本发明克隆表达了一种D-乳酸氧化酶，并公开了其核苷酸序列和氨基酸序列及酶学性质和应用，属于工业微生物领域。
背景技术：
D-乳酸氧化酶(D-lactate oxidase)是一种以FAD(FMN)为辅酶的α-羟酸氧化酶(习惯上均称之为D-乳酸氧化酶)。D-乳酸氧化酶可用于生物传感器中测定乳酸的含量，或氧化D-乳酸生产丙酮酸。也有被用于光学纯α-羟酸的制备(中国专利201210109290.4)
目前为止，已经在迟钝爱德华菌(Edwardsiella tarda)和运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)等中发现了D-乳酸氧化酶。(Kalnenieks U,Galinina N,Bringer-Meyer S,et al.Membrane D-lactate oxidase in Zymomonas mobilis:evidence for a branched respiratory chain[J].FEMS microbiology letters,1998,168(1):91-97)
本发明首次从痰塔特姆氏菌(Tatumella ptyseos)中克隆表达出一种新型的D-乳酸氧化酶，该酶不仅可以氧化(R)-α-羟酸，而且可以氧化(R)-α-羟酸酯，该反应与NAD(NADP)为辅酶的乳酸脱氢酶参与的反应相比逆反应极微弱，可应用于光学纯(S)-α-羟酸酯和(S)-α-羟酸的制备。
技术实现要素：
本发明从痰塔特姆氏菌(Tatumella ptyseos)中克隆得到了一种以FAD为辅酶的D-乳酸氧化酶的基因，利用大肠杆菌工程菌异源表达，公开了其相关的酶学特性，并进行了应用研究。
本发明的技术方案如下：
1、菌株
本发明D-乳酸氧化酶基因的来源菌株为：Tatumella ptyseos ATCC 33301，购自美国ATCC菌种库。
2、D-乳酸氧化酶基因的克隆
提取Tatumella ptyseos ATCC 33301菌体基因组总DNA。设计特异性引物，应用PCR方法，扩增出D-乳酸氧化酶基因全长编码框序列。并构建重组质粒。
3、D-乳酸氧化酶表达与纯化
将重组质粒导入E.coli BL21(DE3)中，诱导表达。菌体破碎后得到粗酶液，纯化后冷冻干燥备用。
4、D-乳酸氧化酶的酶学性质分析
以D-乳酸为底物研究pH对本发明所述D-乳酸氧化酶酶活的影响。
以D-乳酸为底物研究温度对本发明所述D-乳酸氧化酶酶活的影响。
D-乳酸氧化酶的底物特异性分析：所用的底物有D-乳酸、乙醇酸、D-苯乳酸、D-对羟基苯乳酸、D-酒石酸、D-苹果酸、D-扁桃酸、D-丹参素。
酶活测定方法为：根据Characterization of a Lactate Oxidase from a Strain of Gram Negative Bacterium from Soil，Applied Biochemistry and Biotechnology,56,1996,278-288。所述方法进行。
5、D-乳酸氧化酶拆分混旋的α-羟酸酯
拆分α-羟酸酯(alpha-hydroxy esters)的方法为：取纯化好的酶0.1克于50mL三角瓶中，加入溶有α-羟酸酯5mM的pH 7的磷酸盐缓冲液中，于30℃，150rpm水浴摇床中转化16h，转化后液相色谱分析上清液。(R)-α-羟酸酯中的α-羟基被脱氢氧化成对应的α-酮酸酯，(S)-α-羟酸酯不被氧化。
产物(S)-α-羟酸酯的光学纯度通过对映体过量值(％e.e)来评价：
对映体过量值％e.e＝[(SS-SR)/(SS+SR)]×100％
(S)-α-羟酸酯得率(％)＝(SS/S0)×100％
式中SR为反应后(R)-对映体的峰面积，SS为反应后(S)-对映体的液相色谱峰面积，S0为反应前(R)-和(S)-对映体的液相色谱峰面积之和。
产物测定液相色谱条件为：Chiralcel OD-H手性柱(4.6×250mm)，流动相体积比为正己烷：异丙醇：三氟乙酸＝80:20:0.1，流速为0.5mL/min，柱温25℃，检测波长210nm，进样量20μL。
所述的α-羟酸酯为下列之一：丹参素冰片酯、丹参素异丙酯、苯乳酸冰片酯、苯乳酸异丙酯、对羟基苯乳酸冰片酯、对羟基苯乳酸异丙酯、扁桃酸冰片酯、扁桃酸异丙酯、丹参素细辛醇酯、乳酸冰片酯、苯乳酸细辛醇酯、对羟基苯乳酸细辛醇酯。
所述的α-羟酸酯，根据中国专利200610042787.3、201410180490.8、201410175950.8和20140699506.6公布的方法合成。
本发表明的有益之处：从Tatumella ptyseos ATCC 33301中克隆表达出一种新型的D-乳酸氧化酶，该酶可以氧化(R)-α-羟酸和(R)-α-羟酸酯，可用于规模化制备手性纯(S)-α-羟酸酯，具有重要的工业应用价值。
具体实施方式
实施例1
本实施例为本发明所述D-乳酸氧化酶基因的克隆与大肠杆菌工程菌构建。
1、Tatumella ptyseos ATCC 33301DNA的提取
将Tatumella ptyseos ATCC 33301菌株在LB培养基中培养12h，12,000rmp/min离心10min得到菌体，应用细菌基因组DNA抽提试剂盒(TaKaRa公司)按照其操作提取菌体基因组总DNA，放冰箱备用。
2、大肠杆菌感受态制备
(1)接种E.coli DH5α和BL21(DE3)分别于含有20mL LB培养基的250mL摇瓶中，37℃、200rpm/min培养过夜。
(2)按1％接种量接种于50mL LB培养基中，37℃培养至OD600约0.6(约2～3h)。
(3)将菌液转移到50mL预冷的离心管中，冰上放置30min，8000rpm/min、4℃离心5min。
(4)弃上清，加入5mL预冷的0.1mol/L CaCl2溶液，使菌体悬浮，冰上放置20min，8000rpm/min、4℃离心5min。重复2次。
(5)弃上清，加入1.5mL预冷的0.1mol/L CaCl2溶液(含15％甘油)，轻轻悬浮菌体，然后按每个离心管(1.5mL)加入100μL菌液分装，-70℃冰箱保藏备用。
3、D-乳酸氧化酶基因的克隆
(1)引物设计
设计引物序列为：
引物1：5'GCCGGGATCCATGAATAACCGTCAGGAGCTGACC 3'
引物2：5'GCCGTCTAGATTACTTGCCCCAGAATTTTTTACGG 3'
用以上合成的两条引物，以Tatumella ptyseos ATCC 33301的基因组DNA为模板进行PCR扩增。
本步骤中扩增体系为：
扩增程序为：
98℃，10min
98℃，10sec；55℃，15sec；72℃，2min反应30个循环
72℃，10min
PCR产物送华大基因测序后得到该酶的基因序列，如SEQ ID NO:1所示。根据该基因序列得到的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
(3)双酶切和连接
将pColdⅡ质粒和PCR产物进行双酶切，酶切体系为：10×cut buffer 3μl,DNA 4μl，酶BamHI和XbaI各0.5μl，无菌水2μl共30μl。37℃水浴下双酶切1h。将DNA片段克隆到pColdⅡ载体上，并转化到E.coli DH5α感受态细胞中。连接体系：10×DNA ligase buffer 2.5μl，DNA片段8μl，载体DNA 2μl，T4DNA ligase 1μl，无菌水11.5μl共25μl。16℃水浴下连接12h-16h。
(4)转化
步骤：
1在连接体系中加入100μl DH5α感受态细菌，轻混匀，冰浴30min。
2放入预热的42℃水浴中，放置90s进行热休克处理。
3立即冰浴2min。
4加入1ml不含抗生素的LB培养液，37℃培养1h使菌体复苏。
5将菌体均匀涂布在含抗生素的LB平板上。
6培养24h长势良好。挑单菌落进行菌落PCR，核酸电泳验证，提取重组质粒。将重组质粒导入BL21大肠杆菌感受态中，保存备用。
实施例2
本实施例为本发明所述D-乳酸氧化酶的诱导表达及分离纯化。
1、加500μl重组菌液到50ml LB培养液中。37℃培养2.5h，15℃下静置0.5h。再加20μl 0.5M的IPTG，15℃下冷诱导培养24h。将发酵液进行离心(8000rmp/min，10min)得到菌体，用磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液(20mmol/L，pH 7.0)复溶菌体，超声破碎仪破碎，离心(8000rmp/min，10min)收集上清得到粗酶液。
2、将步骤1得到的粗酶液采用AKTA avant 150蛋白纯化系统操作进行镍柱纯化，洗脱方法为：将A1、A2、B1、B2四根管路都放进水里，设置system flow 20ml/min流速，进行排气。然后设置system flow 1ml/min、flow path(column position 3)、delta pressure 0.3、pre-pressure 0.5、Gradient 0、inset A1，待水滴均匀流出后装柱子，平衡十分钟之后把A1放进结合液中，B1放进洗脱液中，再进行排气一次，平衡二十分钟，然后上样粗酶液，用500mM的高浓度咪唑缓冲液(B1所处溶液)梯度洗脱目的蛋白，将吸附在离子柱上的蛋白洗脱下来得到纯化的酶。纯化后的酶经冷冻干燥备用。
实施例3
本实施例为本发明所述D-乳酸氧化酶的最适温度。以D-乳酸为底物，将底物与pH为6.0的磷酸缓冲液在30-60℃不同的温度条件下水浴15min，测定D-乳酸氧化酶的酶活，确定酶的最适反应温度为45℃。
实施例4
本实施例为本发明所述D-乳酸氧化酶的最适pH值。以D-乳酸为底物，将底物在pH 3-9，45℃水浴15min测定酶的酶活，结果发现在pH 6.0条件下D-乳酸氧化酶酶活最高。
实施例5
本实施例为本发明所述D-乳酸氧化酶与不同底物的反应特性，列于表2中。
表2D-乳酸氧化酶对不同底物的活性
实施例6
根据发明内容中的方法拆分各种外消旋α-羟酸酯，结果如下表所示：
表3拆分各种外消旋α-羟酸酯的效果
由上表可以看出，当在反应时间充分时，可以得到各类高光学纯的(S)-α-羟酸酯，该酶的光学专一性非常好。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种氧化酶及其应用
<130> No
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1698
<212> DNA
<213> Tatumella ptyseos ATCC 33301
<400> 1
atgaataacc gtcaggagct gacccgcaag ctgcacgaaa tcgcgggaga aaaacaggtt 60
ttactgagtg aagacgataa ggccttttac accaaaggat tccgcgtcgg tcagggtgaa 120
gcactggccg tggtactgcc acagacgctg ttacagctct ggcaattgtt agaagtttgt 180
gttgccgaag atgttatcat tctgatgcag gcctccaata ccggcgtcac cggaggttca 240
accccggacg gtaatgatta cgaccgcgat attgtcatta tcagcacccg tttactgacc 300
ggggttcagg tcattgatga tcaccaacag gttatcgctt ttccgggcac gaccctcacc 360
gagcttgaag acaccctgaa gcctctgcag cgtgaacccc attcggtgat cggttcctcc 420
tgtatcggcg cgtctgtcat tggcgggtta tgtaataact ccgggggctc gctgatccgt 480
cgtggtccgg catttacaga aaaatcgctg tttgcccgca ttactgatga cggacatctt 540
gaactggtta accatctggg tattgagctg ggcgatactc cggagaggat cattaatgcg 600
ctggagacac gcgaatacac gaccggcgat gctgccgact ggcagggtaa aatctgggca 660
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gataaacgtt atctgtatga cagtgcggga tgtgccggaa aagtggtcgt ctttgccgca 780
cgtttgccga cgtttgccgc cagcgaagct acccgtacct tctatatcgg cagcaatgat 840
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cgctgggatg tgcggatcag acatgcccgt tttctgccgc ataattttac cgataagctg 1080
atccagggct ttaatcagat aaccccctcg tttatcgcac cgcggatcat ggattaccgc 1140
cggcgctttg tgcaccatct gatgattaaa attgaagccc gtcaggctga acaactgacg 1200
gcattgcttg aggagtattt cagccagcgt ccgggggaat atttcctgtg cgatgaccgg 1260
gaagctgccg atgcctttct gatccgtttc gcggtgggcg gctgtaccat ctcctactgt 1320
gactacctcg gctatgatac caaccagcga ttaattgctt ttgacgtggc tctgcgccgt 1380
aatgatgacc agtggcggat ccatctgcca cctcatcttg cggcgcaggt ccaggccgat 1440
tcctgttgcg ggcatttctt ttgctttgtg aaccaccagg attacgtcct taaagccggg 1500
gtggatgcga agaaattcaa acaggaggtg atggagtatc tggaacagcg tggtgcccgc 1560
tatcctgcgg agcacaatgt cgggcacctg tatcaggcgt cctgtgaaca tgaacaacac 1620
tggcgtgaac tggatccgac caatacctgc aacccgggga ttgggaaaac cagccgtaaa 1680
aaattctggg gcaagtaa 1698
<210> 2
<211> 565
<212> PRT
<213> Tatumella ptyseos ATCC 33301
<400> 2
Met Asn Asn Arg Gln Glu Leu Thr Arg Lys Leu His Glu Ile Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Gln Val Leu Leu Ser Glu Asp Asp Lys Ala Phe Tyr Thr Lys
20 25 30
Gly Phe Arg Val Gly Gln Gly Glu Ala Leu Ala Val Val Leu Pro Gln
35 40 45
Thr Leu Leu Gln Leu Trp Gln Leu Leu Glu Val Cys Val Ala Glu Asp
50 55 60
Val Ile Ile Leu Met Gln Ala Ser Asn Thr Gly Val Thr Gly Gly Ser
65 70 75 80
Thr Pro Asp Gly Asn Asp Tyr Asp Arg Asp Ile Val Ile Ile Ser Thr
85 90 95
Arg Leu Leu Thr Gly Val Gln Val Ile Asp Asp His Gln Gln Val Ile
100 105 110
Ala Phe Pro Gly Thr Thr Leu Thr Glu Leu Glu Asp Thr Leu Lys Pro
115 120 125
Leu Gln Arg Glu Pro His Ser Val Ile Gly Ser Ser Cys Ile Gly Ala
130 135 140
Ser Val Ile Gly Gly Leu Cys Asn Asn Ser Gly Gly Ser Leu Ile Arg
145 150 155 160
Arg Gly Pro Ala Phe Thr Glu Lys Ser Leu Phe Ala Arg Ile Thr Asp
165 170 175
Asp Gly His Leu Glu Leu Val Asn His Leu Gly Ile Glu Leu Gly Asp
180 185 190
Thr Pro Glu Arg Ile Ile Asn Ala Leu Glu Thr Arg Glu Tyr Thr Thr
195 200 205
Gly Asp Ala Ala Asp Trp Gln Gly Lys Ile Trp Ala Asp Asp Tyr Ser
210 215 220
Glu Gln Leu Arg Asp Thr His Ala Ala Ser Pro Ala Arg Phe Asn Gly
225 230 235 240
Asp Lys Arg Tyr Leu Tyr Asp Ser Ala Gly Cys Ala Gly Lys Val Val
245 250 255
Val Phe Ala Ala Arg Leu Pro Thr Phe Ala Ala Ser Glu Ala Thr Arg
260 265 270
Thr Phe Tyr Ile Gly Ser Asn Asp Glu Ser Glu Leu Ile Gly Leu Arg
275 280 285
Arg Phe Leu Leu Glu Lys Met Asp Glu Leu Pro Leu Gln Ala Glu Tyr
290 295 300
Ile His Ala Gly Ala Phe Asp Leu Thr Leu Arg Tyr Ala Lys His Met
305 310 315 320
Tyr Leu Ala Ile Arg Lys Leu Gly Pro Gln Ala Ile Pro Gly Leu Met
325 330 335
Ala Asn Lys Ala Arg Trp Asp Val Arg Ile Arg His Ala Arg Phe Leu
340 345 350
Pro His Asn Phe Thr Asp Lys Leu Ile Gln Gly Phe Asn Gln Ile Thr
355 360 365
Pro Ser Phe Ile Ala Pro Arg Ile Met Asp Tyr Arg Arg Arg Phe Val
370 375 380
His His Leu Met Ile Lys Ile Glu Ala Arg Gln Ala Glu Gln Leu Thr
385 390 395 400
Ala Leu Leu Glu Glu Tyr Phe Ser Gln Arg Pro Gly Glu Tyr Phe Leu
405 410 415
Cys Asp Asp Arg Glu Ala Ala Asp Ala Phe Leu Ile Arg Phe Ala Val
420 425 430
Gly Gly Cys Thr Ile Ser Tyr Cys Asp Tyr Leu Gly Tyr Asp Thr Asn
435 440 445
Gln Arg Leu Ile Ala Phe Asp Val Ala Leu Arg Arg Asn Asp Asp Gln
450 455 460
Trp Arg Ile His Leu Pro Pro His Leu Ala Ala Gln Val Gln Ala Asp
465 470 475 480
Ser Cys Cys Gly His Phe Phe Cys Phe Val Asn His Gln Asp Tyr Val
485 490 495
Leu Lys Ala Gly Val Asp Ala Lys Lys Phe Lys Gln Glu Val Met Glu
500 505 510
Tyr Leu Glu Gln Arg Gly Ala Arg Tyr Pro Ala Glu His Asn Val Gly
515 520 525
His Leu Tyr Gln Ala Ser Cys Glu His Glu Gln His Trp Arg Glu Leu
530 535 540
Asp Pro Thr Asn Thr Cys Asn Pro Gly Ile Gly Lys Thr Ser Arg Lys
545 550 555 560
Lys Phe Trp Gly Lys
565