一种氧化酶及其应用的制作方法

本发明克隆表达了一种L-α-羟酸氧化酶，并公开了其核苷酸序列和氨基酸序列及酶学性质和应用，属于工业微生物领域。

背景技术：

L-α-羟酸氧化酶(L-α-hydroxyacid oxidase)是一种以FMN(FAD)为辅酶的脱氢酶(Aliphatic l-α-hydroxyacid oxidase from rat livers purification and properties.Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Enzymology 1968,167:9-22)，通常包含有乙醇酸氧化酶(glycolate oxidase)(Preparation and some properties of crystalline glycolic acid oxidase of spinach.J.Biol.Chem.1958,231(1):135–57)、L-乳酸氧化酶(L-lactate oxidase)(Conversion of L-lactate oxidase to a long chain alpha-hydroxyacid oxidase by site-directed mutagenesis of alanine 95to glycine.J Biol Chem.1996 8；271(45):28300-28305)。可用于生物传感器中测定乳酸的含量，或氧化L-乳酸生产丙酮酸。也有被用于光学纯α-羟酸的制备(中国专利201210109290.4)

目前为止，已经在恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)，绿色气球菌(Aerococcus viridians)，链球菌属(Streptococcus sp.)，片球菌属(Pediococcus sp.)，乳酸乳球菌(Lactococus lactis)，迟钝爱德华菌(Edwardsiella tarda)，耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis),运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)和过氧化醋杆菌(Acetobacter peroxidans)等细菌中克隆表达得到了L-乳酸氧化酶。L-乳酸氧化酶也在一些真菌中检测到，例如白地霉(Geotrichum candidum)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。(Search for Lactate Oxidase Producer Microorganisms，Applied Biochemistry and Microbiology,2007,43(2)178–181)

本发明首次从扩展短杆菌(Brevibacterium linens)中克隆表达出一种新型的L-α-羟酸氧化酶，该酶不仅可以氧化(S)-α-羟酸，而且可以氧化(S)-α-羟酸酯，可应用于光学纯(R)-α-羟酸酯和(R)-α-羟酸的制备。

技术实现要素：

本发明从扩展短杆菌(Brevibacterium linens)中克隆得到了一种L-α-羟酸氧化酶的基因，利用大肠杆菌工程菌异源表达，公开了其相关的酶学特性，并进行了应用研究。

本发明的技术方案如下：

1、菌株

本发明L-α-羟酸氧化酶基因的来源菌株为：Brevibacterium linens ATCC 8377，购自美国ATCC菌种库。

2、L-α-羟酸氧化酶基因的克隆

提取Brevibacterium linens ATCC 8377菌体基因组总DNA。设计特异性引物，应用PCR方法，扩增出α-羟酸氧化酶基因全长编码框序列。并构建重组质粒。

3、L-α-羟酸氧化酶表达与纯化

将重组质粒导入E.coli BL21(DE3)中，诱导表达。菌体破碎后得到粗酶液，纯化后冷冻干燥备用。

4、L-α-羟酸氧化酶的酶学性质分析

以L-乳酸为底物研究pH对本发明所述L-α-羟酸氧化酶酶活的影响。

以L-乳酸为底物研究温度对本发明所述L-α-羟酸氧化酶酶活的影响。

L-α-羟酸氧化酶的底物特异性分析：所用的底物有L-乳酸、乙醇酸、L-苯乳酸、L-酒石酸、L-苹果酸、L-对羟基苯乳酸、L-丹参素、L-扁桃酸。

酶活测定方法为：根据Characterization of a Lactate Oxidase from a Strain of Gram Negative Bacterium from Soil，Applied Biochemistry and Biotechnology,56,1996,278-288。所述方法进行。

5、L-α-羟酸氧化酶拆分混旋的α-羟酸酯

拆分α-羟酸酯(alpha-hydroxy esters)的方法为：取纯化好的酶0.1克于50mL三角瓶中，加入溶有α-羟酸酯5mM的pH 7的磷酸盐缓冲液中，于30℃，150rpm水浴摇床中转化16h，转化后液相色谱分析上清液。(S)-α-羟酸酯中的α-羟基被脱氢氧化成对应的α-酮酸酯，(R)-α-羟酸酯不被氧化。

产物(R)-α-羟酸酯的光学纯度通过对映体过量值(％e.e)来评价：

对映体过量值％e.e＝[(S_R-S_S)/(S_R+S_S)]×100％

(R)-α-羟酸酯得率(％)＝(S_R/S₀)×100％

式中S_R为反应后(R)-对映体的峰面积，S_S为反应后(S)-对映体的液相色谱峰面积，S₀为反应前(R)-和(S)-对映体的液相色谱峰面积之和。

产物测定液相色谱条件为：Chiralcel OD-H手性柱(4.6×250mm)，流动相体积比为正己烷：异丙醇：三氟乙酸＝80:20:0.1，流速为0.5mL/min，柱温25℃，检测波长210nm，进样量20μL。

所述的α-羟酸酯为下列之一：丹参素冰片酯、丹参素异丙酯、苯乳酸冰片酯、苯乳酸异丙酯、对羟基苯乳酸冰片酯、对羟基苯乳酸异丙酯、扁桃酸冰片酯、扁桃酸异丙酯、丹参素细辛醇酯、乳酸冰片酯、苯乳酸细辛醇酯、对羟基苯乳酸细辛醇酯。

所述的α-羟酸酯，根据中国专利200610042787.3、201410180490.8、201410175950.8和20140699506.6公布的方法合成。

本发表明的有益之处：从Brevibacterium linens ATCC 8377中克隆得到了一种L-α-羟酸氧化酶，该酶可以氧化(S)-α-羟酸和(S)-α-羟酸酯，可用于规模化制备手性纯(R)-α-羟酸酯，具有重要的工业应用价值。

具体实施方式

实施例1

本实施例为本发明所述L-α-羟酸氧化酶基因的克隆与大肠杆菌工程菌构建。

1、Brevibacterium linens ATCC 8377DNA的提取

将Brevibacterium linens ATCC 8377菌株在LB培养基中培养12h，12,000rmp/min离心10min得到菌体，应用细菌基因组DNA抽提试剂盒(TaKaRa公司)按照其操作提取菌体基因组总DNA，放冰箱备用。

2、大肠杆菌感受态制备

(1)接种E.coli DH5α和BL21(DE3)分别于含有20mL LB培养基的250mL摇瓶中，37℃、200rpm/min培养过夜。

(2)按1％接种量接种于50mL LB培养基中，37℃培养至OD₆₀₀约0.6(约2～3h)。

(3)将菌液转移到50mL预冷的离心管中，冰上放置30min，8000rpm/min、4℃离心5min。

(4)弃上清，加入5mL预冷的0.1mol/L CaCl₂溶液，使菌体悬浮，冰上放置20min，8000rpm/min、4℃离心5min。重复2次。

(5)弃上清，加入1.5mL预冷的0.1mol/L CaCl₂溶液(含15％甘油)，轻轻悬浮菌体，然后按每个离心管(1.5mL)加入100μL菌液分装，-70℃冰箱保藏备用。

3、L-α-羟酸氧化酶基因的克隆

(1)引物设计

设计引物序列为：

引物1：5'GCCGGGATCCATGAAACGTCGACTGCCTGATCTC 3'

引物2：5'GCCGTCTAGAGAGTCGGCCGGCAGCTCC 3'

(2)PCR扩增

用以上合成的两条引物，以Brevibacterium linens ATCC 8377的基因组DNA为模板进行PCR扩增。

本步骤中扩增体系为：

扩增程序为：

98℃，10min

98℃，10sec；55℃，15sec；72℃，2min反应30个循环

72℃，10min

PCR产物送华大基因测序后得到该的基因序列，如SEQ ID NO:1所示。根据该基因序列得到的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

(3)双酶切和连接

将pColdⅡ质粒和PCR产物进行双酶切，酶切体系为：10×cut buffer 3μl,DNA 4μl，酶BamHI和XbaI各0.5μl，无菌水2μl共30μl。37℃水浴下双酶切1h。将DNA片段克隆到pColdⅡ载体上，并转化到E.coli DH5α感受态细胞中。连接体系：10×DNA ligase buffer 2.5μl，DNA片段8μl，载体DNA 2μl，T4DNA ligase 1μl，无菌水11.5μl共25μl。16℃水浴下连接12h-16h。

(4)转化

步骤：

1在连接体系中加入100μl DH5α感受态细菌，轻混匀，冰浴30min。

2放入预热的42℃水浴中，放置90s进行热休克处理。

3立即冰浴2min。

4加入1ml不含抗生素的LB培养液，37℃培养1h使菌体复苏。

5将菌体均匀涂布在含抗生素的LB平板上。

6培养24h长势良好。挑单菌落进行菌落PCR，核酸电泳验证，提取重组质粒。将重组质粒导入BL21大肠杆菌感受态中，保存备用。

实施例2

本实施例为本发明所述L-α-羟酸氧化酶的诱导表达及分离纯化。

1、加500μl重组菌液到50ml LB培养液中。37℃培养2.5h，15℃下静置0.5h。再加20μl 0.5M的IPTG，15℃下冷诱导培养24h。将发酵液进行离心(8000rmp/min，10min)得到菌体，用磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液(20mmol/L，pH 7.0)复溶菌体，超声破碎仪破碎，离心(8000rmp/min，10min)收集上清得到粗酶液。

2、将步骤1得到的粗酶液采用AKTA avant 150蛋白纯化系统操作进行镍柱纯化，洗脱方法为：将A1、A2、B1、B2四根管路都放进水里，设置system flow 20ml/min流速，进行排气。然后设置system flow 1ml/min、flow path(column position 3)、delta pressure 0.3、pre-pressure 0.5、Gradient 0、inset A1，待水滴均匀流出后装柱子，平衡十分钟之后把A1放进结合液中，B1放进洗脱液中，再进行排气一次，平衡二十分钟，然后上样粗酶液，用500mM的高浓度咪唑缓冲液(B1所处溶液)梯度洗脱目的蛋白，将吸附在离子柱上的蛋白洗脱下来得到纯化的酶。纯化后的酶经冷冻干燥备用。

实施例3

本实施例为本发明所述L-α-羟酸氧化酶的最适温度。以L-乳酸为底物，将底物与pH为6.0的磷酸缓冲液在30-60℃不同的温度条件下水浴15min，测定L-α-羟酸氧化酶的酶活，确定酶的最适反应温度为40℃。

实施例4

本实施例为本发明所述L-α-羟酸氧化酶的最适pH值。以L-乳酸为底物，将底物在pH 3-9，40℃水浴15min测定酶的酶活，结果发现在pH 6.0条件下L-α-羟酸氧化酶酶活最高。

实施例5

本实施例为本发明所述L-α-羟酸氧化酶与不同底物的反应特性列于表2中。

表2 L-α-羟酸氧化酶对不同底物的活性

实施例6

根据发明内容中的方法拆分各种外消旋α-羟酸酯，结果如下表所示：

表3拆分各种外消旋α-羟酸酯的效果

由上表可以看出，当在反应时间充分时，可以得到各类高光学纯的(R)-α-羟酸酯，该酶的光学专一性非常好。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种氧化酶及其应用

<130> No

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1254

<212> DNA

<213> Brevibacterium linens ATCC 8377

<400> 1

atgaaacgtc gactgcctga tctcaaagag cttgccccct tgctgcagtt cgacctgcct 60

cgcctcgacc gggtcgccgc caggctggaa gcggccgcag acatctggga cctccgccgc 120

atcgccaagc gcgtgactcc tacagccccg ttcgactatg tcgacggtgc cgcactggac 180

gagcggacat tggcgaagaa ccgggacgct ctgggcaacg tcgagcttct tcctcgcatc 240

ctccacggag tcgacgcccc ggatacgtcg acgacgatcg ccggcgcccg tgttcgactg 300

cccttcggca tcgctccgac cggttacaca cgcatgatgc actccgaagg cgaagtcgcc 360

ggagtgcgtg cggccgcgaa ggccggaatc ccgttctcgc tgtcgacgat gggaacgacc 420

tcggtcgaag acgtcgcgca ggcggcaccg gattccaccc ggtggttcca gctctacctg 480

tggaaggacc gacagcgcag cctcgacctg atccagcgag ccgccgccag cggatacaag 540

actctgctgg tcaccgtcga caccccgatc actggccagc gtctgcgcga tcaccgcaac 600

ggtctgacga tcccgccccg gctgacgctg ggaacgattc tcgacgcctc ctaccggccc 660

ggctggtggt tcaacttcct caccaccgaa ccgccgaagt acgcgtcact gtcgaacacc 720

tctcagtccc tggcggagat gacgcagacg atgttcgacc cgacccttga cctcgaggac 780

ctgcggtgga tccgcgaaca gtggaacgga cgactgttcg tcaagggcat tctcaccgcc 840

gacgatgccc gacgtgccca atccgtcgga gccgatgggc tcgtcgtgtc caaccacggc 900

ggtcgccaac tcgatcgggc cccggactcg ctgacctcac tggccgaagt ccgcgcggag 960

gtcgggccgg agatggagct gatcttcgac tccgggatca tgtccggcac cgatgtcgtc 1020

gccgcgctgt gtgccggagc ggacttcgtg ctcatcggtc gggcgtatct atacgggctc 1080

atggccggcg gtcagcgagg cgtcgagagg gccatcgcac tcatccaaca ggagatcctc 1140

accgcgatgg ggctcatggg tgcccgcagc atctctgatc tcggccccga actcgttcgt 1200

ggcctgcccc aggcaccgaa cacagatcag gagctgccgg ccgactccat gtga 1254

<210> 2

<211> 417

<212> PRT

<213> Brevibacterium linens ATCC 8377

<400> 2

Met Lys Arg Arg Leu Pro Asp Leu Lys Glu Leu Ala Pro Leu Leu Gln

1 5 10 15

Phe Asp Leu Pro Arg Leu Asp Arg Val Ala Ala Arg Leu Glu Ala Ala

20 25 30

Ala Asp Ile Trp Asp Leu Arg Arg Ile Ala Lys Arg Val Thr Pro Thr

35 40 45

Ala Pro Phe Asp Tyr Val Asp Gly Ala Ala Leu Asp Glu Arg Thr Leu

50 55 60

Ala Lys Asn Arg Asp Ala Leu Gly Asn Val Glu Leu Leu Pro Arg Ile

65 70 75 80

Leu His Gly Val Asp Ala Pro Asp Thr Ser Thr Thr Ile Ala Gly Ala

85 90 95

Arg Val Arg Leu Pro Phe Gly Ile Ala Pro Thr Gly Tyr Thr Arg Met

100 105 110

Met His Ser Glu Gly Glu Val Ala Gly Val Arg Ala Ala Ala Lys Ala

115 120 125

Gly Ile Pro Phe Ser Leu Ser Thr Met Gly Thr Thr Ser Val Glu Asp

130 135 140

Val Ala Gln Ala Ala Pro Asp Ser Thr Arg Trp Phe Gln Leu Tyr Leu

145 150 155 160

Trp Lys Asp Arg Gln Arg Ser Leu Asp Leu Ile Gln Arg Ala Ala Ala

165 170 175

Ser Gly Tyr Lys Thr Leu Leu Val Thr Val Asp Thr Pro Ile Thr Gly

180 185 190

Gln Arg Leu Arg Asp His Arg Asn Gly Leu Thr Ile Pro Pro Arg Leu

195 200 205

Thr Leu Gly Thr Ile Leu Asp Ala Ser Tyr Arg Pro Gly Trp Trp Phe

210 215 220

Asn Phe Leu Thr Thr Glu Pro Pro Lys Tyr Ala Ser Leu Ser Asn Thr

225 230 235 240

Ser Gln Ser Leu Ala Glu Met Thr Gln Thr Met Phe Asp Pro Thr Leu

245 250 255

Asp Leu Glu Asp Leu Arg Trp Ile Arg Glu Gln Trp Asn Gly Arg Leu

260 265 270

Phe Val Lys Gly Ile Leu Thr Ala Asp Asp Ala Arg Arg Ala Gln Ser

275 280 285

Val Gly Ala Asp Gly Leu Val Val Ser Asn His Gly Gly Arg Gln Leu

290 295 300

Asp Arg Ala Pro Asp Ser Leu Thr Ser Leu Ala Glu Val Arg Ala Glu

305 310 315 320

Val Gly Pro Glu Met Glu Leu Ile Phe Asp Ser Gly Ile Met Ser Gly

325 330 335

Thr Asp Val Val Ala Ala Leu Cys Ala Gly Ala Asp Phe Val Leu Ile

340 345 350

Gly Arg Ala Tyr Leu Tyr Gly Leu Met Ala Gly Gly Gln Arg Gly Val

355 360 365

Glu Arg Ala Ile Ala Leu Ile Gln Gln Glu Ile Leu Thr Ala Met Gly

370 375 380

Leu Met Gly Ala Arg Ser Ile Ser Asp Leu Gly Pro Glu Leu Val Arg

385 390 395 400

Gly Leu Pro Gln Ala Pro Asn Thr Asp Gln Glu Leu Pro Ala Asp Ser

405 410 415

Met