一种氧化酶及其应用的制作方法

本发明克隆表达了一种D-乳酸氧化酶，并公开了其核苷酸序列和氨基酸序列及酶学性质和应用，属于工业微生物领域。

背景技术：

D-乳酸氧化酶(D-lactate oxidase)是一种以FAD(FMN)为辅酶的α-羟酸氧化酶(习惯上均称之为D-乳酸氧化酶)。D-乳酸氧化酶可用于生物传感器中测定乳酸的含量，或氧化D-乳酸生产丙酮酸。也有被用于光学纯α-羟酸的制备(中国专利201210109290.4)

目前为止，已经在迟钝爱德华菌(Edwardsiella tarda)和运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)等中发现了D-乳酸氧化酶。(Kalnenieks U,Galinina N,Bringer-Meyer S,et al.Membrane D-lactate oxidase in Zymomonas mobilis:evidence for a branched respiratory chain[J].FEMS microbiology letters,1998,168(1):91-97)

本发明首次从Kerstersia gyiorum中克隆表达出一种新型的D-乳酸氧化酶，该酶不仅可以氧化(R)-α-羟酸，而且可以氧化(R)-α-羟酸酯，该反应与NAD(NADP)为辅酶的乳酸脱氢酶参与的反应相比逆反应极微弱，可应用于光学纯(S)-α-羟酸酯和(S)-α-羟酸的制备。

技术实现要素：

本发明从Kerstersia gyiorum中克隆得到了一种以FAD为辅酶的D-乳酸氧化酶的基因，利用大肠杆菌工程菌异源表达，公开了其相关的酶学特性，并进行了应用研究。

本发明的技术方案如下：

1、菌株

本发明D-乳酸氧化酶基因的来源菌株为：Kerstersia gyiorum DSM 16618，购自DSMZ-德国微生物菌种保藏中心。

2、D-乳酸氧化酶基因的克隆

提取Kerstersia gyiorum DSM 16618菌体基因组总DNA。设计特异性引物，应用PCR方法，扩增出D-乳酸氧化酶基因全长编码框序列。并构建重组质粒。

3、D-乳酸氧化酶表达与纯化

将重组质粒导入E.coli BL21(DE3)中，诱导表达。菌体破碎后得到粗酶液，纯化后冷冻干燥备用。

4、D-乳酸氧化酶的酶学性质分析

以D-乳酸为底物研究pH对本发明所述D-乳酸氧化酶酶活的影响。

以D-乳酸为底物研究温度对本发明所述D-乳酸氧化酶酶活的影响。

D-乳酸氧化酶的底物特异性分析：所用的底物有D-乳酸、乙醇酸、D-苯乳酸、D-对羟基苯乳酸、D-酒石酸、D-苹果酸、D-扁桃酸、D-丹参素。

酶活测定方法为：根据Characterization of a Lactate Oxidase from a Strain of Gram Negative Bacterium from Soil，Applied Biochemistry and Biotechnology,56,1996,278-288。所述方法进行。

5、D-乳酸氧化酶拆分混旋的α-羟酸酯

拆分α-羟酸酯(alpha-hydroxy esters)的方法为：取纯化好的酶0.1克于50mL三角瓶中，加入溶有α-羟酸酯5mM的pH 7的磷酸盐缓冲液中，于30℃，150rpm水浴摇床中转化16h，转化后液相色谱分析上清液。(R)-α-羟酸酯中的α-羟基被脱氢氧化成对应的α-酮酸酯，(S)-α-羟酸酯不被氧化。

产物(S)-α-羟酸酯的光学纯度通过对映体过量值(％e.e)来评价：

对映体过量值％e.e＝[(S_S-S_R)/(S_S+S_R)]×100％

(S)-α-羟酸酯得率(％)＝(S_S/S₀)×100％

式中S_R为反应后(R)-对映体的峰面积，S_S为反应后(S)-对映体的液相色谱峰面积，S₀为反应前(R)-和(S)-对映体的液相色谱峰面积之和。

产物测定液相色谱条件为：Chiralcel OD-H手性柱(4.6×250mm)，流动相体积比为正己烷：异丙醇：三氟乙酸＝80:20:0.1，流速为0.5mL/min，柱温25℃，检测波长210nm，进样量20μL。

所述的α-羟酸酯为下列之一：丹参素冰片酯、丹参素异丙酯、苯乳酸冰片酯、苯乳酸异丙酯、对羟基苯乳酸冰片酯、对羟基苯乳酸异丙酯、扁桃酸冰片酯、扁桃酸异丙酯、丹参素细辛醇酯、乳酸冰片酯、苯乳酸细辛醇酯、对羟基苯乳酸细辛醇酯。

所述的α-羟酸酯，根据中国专利200610042787.3、201410180490.8、201410175950.8和20140699506.6公布的方法合成。

本发表明的有益之处：从Kerstersia gyiorum DSM 16618中克隆表达出一种新型的D-乳酸氧化酶，该酶可以氧化(R)-α-羟酸和(R)-α-羟酸酯，可用于规模化制备手性纯(S)-α-羟酸酯，具有重要的工业应用价值。

具体实施方式

实施例1

本实施例为本发明所述D-乳酸氧化酶基因的克隆与大肠杆菌工程菌构建。

1、Kerstersia gyiorum DSM 16618 DNA的提取

将Kerstersia gyiorum DSM 16618菌株在LB培养基中培养12h，12,000rmp/min离心10min得到菌体，应用细菌基因组DNA抽提试剂盒(TaKaRa公司)按照其操作提取菌体基因组总DNA，放冰箱备用。

2、大肠杆菌感受态制备

(1)接种E.coli DH5α和BL21(DE3)分别于含有20mL LB培养基的250mL摇瓶中，37℃、200rpm/min培养过夜。

(2)按1％接种量接种于50mL LB培养基中，37℃培养至OD₆₀₀约0.6(约2～3h)。

(3)将菌液转移到50mL预冷的离心管中，冰上放置30min，8000rpm/min、4℃离心5min。

(4)弃上清，加入5mL预冷的0.1mol/L CaCl₂溶液，使菌体悬浮，冰上放置20min，8000rpm/min、4℃离心5min。重复2次。

(5)弃上清，加入1.5mL预冷的0.1mol/L CaCl₂溶液(含15％甘油)，轻轻悬浮菌体，然后按每个离心管(1.5mL)加入100μL菌液分装，-70℃冰箱保藏备用。

3、D-乳酸氧化酶基因的克隆

(1)引物设计

设计引物序列为：

引物1：5'GCCGGGATCCATGACCACCGAAAGCACTGACAGCA 3'

引物2：5'GCCGTCTAGAGTCCTGGCTGCTGCGGTAGGCC 3'

(2)PCR扩增

用以上合成的两条引物，以Kerstersia gyiorum DSM 16618的基因组DNA为模板进行PCR扩增。

本步骤中扩增体系为：

扩增程序为：

98℃，10min

98℃，10sec；55℃，15sec；72℃，2min反应30个循环

72℃，10min

PCR产物送华大基因测序后得到该酶的基因序列，如SEQ ID NO:1所示。根据该基因序列得到的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

(3)双酶切和连接

将pColdⅡ质粒和PCR产物进行双酶切，酶切体系为：10×cut buffer 3μl,DNA 4μl，酶BamHI和XbaI各0.5μl，无菌水2μl共30μl。37℃水浴下双酶切1h。将DNA片段克隆到pColdⅡ载体上，并转化到E.coli DH5α感受态细胞中。连接体系：10×DNA ligase buffer 2.5μl，DNA片段8μl，载体DNA 2μl，T4 DNA ligase 1μl，无菌水11.5μl共25μl。16℃水浴下连接12h-16h。

(4)转化

步骤：

1在连接体系中加入100μl DH5α感受态细菌，轻混匀，冰浴30min。

2放入预热的42℃水浴中，放置90s进行热休克处理。

3立即冰浴2min。

4加入1ml不含抗生素的LB培养液，37℃培养1h使菌体复苏。

5将菌体均匀涂布在含抗生素的LB平板上。

6培养24h长势良好。挑单菌落进行菌落PCR，核酸电泳验证，提取重组质粒。将重组质粒导入BL21大肠杆菌感受态中，保存备用。

实施例2

本实施例为本发明所述D-乳酸氧化酶的诱导表达及分离纯化。

1、加500μl重组菌液到50ml LB培养液中。37℃培养2.5h，15℃下静置0.5h。再加20μl 0.5M的IPTG，15℃下冷诱导培养24h。将发酵液进行离心(8000rmp/min，10min)得到菌体，用磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液(20mmol/L，pH 7.0)复溶菌体，超声破碎仪破碎，离心(8000rmp/min，10min)收集上清得到粗酶液。

2、将步骤1得到的粗酶液采用AKTA avant 150蛋白纯化系统操作进行镍柱纯化，洗脱方法为：将A1、A2、B1、B2四根管路都放进水里，设置system flow 20ml/min流速，进行排气。然后设置system flow 1ml/min、flow path(column position 3)、delta pressure 0.3、pre-pressure 0.5、Gradient 0、inset A1，待水滴均匀流出后装柱子，平衡十分钟之后把A1放进结合液中，B1放进洗脱液中，再进行排气一次，平衡二十分钟，然后上样粗酶液，用500mM的高浓度咪唑缓冲液(B1所处溶液)梯度洗脱目的蛋白，将吸附在离子柱上的蛋白洗脱下来得到纯化的酶。纯化后的酶经冷冻干燥备用。

实施例3

本实施例为本发明所述D-乳酸氧化酶的最适温度。以D-乳酸为底物，将底物与pH为6.0的磷酸缓冲液在30-60℃不同的温度条件下水浴15min，测定D-乳酸氧化酶的酶活，确定酶的最适反应温度为35℃。

实施例4

本实施例为本发明所述D-乳酸氧化酶的最适pH值。以D-乳酸为底物，将底物在pH 3-9，35℃水浴15min测定酶的酶活，结果发现在pH 6.0条件下D-乳酸氧化酶酶活最高。

实施例5

本实施例为本发明所述D-乳酸氧化酶与不同底物的反应特性，列于表2中。

表2 D-乳酸氧化酶对不同底物的活性

实施例6

根据发明内容中的方法拆分各种外消旋α-羟酸酯，结果如下表所示：

表3拆分各种外消旋α-羟酸酯的效果

由上表可以看出，当在反应时间充分时，可以得到各类高光学纯的(S)-α-羟酸酯，该酶的光学专一性非常好。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种氧化酶及其应用

<130> No

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1764

<212> DNA

<213> Kerstersia gyiorum DSM16618

<400> 1

atgaccaccg aaagcactga cagcaccgcc agtgacggca cccagctgct gtcccggttg 60

cgccagctgg tcggcgccga caacgtcctg acccatgcct ccgccacccg gcgcttccgc 120

aaggggcatc gtaccggcga aggcaaagtc ctcgccgtcg tgcggcccgg cacgctgctc 180

gaacaatggc aggcagtaca ggccattgtc gcttcgggcc gcattgtcct gatgcaggca 240

gcgaacactg gcctgaccgg cggctcgacg ccggacggca acgactacga ccgcgaaatc 300

gtcctgatca acacgatgcg catcactggc gtgcaggtca tacgtggcgg cgagcaagtt 360

gtctgcctgc ccggcgccac gctggaccgc ctggagcaaa ccctggcccc cctgggccgc 420

gagccacact cggtgattgg ttcctcctgc ataggcgcgt cggtgctggg cggagtctgc 480

aacaattccg gtggcgcact ggtgcggcgc ggcccggcct acaccgaact ggccctgtac 540

gcccgggtcc gggaagacgg cgaactggag ctcgtcaatc acctcggtat ccggttgggt 600

gacacgcccg aggaaatcct gacccgcctg caatccggtg actaccagcc cgaggacatc 660

gccaacgacg ccggtgcagc atcggacccg cgctatgccg aacacgtccg gcaggtagac 720

gagcccacgc ccgcgcgttt caatgccgac ccctcgcgac tgcacgaagc gtccggctct 780

gccgggcgca tctgcctgtt tgcggtgcgc ctggatacct tcccgcgcga accgagcacg 840

gtgttctata tcggcagcaa caaccccgac gacctcaccg aggtgcgccg ccacctgctg 900

actgaactgc ccagcctgcc catcgccggc gaatacatcc accgcacggc gttcgacatc 960

ggcgcgaagt acggcaagga tgtgttcctg ctgatcgaca agttcggcac ggcgcgcgtc 1020

cccaaggcct tcgccatcaa aagccgcatt gacgacgtct gcgaacgcct gggtctgcca 1080

ggcctcaccg accacgtgct gcaggctttc accgcgctgc tgcccaatca cctgccgcgc 1140

cgcatgcgcg attaccgcga ccgctacgag caccacctgc tgctgcgcgt ctccaacgat 1200

acggccgacg ccacgcgcgc cttcctgcaa cagcatttcg gcggcagcag cagcggcgcc 1260

tatttcgagt gcgacgcgaa agaaggccgc aaggccttcc tacaccgctt tgccatcgct 1320

ggggcggcca tccgctaccg cgacacgcat cgccgctcgg tccaggacat cgtcgccctg 1380

gatatcgcgc tacgccgcaa cgaccgcgac tgggtagaac aactgcccca ggagatggaa 1440

ggcgacatca tccacaaact ttactacggc cacttcttct gccacgtctt ccaccaggac 1500

tacattgtcc gcaagggcgt ggacccgctg gcaatggaac acagcatgtg gaaactgctg 1560

gatgcacgcc aggcggaata cccggccgag cacaatgtcg gccatcttta cgtcgccaag 1620

ccggcgctgg ccgattttta ccgccagctc gacccgacca ataccttcaa tcccggcatc 1680

ggccatacct ccaagctcaa gcattggggc aattgctgcg aacagcgcgg cctgcctgcg 1740

gcctaccgca gcagccagga ctga 1764

<210> 2

<211> 587

<212> PRT

<213> Kerstersia gyiorum DSM16618

<400> 2

Met Thr Thr Glu Ser Thr Asp Ser Thr Ala Ser Asp Gly Thr Gln Leu

1 5 10 15

Leu Ser Arg Leu Arg Gln Leu Val Gly Ala Asp Asn Val Leu Thr His

20 25 30

Ala Ser Ala Thr Arg Arg Phe Arg Lys Gly His Arg Thr Gly Glu Gly

35 40 45

Lys Val Leu Ala Val Val Arg Pro Gly Thr Leu Leu Glu Gln Trp Gln

50 55 60

Ala Val Gln Ala Ile Val Ala Ser Gly Arg Ile Val Leu Met Gln Ala

65 70 75 80

Ala Asn Thr Gly Leu Thr Gly Gly Ser Thr Pro Asp Gly Asn Asp Tyr

85 90 95

Asp Arg Glu Ile Val Leu Ile Asn Thr Met Arg Ile Thr Gly Val Gln

100 105 110

Val Ile Arg Gly Gly Glu Gln Val Val Cys Leu Pro Gly Ala Thr Leu

115 120 125

Asp Arg Leu Glu Gln Thr Leu Ala Pro Leu Gly Arg Glu Pro His Ser

130 135 140

Val Ile Gly Ser Ser Cys Ile Gly Ala Ser Val Leu Gly Gly Val Cys

145 150 155 160

Asn Asn Ser Gly Gly Ala Leu Val Arg Arg Gly Pro Ala Tyr Thr Glu

165 170 175

Leu Ala Leu Tyr Ala Arg Val Arg Glu Asp Gly Glu Leu Glu Leu Val

180 185 190

Asn His Leu Gly Ile Arg Leu Gly Asp Thr Pro Glu Glu Ile Leu Thr

195 200 205

Arg Leu Gln Ser Gly Asp Tyr Gln Pro Glu Asp Ile Ala Asn Asp Ala

210 215 220

Gly Ala Ala Ser Asp Pro Arg Tyr Ala Glu His Val Arg Gln Val Asp

225 230 235 240

Glu Pro Thr Pro Ala Arg Phe Asn Ala Asp Pro Ser Arg Leu His Glu

245 250 255

Ala Ser Gly Ser Ala Gly Arg Ile Cys Leu Phe Ala Val Arg Leu Asp

260 265 270

Thr Phe Pro Arg Glu Pro Ser Thr Val Phe Tyr Ile Gly Ser Asn Asn

275 280 285

Pro Asp Asp Leu Thr Glu Val Arg Arg His Leu Leu Thr Glu Leu Pro

290 295 300

Ser Leu Pro Ile Ala Gly Glu Tyr Ile His Arg Thr Ala Phe Asp Ile

305 310 315 320

Gly Ala Lys Tyr Gly Lys Asp Val Phe Leu Leu Ile Asp Lys Phe Gly

325 330 335

Thr Ala Arg Val Pro Lys Ala Phe Ala Ile Lys Ser Arg Ile Asp Asp

340 345 350

Val Cys Glu Arg Leu Gly Leu Pro Gly Leu Thr Asp His Val Leu Gln

355 360 365

Ala Phe Thr Ala Leu Leu Pro Asn His Leu Pro Arg Arg Met Arg Asp

370 375 380

Tyr Arg Asp Arg Tyr Glu His His Leu Leu Leu Arg Val Ser Asn Asp

385 390 395 400

Thr Ala Asp Ala Thr Arg Ala Phe Leu Gln Gln His Phe Gly Gly Ser

405 410 415

Ser Ser Gly Ala Tyr Phe Glu Cys Asp Ala Lys Glu Gly Arg Lys Ala

420 425 430

Phe Leu His Arg Phe Ala Ile Ala Gly Ala Ala Ile Arg Tyr Arg Asp

435 440 445

Thr His Arg Arg Ser Val Gln Asp Ile Val Ala Leu Asp Ile Ala Leu

450 455 460

Arg Arg Asn Asp Arg Asp Trp Val Glu Gln Leu Pro Gln Glu Met Glu

465 470 475 480

Gly Asp Ile Ile His Lys Leu Tyr Tyr Gly His Phe Phe Cys His Val

485 490 495

Phe His Gln Asp Tyr Ile Val Arg Lys Gly Val Asp Pro Leu Ala Met

500 505 510

Glu His Ser Met Trp Lys Leu Leu Asp Ala Arg Gln Ala Glu Tyr Pro

515 520 525

Ala Glu His Asn Val Gly His Leu Tyr Val Ala Lys Pro Ala Leu Ala

530 535 540

Asp Phe Tyr Arg Gln Leu Asp Pro Thr Asn Thr Phe Asn Pro Gly Ile

545 550 555 560

Gly His Thr Ser Lys Leu Lys His Trp Gly Asn Cys Cys Glu Gln Arg

565 570 575

Gly Leu Pro Ala Ala Tyr Arg Ser Ser Gln Asp

580 585