶解在ph7.4的磷酸盐缓冲液中制备daot的储备溶液。在容器中称重dmtmm，并将daot溶液添加至dmtmm中。通过添加1.2mhcl或0.25mnaoh将dmtmm-daot溶液的ph调节至约7，并且然后将混合物添加至ha中。将内容物充分均质化，并且在15℃-55℃温育持续2-48小时。压制所得材料通过1mm钢网两次，并在naoh中溶胀。将凝胶用1.2mhcl中和至ph7并用乙醇沉淀。将所得的沉淀物用100mm在70％乙醇中的nacl洗涤，用70％乙醇以及用乙醇洗涤。将所得固体在25℃真空干燥。将沉淀物在ph7.4的0.7％nacl磷酸盐缓冲液中溶胀并然后压制通过过滤网三次。将交联的ha-凝胶填充在注射器上并且杀菌。
实施例
不希望受限于此，本发明将在下文中通过实施例的方式来阐释。
定义和分析
swf-在盐水中进行溶胀因子分析。
[ps]-多糖浓度，例如ha浓度。用lc-sec-uv或nir测定ps浓度。
gelp-凝胶部分(有时也称为凝胶含量或gelc)是对是凝胶网络的一部分的多糖的百分比的描述。90％的数意味着只有10％的多糖不是网络的一部分。用lc-sec-uv测定凝胶中游离多糖的量。
swc-溶胀度是一克多糖的总液体吸收量，对于凝胶部分没有修正的。
swcc-修正的溶胀度(有时也称为swdc)是一克多糖的总液体吸收量，对于凝胶部分修正的。
crr-有效交联比率用lc-sec-ms分析，并且定义为：
crr为1.0表示所有的交联剂已经交联。
碱水解或热水解
在下面的一些实施例中，使产物经历碱水解或热水解，以便水解在交联工艺期间形成的酯键。碱/热水解在最终产物中仅产生酰胺交联键。如下进行碱/热水解：
碱水解
在室温将材料在0.25mnaoh(1g材料：9g0.25mnaoh，导致ph13)中溶胀持续至少1小时。将凝胶用1.2mhcl中和至ph7，并然后用乙醇沉淀。将所得沉淀物用100mm在70％乙醇中的nacl洗涤以除去过量试剂，并然后用70％乙醇洗涤以除去盐，并最后用乙醇洗涤以除去水。在真空干燥器中过夜除去乙醇。
将沉淀物在ph7.4的0.7％nacl磷酸盐缓冲液中溶胀并然后压制通过细过滤网三次。将凝胶填充在注射器上并且杀菌。在一些情况下，几只注射器没有被杀菌，以观察杀菌的效果。
热水解
将材料在室温在ph7.4的0.7％nacl磷酸盐缓冲液中溶胀。如果需要，将ph调节至7.2-7.5。将凝胶留在70℃持续20-24小时，并然后通过细过滤网三次将粒度减小。将凝胶填充在注射器上并且杀菌。在一些情况下，几只注射器没有被杀菌，以观察杀菌的效果。
透明质二氨基海藻糖(hyaluronicdiaminotrehalose)的合成
二氨基海藻糖(dath)是按照“syntheticcarbohydratepolymerscontainingtrehaloseresiduesinthemainchain:preparationandcharacteristicproperties”；keisukekurita,*naokomasuda,sadafumiaibe,kaorimurakami,shigeruishii,和shin-ichironishimurat；macromolecules1994,27,7544-7549中所描述的来合成的。
实施例1-透明质酸与二氨基海藻糖(dath)的交联
进行了一系列实验(实施例1-1至1-5)，其涉及使用4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(dmtmm)作为偶联剂，使不同分子量的透明质酸(ha)与不同摩尔比的dath交联。ha、dath和dmtmm之间的比率列于下表1中。
将透明质素(分子量(mw)从约100kda至约1000kda)在falcon管中称重。通过将二氨基海藻糖(dath)(0.001-0.005当量)溶解在ph7.4的磷酸盐缓冲液中制备dath的储备溶液。将dmtmm(0.05当量)在ptfe容器中称重，并将dath溶液添加至dmtmm中以将其溶解。用1.2mhcl或0.25mnaoh将dmtmm-dath溶液的ph调节至6-7，并然后添加至ha中。将内容物充分均质化，并然后在35℃温育持续24小时。
压制所得材料通过1mm钢网两次，并然后用naoh溶液处理。将凝胶用1.2mhcl中和至ph7，并然后用乙醇沉淀。将所得沉淀物用100mm在70％乙醇中的nacl洗涤以除去过量试剂，并然后用70％乙醇洗涤以除去盐，并最后用乙醇洗涤以除去水。将乙醇在真空干燥器中过夜除去。
将沉淀物在ph7.4的0.7％nacl磷酸盐缓冲液中溶胀并然后压制通过过滤网三次。将凝胶填充在注射器上并且杀菌。
表1.
na-不可用，由于分析未完成
实施例2-透明质酸与二氨基海藻糖(dath)的交联
进行了一系列实验(实施例2-1至2-11)，其涉及使用4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(dmtmm)作为偶联剂，使不同分子量的透明质酸(ha)与不同摩尔比的dath交联。ha、dath和dmtmm之间的比率列于下表2中。
将透明质酸在反应容器中称重。通过将交联剂(dath)溶解在ph7.4的磷酸盐缓冲液中制备交联剂(dath)的储备溶液。将dmtmm在ptfe容器中称重，并将交联剂溶液添加至dmtmm中以将其溶解。用1.2mhcl或0.25mnaoh将dmtmm-交联剂溶液的ph调节至6-7，并然后添加至ha中。将内容物充分均质化，并然后在35℃温育持续24小时。压制所得材料通过1mm钢网两次，并然后用热或碱处理。结果示于表2中。
表2.透明质酸与(dath)的交联概述
空的单元格-未完成分析
实施例3-透明质酸与壳二糖(cb)的交联
将透明质酸在反应容器中称重。通过将交联剂(壳二糖)溶解在ph7.4的磷酸盐缓冲液中制备交联剂(壳二糖)的储备溶液。将dmtmm在ptfe容器中称重，并将交联剂溶液添加至dmtmm中以将其溶解。用1.2mhcl将dmtmm-交联剂溶液的ph调节至6-7，并然后添加至ha中。将内容物充分均质化，并然后在35℃温育持续24小时。压制所得材料通过1mm钢网两次，并然后根据一般程序用热或碱处理。ha、壳二糖和dmtmm之间的比率列于下表3(实施例3-1至3-2)中。
实施例4-透明质酸与二氨基四-ha(da-4ha)的交联
二氨基四-ha(da-4ha)是按照以下方案来合成的：
步骤1
在室温将ha-4(500mg，0.61mmol)在水(5ml)中的溶液用硼氢化钠(23.05mg，0.61mmol)处理，并将所得溶液搅拌持续3小时，浓缩至干，得到作为白色泡沫的还原产物1(532mg，假设为100％)。
lcms(tr＝0.28分钟，es+＝779.4(m-2na+2h)
步骤2
将还原产物1(532mg)溶解在nh2oh水溶液(5ml，50％v/v/)中，并添加固体nh4i(100mg)。将所得悬浮液在70℃加热持续48小时，冷却至室温并浓缩至干，得到残余物。将残余物在纯etoh中沉淀，并将所得沉淀通过过滤收集并干燥至恒重，以定量收率得到二胺2和单胺3的1:1混合物。在没有另外纯化的情况下使用粗反应产物。
2:lcms(tr＝0.16分钟，es+＝695.36(m-2na+2h)
3:lcms(tr＝0.19分钟，es+＝737.47(m-2na+2h)
将透明质酸在反应容器中称重。通过将如上所述合成的交联剂(二氨基四-ha)和dmtmm分别溶解在ph7.4的磷酸盐缓冲液中制备交联剂(二氨基四-ha)的储备溶液和dmtmm的储备溶液。将溶液的ph调节至7，并然后添加至ha中。将内容物充分均质化，并然后在23℃温育持续24小时。压制所得材料通过1mm钢网两次，并然后根据一般程序用热处理。ha、二氨基四-ha和dmtmm之间的比率列于下表3(实施例4)中。
实施例5-细菌肝素前体(hep)与二氨基海藻糖(dath)的交联
将偶联剂dmtmm和交联剂dath在单独的反应容器中称重，并溶解在磷酸盐缓冲液(ph7.4)中。用1.2mhcl或0.25mnaoh将溶液ph调节至ph7-7.5。此后，将dmtmm溶液和dath溶液相继添加至在反应容器中称重的细菌肝素前体中。将内容物充分均质化，并然后在35℃温育持续24小时。压制所得材料通过1mm钢网两次，并然后根据一般程序用热处理。细菌肝素前体、dath和dmtmm之间的比率列于下表3(实施例5-1至5-2)中。
实施例6-硫酸软骨素(cs)与二氨基海藻糖(dath)的交联
将偶联剂dmtmm和交联剂dath在单独的反应容器中称重，并溶解在磷酸盐缓冲液(ph7.4)中。用1.2mhcl或0.25mnaoh将溶液ph调节至ph7-7.5。此后，将dmtmm溶液和dath溶液相继添加至在反应容器中称重的硫酸软骨素中。将内容物充分均质化，并然后在35℃温育持续24小时。压制所得材料通过1mm钢网两次，并然后根据一般程序用热处理。硫酸软骨素、dath和dmtmm之间的比率列于下表3(实施例6-1至6-2)中。
表3.实施例3-6的交联概述
ps＝多糖、ha＝透明质素、hep＝细菌肝素前体、cs＝硫酸软骨素、da-4ha＝二氨基四-ha、cb＝壳二糖
空的单元格-未完成分析。