鸭病毒性肝炎二价蛋黄抗体及其制备方法和应用与流程

技术领域：
本发明涉及一种高免疫蛋黄抗体，具体地说，涉及一种鸭病毒性肝炎的蛋黄抗体。
背景技术：
：鸭病毒性肝炎(DuckVirusHepatitis，DVH)是由小RNA病毒科肠病毒属的鸭肝炎病毒(DuckHepatitisVirus，DHV)引起雏鸭的一种急性、高度致死性、烈性传染病。本病常年发生，自然状态下只感染3周龄内的雏鸭，常造成重大的经济损失，威胁着养鸭业的健康发展。世界动物卫生组织(OIE)将鸭病毒性肝炎划归为B类动物疾病。鸭肝炎病毒有历史上分为血清型Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型，三者间没有抗原相关性。其中I型鸭病毒性肝炎呈世界性分布。II型鸭病毒性肝炎是1965年发现于英国，且自20世纪80年代中期暴发后，该地区也再未见该病的发生。III型1969年发现于美国纽约长岛地区。II型、III型目前已被重新分类为鸭星状病毒属成员，分别称为鸭星状病毒1型(duckastrovirus1，DAstV-1)、鸭星状病毒2型(DAstV-2)。2009年，国际病毒分类委员会(TheInternationalCommitteeonTaxonomyofViruses，ICTV)在小RNA病毒科中新成立禽肝病毒属(Avihepatovirus)，传统的血清I型鸭肝炎病毒属于其中的鸭甲型肝炎病毒(DHAV)，被称为DHAV-1，DHAV还包括另外两个血清型即DHAV-2、DHAV-3，DHAV-2和DHAV-3分别与DHAV-1无血清交叉中和作用。WangL等(2008)则按基因分型称之为A型(DHAV-A)、B型(DHAV-B)、C型(DHAV-C)。研究表明，根据衣壳蛋白编码序列所区分的基因型与采用中和试验所区分的血清型存在对应关系。国内外学者就DHV血清型的流行状况开展了研究。2007年，Tseng从1989-1990年台湾地区暴发鸭病毒性肝炎的病鸭体内分离病原，通过中和试验证明是一株新型鸭肝炎病毒，N-DHV(可称作DHAV-2)，目前仅发现于台湾地区。2007年，韩国Kim等从2003年和2004年暴发鸭病毒性肝炎的病鸭体内分离到一株病毒，与DHV-Ⅰ的血清型不同，称为DHV-AP(又称作DHAV-3)。以往在我国流行的主要是I型鸭肝炎病毒，采用传统的弱毒疫苗和高免蛋黄抗体进行I型DHV的预防和治疗。但近几年来，不断有使用I型鸭肝炎弱毒疫苗或高免蛋黄抗体进行预防或治疗无效的鸭群爆发疑似鸭肝炎，怀疑为新型鸭肝炎。而近年来，韩国新型(DHAV-3)在我国的地区分布已较为广泛。苏敬良等(新型DHV的分离及初步鉴定，中国兽医科技，2002，32(1)：15～16)经过病原分离鉴定和鸭胚血清中和试验，分离到与DHV-I、DHV-III无血清学交叉免疫反应的小RNA病毒，称为新型鸭肝炎病毒；黄安国等(新型鸭肝炎病毒的分离与初步鉴定，广西畜牧兽医，2003，19(5)：198～199)也从以I型鸭病毒性肝炎高免蛋黄抗体或I型鸭肝炎弱毒疫苗不能治愈或预防的类似I型鸭病毒性肝炎的发病鸭群中分离到新型鸭肝炎病毒。随后刘建等(新型DHV流行病学调查及免疫防治试验，中国兽医杂志，2006，42(2)：3～6)从北京、河北、山东和广西等地送检并具有明显的肝脏出血病变特征的雏鸭肝脏中分离到9株病毒株，通过对其进行血清学鉴定，发现其中7株为新型鸭肝炎病毒，2株为I型鸭肝炎病毒。这些研究结果就可以揭示近年来不少地区雏鸭在发生鸭病毒性肝炎后注射高免血清或高免蛋黄抗体治疗无效的原因。研究结果已显示我国多个地区同时流行DHAV-1和DHAV-3，且两者间缺乏交叉保护，对DHAV-3所引起的DVH还缺乏有效的控制措施。技术实现要素：为了满足生产上对DVH有效防治技术的迫切需求，及时控制国内DVH的发生，本发明利用传统的I型(DHAV-1)鸭肝炎病毒与新型(DHAV-3)鸭肝炎病毒制备了二价蛋黄抗体。为此，本发明提供了一种鸭病毒性肝炎病毒株，所述病毒株VP1基因编码氨基酸的序列包含如图六所示的具有49-T、196-N、207-E三个氨基酸取代位点和197-Q、198-S、199-D三个共有位点。优选地，所述鸭病毒性肝炎病毒株为鸭病毒性肝炎病毒SD1株，所述SD1株保藏地址为中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO.V201225，保藏地址为中国武汉·武汉大学。本发明提供了一种DNA序列，它实质上含有seqNo.1的核苷酸序列，本发明中的术语“实质上含有”是指本发明的核苷酸序列在保持其功能的范围内，序列号1碱基序列可以发生置换、插入或缺失等变异。本发明提供了一种VP1抗原蛋白，所述的VP1抗原蛋白包含如图六所示的具有49-T、196-N、207-E三个氨基酸取代位点和197-Q、198-S、199-D三个共有位点的鸭病毒性肝炎病毒VP1共有序列。本发明的主要目的在于提供一种鸭病毒性肝炎二价蛋黄抗体，所述二价蛋黄抗体包含鸭病毒性肝炎DHAV-1型和鸭病毒性肝炎DHAV-3型蛋黄抗体。所述抗体效价高且成本较低，能够有效控制目前国内流行的不同血清型的鸭病毒性肝炎。本发明另一目的在于提供一种鸭病毒性肝炎二价蛋黄抗体的制备方法，所述方法安全、易于使用，所述制备方法包括：(1)采用鸭病毒性肝炎DHAV-1型毒株和DHAV-3型毒株分别接种9日龄SPF鸡胚和10日龄易感鸭胚，然后收获尿囊液，将所述收获的病毒液按比例混合，甲醛灭活并制备疫苗；(2)使用所述制备的疫苗免疫产蛋鸡，免疫后抽样测定鸡高免蛋黄中抗DHAV-1型、DHAV-3型抗原抗体中和效价≥1∶8192，之后收集所述鸡的高免蛋；(3)将所述高免蛋蛋壳消毒，收集蛋黄，所述蛋黄加入等体积蒸馏水，搅拌混匀，低温巴氏灭活；酸化蒸馏水法提纯、辛酸法提纯；微滤，超滤。优选地，所述鸭病毒性肝炎DHAV-1型毒株为DRL-62株、所述DHAV-3型毒株为SD1。优选地，所述免疫程序为：所述产蛋鸡120日龄时肌肉注射1ml/只，14日后等剂量肌肉注射，所述二免10日后再用等剂量肌肉注射进行三免，所述三免后10日再用等剂量肌肉注射进行第四次强化免疫。优选地，所述低温巴氏灭活条件为62.5℃加热灭活30min；优选地，所述酸化蒸馏水法提纯步骤为：先在隔层反应罐中加入相当于所述蛋黄6倍体积的灭菌蒸馏水，所述蒸馏水pH值为4.2，并降温至4℃，然后，将灭活的所述蛋黄液加入，搅拌，4℃静置4h，离心分离上清液；所述辛酸法提纯步骤为：按所述上清液总量的0.2％体积加入辛酸，搅拌，室温放置4h，过滤至澄清，再按所述滤液总量的0.1％加入饱和甲醛溶液，搅拌，室温放置24h。优选地，所述微滤使用0.22μm微孔滤芯过滤除菌，所述超滤用截留分子量为1000KDa的超滤膜过滤除病毒。本发明再一目的在于提供了鸭病毒性肝炎二价蛋黄抗体在制备预防和治疗鸭病毒性肝炎的药物中的应用。本发明的还一目的在于提供了一种预防和治疗鸭病毒性肝炎的疫苗组合物，所述疫苗组合物包括免疫量的由VP1基因编码氨基酸基因序列包含如图六所示的具有49-T、196-N、207-E三个氨基酸取代位点和197-Q、198-S、199-D三个共有位点的鸭病毒性肝炎毒株所制备抗原以及药学上可接受的载体。优选地，所述鸭病毒性肝炎病毒为SD1株。所述预防和治疗鸭病毒性肝炎的疫苗组合物使用本领域常规方法制备。本发明还提供了所述的疫苗组合物在制备预防和治疗鸭病毒性肝炎的药物中的应用。技术效果1.本发明采用了物理、化学等多重灭活技术，使用酸化水稀释法结合辛酸法、高速离心、超滤等现代生物技术，将蛋黄中的免疫球蛋白进行有效的分离纯化，蛋黄抗体中不含任何有害物质和外源性污染，安全性高，注射免疫鸭群时对胴体品质无影响，可工业化生产。2.本发明所获得的鸭病毒性肝炎毒株，具有良好的免疫原性，制备的灭活疫苗，抗体产生速度快，抗体效价高，安全性好，以此制备的蛋黄抗体能有效地防治DHAV-3型病毒的侵染，保存、运输(2～8℃)和使用方便，使用效果稳定，有效地防控鸭病毒性肝炎的发生。3.发明人在研究所获得的鸭病毒性肝炎毒株SD1株的VP1基因序列时，意外发现其中VP1基因编码氨基酸基因序列包含的如图六所示的具有49-T、196-N、207-E三个氨基酸取代位点和197-Q、198-S、199-D三个共有位点对其免疫原性具有重要作用。在后续实施例证明，其他鸭病毒性肝炎毒株VP1基因序列突变了相应相同的位点，也具有同样的作用。4.本发明提供的二价蛋黄抗体，成本低，效价高，动物实验表明可以对DHAV-1和DHAV-3引起的鸭病毒性肝炎做到有效的控制，可获得显著的社会效益。附图说明图1为利用DHVI型标准株引物RT-PCR检测DRL-62株和SD1株VP1结果；图2为利用DHV韩国新型毒株引物RT-PCR检测DRL-62株和SD1株VP1结果；图3为SD1VP1基因与DHV参考毒株核苷酸序列同源性分析；图4为SD1VP1基因与DHV参考毒株氨基酸序列同源性分析；图5为SD1VP1基因与DHV参考毒株核苷酸序列进化树；图6为SD1VP1基因与DHV参考毒株氨基酸序列比对分析；图7为SD1VP1蛋白亲水性、抗原指数、表面可及性分析。具体实施方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。鸭病毒性肝炎二价蛋黄抗体的制备方法采用如下的步骤：鸭肝炎病毒DHAV-1、DHAV-3种毒的繁育、免疫用疫苗的制备、产蛋鸡的免疫、蛋黄抗体的提取。本发明实施例中所选用的DHAV-1毒株为DRL-62株，DHAV-3毒株为SD1株，其具体方法为：1.毒种的来源鸭肝炎病毒DRL-62株(ATCC保藏，保藏号VR-1313)；SD1株由普莱柯生物工程股份有限公司分离，(CCTCC保藏，保藏号：CCTCCNO.V201225)。2.毒种繁殖将鸭肝炎病毒DRL-62株毒种用灭菌PBS溶液作1∶100稀释，经尿囊腔接种9～11日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml。置37℃继续孵育，弃去48小时内的死胚，收获48～96小时死亡鸡胚，置2～8℃冷却12～24小时。将检验无菌的胚液混合后，定量分装，冷冻保存。注明收获日期、毒种代次等。将鸭肝炎病毒SD1株毒种用灭菌PBS溶液作1∶100稀释，经尿囊腔接种10～12日龄易感鸭胚，每胚0.2ml。置37℃继续孵育，弃去48小时内的死胚，收获48～96小时死亡鸭胚，置2～8℃冷却12～24小时。将检验无菌的鸭胚液混合后，定量分装，冷冻保存。注明收获日期、毒种代次等。3.免疫用灭活苗的制备：3.1病毒液的收获将收获的病毒液3500转/分钟离心30分钟，吸取上清液于灭菌容器，加入10％甲醛溶液，随加随摇，使其充分混合，甲醛溶液的终浓度为0.15％，密闭后置37℃温箱中作用24小时(期间振摇3～4次)。3.2免疫用灭活苗的制备油相配制：取注射用白油94份，司本-806份混合后，加入硬脂酸铝2份，边加热边搅拌至透明后高压灭菌备用，即为油相。水相配制：将DRL-62株抗原与SD1株抗原以1:1的比例混合均匀，按抗原的4％加入灭菌吐温-80，充分振摇，使吐温-80完全溶解，即为水相。乳化：取油相2份置油相罐内，开动电机搅拌，徐徐加入1份水相，再以3400转/分钟乳化10分钟即可。在乳化终止前加入1％硫柳汞，使其终浓度为0.01％。取样3000转/分钟离心15分钟，应不分层。分装：定量分装，加盖密封。4.免疫4.1免疫程序蛋鸡120日龄左右用灭活油苗肌肉注射1ml/只，14日后用灭活苗肌肉注射1ml/只，二免10日后再用灭活苗肌肉注射1ml/只进行三免，三免后10日再用灭活苗肌肉注射1ml/只进行第四次强化免疫。4.2采蛋从四免后每隔10日抽样测定鸡高免蛋黄中DRL-62抗体、SD1抗体中和效价≥1∶8192为合格，之后即可收集高免蛋，置4℃贮存备用。5.蛋黄抗体的制备5.1蛋黄的收获及灭活将蛋壳消毒，采取手工或机械打蛋。充分除去蛋清(白)、胚盘和系带，收集蛋黄。充分搅拌使蛋黄呈均匀膏状，加入等体积经121℃30min灭菌并冷却的蒸馏水，搅拌混匀，62.5℃加热灭活30min。5.2抗体的酸化蒸馏水法提纯先在隔层反应罐中加入相当于原蛋黄6倍体积的pH值为4.2的灭菌蒸馏水，并降温至4℃。然后，将灭活的蛋黄液加入，边加边搅拌，4℃静置4h。管式低温连续离心机14000rpm离心分离上清液并转入另一反应罐中。5.3抗体的辛酸法提纯按总量的0.2％(体积比)加入辛酸，搅拌均匀，室温放置4h。用滤布过滤后，再用K型多层板框过滤至澄清，再按总量的0.1％加入饱和甲醛溶液于上述滤液中，充分搅拌混匀，室温放置24h，期间振摇数次。5.4过滤除菌用0.22μm微孔滤芯过滤除菌。用截留分子量为1000KDa的超滤膜过滤除病毒。5.5抗体效价测定中和试验将DHVDRL-62株稀释成每0.1ml含200ELD50，与等量2倍系列稀释的待检抗体混合，37℃作用1小时，期间摇晃数次。每个稀释度接种5枚9日龄SPF鸡胚，每胚0.2ml，另设病毒液与等量灭菌PBS混合的病毒对照组和PBS空白对照组各5枚，置37℃培养168小时，记录48～168小时的鸡胚死亡数，判定结果。空白对照组应全部健活，病毒对照组应全部死亡。将DHVSD1株稀释成每0.1ml含200ELD50，与等量2倍系列稀释的待检抗体混合，37℃作用1小时，期间摇晃数次。每个稀释度接种5枚10日龄易感鸭胚，每胚0.2ml，另设病毒液与等量灭菌PBS混合的病毒对照组和PBS空白对照组各5枚，置37℃培养168小时，记录48～168小时的鸭胚死亡数，判定结果。空白对照组应全部健活，病毒对照组应全部死亡。能使50％鸡(鸭)胚不发生死亡的最高抗体稀释倍数即为该抗体的中和效价。5.6提纯的蛋黄抗体冻干向提纯并经检验合格的蛋黄抗体液加入冻干保护剂分装于西林瓶入冻干箱，冻干过程中温度最低降至－40℃，在此温度下保持4h，制品以1.0℃/h升温18～20h，至基本干燥，再以4～6℃/h升温至25℃干燥至完全冻干，压塞出箱，贮存于2～8℃。实施例1DHVSD1分离株分子生物学鉴定1.鸭肝炎病毒SD1株病毒为新分离鉴定的病毒，其具有以下特征：1.1DHAV-3和DHAV-1引起的临床症状极为相似，主要表现为：雏鸭发病突然，很快出现明显的神经症状，抽搐，并很快死亡，死后雏鸭呈角弓反张姿势。病理变化表现为肝脏肿大，肝表面有大量的出血点及出血斑，并且随着死亡时间的延长，出血表现越为明显。1.2根据GenBank已发表的DHV基因组序列设计多对特异的引物，按常规RT-PCR方法扩增VP1基因，对分离株SD1的VP1基因进行了序列测定分析。结果表明，SD1的VP1基因与中国及韩国DHAV-3的VP1序列相似性最高，与DHAV-1和台湾DHAV-2的相似性均较低。核苷酸序列及进化关系分析结果表明分离毒与中国及韩国DHAV-3之间的遗传距离最近，而与DHAV-1和台湾DHAV-2之间存在较大差异。1.3VP1氨基酸序列的比对分析及亲水性、抗原指数和表面可及性分析显示，DHVSD1分离株与其它国内DHAV-3间氨基酸位点的变化均位于亲水性区域和可及性区域，加之与DHAV-1的差异共同提示DHVSD1分离株VPl蛋白上可能存在完全不同的抗原表位，同时也将体现在免疫保护性上。1.4血清交叉中和试验表明DHVSD1分离株与DHAV-1间无交叉保护作用，二者分属不同的血清型。SD1分离株与国内分离DHAV-3毒株间有交叉保护作用，且相互间的中和保护作用SD1株优于对比毒株。1.5理化特性鉴定结果显示，该毒株可抵抗氯仿、乙醚、热、胰酶、酸的处理。该病毒株免疫原性良好，四免后10日抽样测定鸡高免蛋黄中DRL-62抗体中和效价1:17620、SD1抗体中和效价1:13932；治疗试验表明二价蛋黄抗体能有效控制目前国内流行的不同血清型的鸭病毒性肝炎的发生，保护率达到80％～100％。本发明所述的鸭病毒性肝炎SD1株于2012年06月08日保藏在中国典型培养物保藏中心。保藏单位简称：CCTCC，保藏编号：CCTCCNO.V201225，分类命名：鸭病毒性肝炎病毒，英文名称为DuckhepatitisvirusSD1Strain，拉丁文名称为Tarpeiapulli，保藏单位地址：中国武汉·武汉大学。2.RT-PCR从病鸭肝脏中分离病毒提取RNA，根据GenBank公布的DHAV-1毒株DRL-62株、韩国DHAV-3毒株N-DHV株基因组全序列，使用下列引物对VP1序列进行RT-PCR(参照大连宝生物工程有限公司反转录试剂盒说明书的方法)：①DHAV-1型上游引物：5’-GGTGATTCTAACCAGTTGG-3’，下游引物：5’-TTCAATTTCCAGATTGAGT-3’；②DHAV-3型上游引物：5’-CAGATGGCCGCCAATGATCAG-3’，下游引物：5’-GTCTCTGACATTTCGAAATTGGTATGA-3’。阳性扩增产物送英潍捷基(上海)贸易有限公司进行测序。3.基因序列分析使用DNAStar7.1分析软件将分离毒株VP1基因核苷酸序列与I型DHV标准株DRL-62及GenBank中登陆的其它DHV毒株(见表1)核苷酸序列进行同源性比较分析，并使用Megalign中的方法绘制系统进化树，进行遗传进化分析。表1参考毒株及其GenBank登录号4.分子生物学鉴定结果4.1RT-PCR结果结果参见图1、图2，利用DHVVP1特异性引物对DRL-62株及分离株进行RT-PCR，图1中，M泳道为DL2000Marker，泳道1为DRL-62株利用DHAV-1型标准株引物RT-PCR结果，泳道2为SD1分离株利用DHAV-1型标准株引物RT-PCR结果，泳道3为阴性对照；图2中，M泳道为DL2000Marker，泳道1为SD1分离株用DHAV-3型引物RT-PCR结果，泳道2为DRL-62株用DHAV-3型引物RT-PCR结果，泳道3为阴性对照。结果分析：利用DHAV-1型标准株引物，DRL-62株可扩增出约700bp大小特异性条带；利用DHAV-3型引物扩增，可见分离株在约750bp处出现特异性条带。4.2VP1序列分析结果4.2.1DHVSD1VP1基因的测序结果参见序列SEQ1：4.2.2DHVSD1株VP1基因核苷酸及其编码的氨基酸序列同源性分析参见图3、图4，序列分析发现，DHVSD1分离株与DHVI型标准毒株DRL-62株、中国分离DHVI型MY株(DHAV-1)核苷酸相似性仅约为69％，氨基酸相似性分别为77.3％、76.5％；而与DHVFS株、C-YDF株等中国分离DHAV-3型毒株的核苷酸相似性分别在93.1％～97.9％之间，氨基酸相似性达到97.5～99.2％；与韩国新型DHV(DHAV-3)之间的核苷酸序列相似性为93.1％，氨基酸相似性则分别为92.5％、92.9％；与台湾新型DHV(DHAV-2)之间的核苷酸序列相似性则仅为72.7％，氨基酸相似性分别为80.5％、80.1％。参见图5，进化关系分析结果进一步表明，DHVSD1分离株与DHAV-3中国、韩国毒株在一个分支中，遗传距离最近，而与DHAV-1及DHAV-2毒株间存在较大差异。同时显示DHVSD1分离株和国内DHAV-3与韩国DHAV-3分别在两个小分支上，本研究的DHVSD1分离株与其它GenBank登陆的国内DHAV-3又分别在两个分支当中。4.2.3VP1氨基酸序列的比对分析及亲水性、抗原指数和表面可及性分析VP1是小RNA病毒主要的抗原性基因，蛋白大部分暴露在病毒的表面，是主要结构蛋白，含有可诱导T、B淋巴细胞反应的多个抗原表位，能诱导机体产生保护性的中和抗体。由于VP1位于表面，选择压力大，变异率高，某些氨基酸的也将导致抗原位点的改变，从而对毒株抗原性的变化产生影响。在小RNA病毒科中，结构蛋白VP1有保守的氨基酸序列RGD，它履行着吸附细胞与细胞受体结合的重要功能，还能诱导病毒产生中和抗体。从推导的氨基酸序列中可以看出DHAV-1型毒株的VP1序列中不具有RGD序列，而是SGD，对应的DHAV-3则均是QSD。这一变化表明新型DHV与细胞受体的结合可能同FMDV等不同。参见图6，DHVSD1分离株与DHAV-1比较显示，分离株在143、144位有2个氨基酸GG插入，变异区域主要在140～146、180～200、212～219位。DHVSD1分离株与韩国新型DHV(NC-009750)比较显示，共有18位氨基酸发生变异，高变区主要在178～196位。与台湾DHAV-2比较显示，在51、52位分离株缺失2个氨基酸DG，在143～145位有GGG3个氨基酸插入，185位有1个氨基酸插入L。DHVSD1分离株与中国其它DHAV-3毒株(10株)比较显示，主要存在为点突变，其中SD1株第49位氨基酸为T，其它各株均为G或S。196位氨基酸为N，对比毒株中7株为D。207位氨基酸为E，对比毒株中有4株为K。参见图7，用Protean程序对VP1基因进行分析。分别以Kyte-Doolittle方法进行亲水性区域分析，以Emini方案进行氨基酸位于分子表面可能性分析，以Jameson-Wolf法进行抗原指数分析。结果显示，VP1蛋白亲水性高的区域分布广泛，与抗原指数高的区域相似，其中131～141、195～205、210～224三个区段抗原指数、亲水性峰值、表面可及性值高，且与主要柔性区域分布一致，推测该段区域可能是VP1的主要抗原性肽段。DHVSD1分离株与其它国内DHAV-3间氨基酸位点的变化均位于亲水性区域和可及性区域，加之与DHAV-1的差异共同提示DHVSD1分离株VPl蛋白上可能存在完全不同的抗原表位，同时也将体现在免疫保护性上。本研究发现，具有49-T、196-N、207-E三个氨基酸取代位点和197-Q、198-S、199-D三个共有位点的毒株对鸭病毒性肝炎具有良好的免疫原性。实施例2血清交叉中和试验固定病毒稀释血清，将DHVDRL-62株、SD1分离株阳性血清分别用生理盐水做2倍系列稀释。将含200ELD50/0.2ml的DRL-62株、SD1分离株病毒液各取1.0ml分别与各毒株不同稀释度的阳性血清等量混合，37℃作用1h。同时，设病毒和生理盐水对照。将各中和组和对照组经尿囊腔接种5枚鸭胚，0.2m1/胚，37℃培养，观察7日，记录各组死胚数。以50％鸭胚保护的最高血清稀释度为血清的中和效价。中和试验结果显示分离株可以被分离株阳性血清完全中和，不能被DHV标准Ⅰ型鸭肝炎阳性血清中和保护，试验组全部死亡；DRL-62阳性血清与分离株作用后，中和效价为1:16；SD1阳性血清与DRL-62毒株作用后，中和效价<1:8，表明分离株与DRL-62株无血清交叉保护作用，结果见表2。计算不同毒株间的亲缘值R(其中R1为血清1对病毒2的中和效价与血清l对病毒1的中和效价之比；R2为血清2对病毒l的中和效价与血清2对病毒2的中和效价之比。)参照口蹄疫病毒根据亲缘值(R)，区分血清型和亚型的区分标准(R值70％以上时，两毒株亚型相同；R值在32～70％时,两毒株为不同的亚型；R值10％以下,毒株为不同的型)，DRL-62株与分离株之间的R值在10％以下(<0.74％)，不属于同一血清型，为一种新的血清型。表2血清交叉中和试验结果实施例3血清被动免疫保护试验1将230只5日龄易感雏鸭随机分为5组，1、2、3、4组每组50只，5、6、7组每组10只。将SD1、GD株(国家兽医微生物菌种保藏管理中心保藏号：CVCCAV321)阳性血清(自制)分别稀释至中和效价为：1:32、1:64、1:128、1:256、1:512。1、2组雏鸭每只肌肉注射SD1阳性血清1.0m1，每个效价注射10只；3、4组雏鸭每只肌肉注射GD株阳性血清1.0m1，每个效价注射10只。24小时后，1、3、5组雏鸭每只皮下注射100LD50SD1株0.2ml，2、4、6组雏鸭每只肌肉注射100LD50GD株0.2ml，第7组雏鸭不作任何注射为空白对照。分别隔离饲养，观察10日，记录各组死亡数。结果表明，SD1株、GD株均可以被各自血清保护；当SD1阳性血清抗体效价为1:128时被动免疫雏鸭后，对GD株的攻击能产生7/10保护，当SD1效价为1:256时，可产生10/10保护；当GD阳性血清抗体效价为1:256时被动免疫雏鸭后，对SD1株的攻击能产生5/10保护，当SD1效价为1:512时，可产生9/10保护。可见SD1血清对GD株的保护效果优于GD血清对SD1株的保护，结果见表3。表3被动免疫保护试验结果1注：表中比值为雏鸭存活比例，试验动物不足10只组为发生非特异性死亡造成。实施例4血清被动免疫保护试验2根据DHAV-3GD株全基因组序列设计并合成5对特异引物，应用RT-PCR方法分5段扩增DHV全基因组cDNA。将扩增的cDNA重叠片段分别定向克隆到载体pBluescriptⅡKS(+)中，获得DHAV-3GD全长基因组cDNA质粒。质粒测序并送上海生物工程公司，设计突变引物，利用PCR介导的重叠延伸诱变法对VP1第49位密码子GGT→ACT，196位密码子GAT→AAT，207位密码子AAG→GAG进行定点突变。经测序鉴定，定点突变准确，未改变其他序列。将各片段连接获得DHAV-3GD全长基因组cDNA克隆。利用NruⅠ将全长cDNA质粒线性化，利用SP6RNA聚合酶系统在体外进行转录，获得病毒RNA。利用酚/氯仿抽提，异丙醇沉淀的方法，将反转录体系中的酶等杂质除去，从而提高转染的效率。当细胞培养板中BHK-21细胞密度为80％时，根据DMRI-C转染试剂说明书进行转染。72h后将转染病毒RNA细胞冻溶1次后接种BHK-21细胞，拯救出病毒GD-BHK。拯救病毒接种10日龄鸭胚后，可使其致死。血清中和试验表明拯救病毒可以被GD阳性血清中和。测序结果表明拯救病毒与亲本毒共有8个氨基酸的差异，未见此8个氨基酸与病毒毒力有关的报道。利用拯救病毒免疫SPF鸡制备阳性血清，将中和效价分别稀释至：1:32、1:64、1:128、1:256、1:512。1、2组雏鸭每只肌肉注射GD拯救毒阳性血清1.0m1，每个效价注射10只。24小时后，1、2组雏鸭分别用100LD50SD1株、GD株攻击，0.2ml/只。另设SD1株、DG株攻毒对照和不作任何注射的空白对照组。各组隔离饲养，观察10日，记录雏鸭死亡情况。结果显示，当GD拯救株血清中和效价≥1:64时可对SD1产生9/10以上的保护，当中和效价≥1:256时可对GD产生9/10以上的保护，此结果与被动免疫保护试验1中SD1阳性血清的保护效果相近，说明GD拯救株的突变一定程度上改变了其免疫原性，使其获得了与SD1株相近的攻毒保护效果，具有与SD1株相当的免疫原性，由于GD拯救株的突变与SD1株一样，是在结构蛋白VP1的49-T、196-N、207-E三个氨基酸取代位点和197-Q、198-S、199-D三个共有位点发生了相同的变化。由此可见该突变位点对鸭病毒性肝炎病毒免疫原性有着重要的影响，不仅SD1株因突变相应位点，免疫原性增强，而且在突变了GD株相应位点后，其免疫原性也相应发生了改变。从而说明了具有49-T、196-N、207-E三个氨基酸取代位点和197-Q、198-S、199-D三个共有位点的毒株具有良好的免疫原性。表4被动免疫保护试验结果2注：表中比值为雏鸭存活比例，试验动物不足10只组为发生非特异性死亡造成。实施例5DHVSD1株的理化特性鉴定1.乙醚敏感性试验取收获的鸭胚液，3000转/分钟离心15min，去除较大颗粒。吸取上清液1.6ml，分别移入2个灭菌小瓶中，每瓶0.8ml，并于其中一瓶内加入麻醉用乙醚0.2ml，另一瓶中不加乙醚作为对照。两瓶均用橡皮塞塞紧后置4℃24小时，期间不时振荡。加入乙醚的小瓶，此时分为清晰的两层：上层为乙醚，下层为病毒液。然后用毛细吸管吸取病毒液，移入另一小瓶内，适当吹打，使残余乙醚挥发殆尽。最后取上述两份病毒液分别作10倍系列稀释，每个稀释度接种10枚10日龄非免鸭胚，观察168小时，记录鸭胚死亡情况。比较乙醚处理的病毒液和对照病毒液的病毒含量。2.氯仿敏感性试验取收获的鸭胚液，3000转/分钟离心15min，去除较大颗粒。向病毒液内加入氯仿(分析纯)，使其终浓度为4.8％，置4℃振荡混合10分钟，随后500转/分钟离心5分钟，吸取上层液体，测定病毒含量。对照病毒液加入等同于氯仿量的灭菌生理盐水，同样处理后测定病毒含量。比较氯仿处理的病毒液和对照病毒液的病毒含量。3.耐酸性试验取收获的鸭胚液，3000转/分钟离心15分钟，去除较大颗粒。取上清等量分装于2个小瓶中。用0.1mol/L的HCl将1个小瓶中的病毒液调pH值为3.0，并在另1个小瓶中的病毒液内加入等同于酸量的灭菌生理盐水作为对照，置37℃感作2小时后，再用5.6％NaHCO3溶液将pH值调至7.2左右。对照加入等同于碱量的灭菌生理盐水。将两瓶病毒液作10倍系列稀释，每个稀释度接种10枚10日龄非免鸭胚，观察168小时，记录鸭胚死亡情况。比较酸处理的病毒液和对照病毒液的病毒含量。4.耐热性试验取收获的鸭胚液，3000转/分钟离心15分钟，去除较大颗粒。取上清等量分装于2个小瓶中，1瓶置于50℃水浴作用30分钟，另1瓶不作处理作为对照。将两瓶病毒液作10倍系列稀释，每个稀释度接种10枚10日龄非免鸭胚，观察168小时，记录鸭胚死亡情况。比较热处理的病毒液和对照病毒液的病毒含量。5.胰蛋白酶敏感性试验取收获的鸭胚液，3000转/分钟离心15分钟，去除较大颗粒。取上清等量分装于2个小瓶中，每瓶1.0ml，在其中1瓶加入1.0ml1％的胰蛋白酶，使终浓度为0.5％，另一瓶加入1.0ml1640培养基，用橡皮塞塞紧瓶口，将小瓶倒转几次，使其充分混合，置37℃作用1小时，随即加入灭活胎牛血清8.0ml，充分混合，终止胰酶的作用。将两瓶病毒液作10倍系列稀释，每个稀释度接种10枚10日龄非免鸭胚，观察168小时，记录鸭胚死亡情况。比较胰蛋白酶处理的病毒液和对照病毒液的病毒含量。理化特性鉴定结果：参照以上试验方法进行，可见DHVSD1分离株经乙醚、氯仿、酸、热、胰酶处理后，毒价无明显降低，结果参见表5、表6、表7、表8。表5脂溶剂敏感试验结果表6耐酸性试验结果表7耐热性试验结果表8胰蛋白酶敏感性试验结果实施例6：鸭病毒性肝炎二价蛋黄抗体的制备用DRL-62、SD1毒株制备的二联灭活油苗肌肉注射120日龄蛋鸡1ml/只，两周后二免，10日后三免，三免后10日进行第四次强化免疫，每次免疫剂量同首免。四免后10日抽样测定鸡高免蛋黄中DRL-62抗体中和效价1:17620、SD1抗体中和效价1:13932，集蛋，置4℃贮存备用。无菌打蛋收集蛋黄。加入等体积经121℃30min灭菌并冷却的蒸馏水，搅拌混匀，62.5℃加热灭活30min。在隔层反应罐中加入6体积灭菌蒸馏水(pH值为4.2)，降温至4℃后，缓慢加入灭活的蛋黄液，边加边搅拌，4℃静置4h。管式低温连续离心机14000rpm离心分离上清液并转入另一反应罐中。按总量的0.2％(体积比)加入辛酸，搅拌均匀，室温放置4h。滤布过滤后，再用K型多层板框过滤至澄清，按总量的0.1％加入饱和甲醛溶液，充分搅拌混匀，室温放置24h，期间振摇数次。用0.22μm微孔滤芯过滤除菌。用截留分子量为1000KDa的超滤膜过滤除病毒。实施例7鸭病毒性肝二价蛋黄抗体预防性试验鸭肝二价蛋黄抗体(A组)、DHAV-1抗体(B组)和DHAV-3抗体(C组)分别肌肉注射1日龄、6日龄、12日龄、18日龄雏鸭，每组每日龄10只。1日龄雏鸭注射抗体0.5ml/只，6日龄、12日龄、18日龄雏鸭注射抗体1.0ml/只。注射抗体后24小时每只雏鸭用100LD50的DRL-62、SD1强毒攻击。攻毒同时设病毒对照和空白对照各10只。各试验组分开饲养，观察10日，记录雏鸭死亡数。结果显示，鸭肝二价蛋黄抗体可保护各日龄雏鸭全部健活，而单独使用DHAV-1抗体和DHAV-3抗体则明显不能抵抗DHAV-1、DHAV-3的攻击。结果见表9。表9预防性试验结果注：表中比值为雏鸭存活比例，试验动物不足10只组为发生非特异性死亡造成。实施例8鸭病毒性肝炎二价蛋黄抗体治疗试验8.1：试验分为A、B、C3组，每组随机选择60只4日龄雏鸭实验室条件下人工感染DHAV-1和DHAV-3。A组雏鸭分为3组，每组20只，分别于感染后24小时、36小时、48小时肌肉注射鸭病毒性肝炎二价蛋黄抗体，1.0ml/只；B组、C组操作同A组，分别使用DHAV-1和DHAV-3鸭病毒性肝炎抗体进行治疗。试验设10只雏鸭不作注射为空白对照。每组设10只感染后不治疗对照。各组分开饲养，观察10日，观察并记录雏鸭死亡情况。结果显示，感染后24小时用抗体进行治疗，所有雏鸭在观察期内未再出现死亡，而攻毒后48小时使用抗体治疗组，雏鸭治愈率明显降低。可见雏鸭感染后越早使用抗体，可大大提高保护效果。结果同时显示，仅用DHAV-1或DHAV-3鸭肝抗体无法产生有效保护力。空白对照全活，未治疗组10日后全部死亡，结果见表10。表10人工感染治疗试验结果注：表中比值为雏鸭存活比例，试验动物不足10只组为发生非特异性死亡造成。8.2：河南信阳鸭场6日龄雏鸭发病，表现精神不振，食欲减退，缩颈、卧地，于7日龄开始出现死亡，死亡前双腿痉挛，角弓反张，送信阳市动物疫病预防控制中心检验，剖检发现肝脏肿大、出血，肾脏肿大、充血，脾脏肿大，采集肝脏组织进行RT-PCR检测，结果为DHAV-1、DHAV-3鸭病毒性肝炎阳性。8日龄使用二价蛋黄抗体皮下注射，同时分别使用DHAV-1和DHAV-3鸭肝抗体作为对照治疗组1、2，观察10日。结果显示，治疗组1622只雏鸭从治疗后第5日开始不出现死亡，共存活1339只，保护率为81.6％，而对照治疗组1、2保护率分别仅为6.3％、57.8％，结果见表11。可见二价抗体可对目前临床多发的DHAV-1、DHAV-3鸭病毒性肝炎起到较为理想的保护效果，而单独使用DHAV-1或DHAV-3抗体无法有效控制不同血清型鸭病毒性肝炎的发生。表11自然发病治疗试验结果实施例9DHAV-3SD1蛋黄抗体的制备及保护效果试验1.DHAV-3SD1蛋黄抗体的制备1.1抗原的制备将鸭肝炎病毒SD1株毒种用灭菌PBS溶液作1∶100稀释，经尿囊腔接种10日龄易感鸭胚，每胚0.2ml。置37℃继续孵育，弃去48小时内的死胚，收获48～96小时死亡鸭胚，将检验无菌的鸭胚液混合后3500转/分钟离心30分钟，吸取上清液于灭菌容器，加入10％甲醛溶液，随加随摇，使其充分混合，甲醛溶液的终浓度为0.15％，密闭后置37℃温箱中作用24小时(期间振摇3～4次)。1.2免疫用灭活苗的制备油相配制：取注射用白油94份，司本-806份混合后，加入硬脂酸铝2份，边加热边搅拌至透明后高压灭菌备用，即为油相。水相配制：按抗原的4％加入灭菌吐温-80，充分振摇，使吐温-80完全溶解，即为水相。乳化：取油相2份置油相罐内，开动电机搅拌，徐徐加入1份水相，再以3400转/分钟乳化10分钟即可。在乳化终止前加入1％硫柳汞，使其终浓度为0.01％。取样3000转/分钟离心15分钟，应不分层。分装：定量分装，加盖密封。1.3免疫蛋鸡120日龄左右用灭活油苗肌肉注射1ml/只，14日后用灭活苗肌肉注射1ml/只，二免10日后及三免10日后分别用灭活苗肌肉注射1ml/只。当蛋黄中SD1抗体中和效价≥1∶8192集蛋，置4℃贮存备用。1.4蛋黄抗体的制备将蛋壳消毒，收集蛋黄。充分搅拌使蛋黄呈均匀膏状，加入等体积经121℃30min灭菌并冷却的蒸馏水，搅拌混匀，62.5℃加热灭活30min。先在隔层反应罐中加入相当于原蛋黄6倍体积的pH值为4.2的灭菌蒸馏水，并降温至4℃。然后，将灭活的蛋黄液加入，边加边搅拌，4℃静置4h。管式低温连续离心机14000rpm离心分离上清液并转入另一反应罐中。按总量的0.2％(体积比)加入辛酸，搅拌均匀，室温放置4h。用滤布过滤后，再用K型多层板框过滤至澄清，再按总量的0.1％加入饱和甲醛溶液于上述滤液中，充分搅拌混匀，室温放置24h，期间振摇数次。用0.22μm微孔滤芯过滤除菌。用截留分子量为1000KDa的超滤膜过滤除病毒。即得SD1蛋黄抗体。2.DHVSD1蛋黄抗体攻毒保护效果将4日龄雏鸭分为1、2、3组，1、2组每组10只，3组5只。1组注射抗体0.5ml/只，注射抗体后24小时1、2组每只雏鸭用100LD50的SD1强毒攻击。3组为空白对照组。各试验组分开饲养，观察10日，记录雏鸭死亡数。结果显示，SD1抗体可保护免疫组攻毒后雏鸭全部存活，病毒对照组全部死亡，空白对照组全部存活。结果见表12。表12SD1抗体攻毒保护试验结果组别免疫组病毒对照组空白对照组雏鸭存活比例10/100/105/5实施例10DHAV-3SD1VP1蛋白免疫效果试验按Trizol病毒RNA提取试剂盒说明书从鸭胚收获的病毒液中提取病毒RNA。RT-PCR扩增DHAV-3SD1VP1基因序列。将VP1基因克隆到表达载体pET-32a(+)中，筛选原核表达载体pET-32a-VP1，转化大肠杆菌BL21细胞进行大量表达，包涵体蛋白经裂解、洗涤、纯化、复性、浓缩即获得DHAV-3SD1VP1蛋白。紫外吸收法定量蛋白浓度，将所获得的蛋白稀释为850微克/ml按实施例9中1.2的方法制苗，免疫SPF鸡10只，皮下注射1.0ml/只。三免后10天采血分离血清，56℃灭活。将4日龄雏鸭分为4组，每组10只。1组注射重组蛋白(VP1)抗血清，0.5ml/只；2组注射SD1抗血清，0.5ml/只；3组为未免疫组不注射任何血清；次日1、2、3组雏鸭用SD1强毒攻击，4组作为空白对照组。各组隔离饲养观察10日。攻毒结果表明，SD1抗血清组雏鸭存活10/10；重组蛋白抗血清组雏鸭存活5/10；而未免疫组雏鸭则全部死亡。本发明DHVSD1重组VP1蛋白抗血清免疫雏鸭，可以部分抵御SD1强毒的致死攻击，可见DHVSD1重组VP1蛋白有相当的免疫原性，使雏鸭获得免疫保护力。表13DHAV-3SD1VP1蛋白免疫效果以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。SEQUENCELISTING<110>普莱柯生物工程股份有限公司<120>鸭病毒性肝炎二价蛋黄抗体及其制备方法和应用<160>1<170>PatentInversion3.3<210>1<211>745<212>DNA<213>鸭肝炎病毒<400>1caatgatcagggtgattccaatcagcttggtgatgatgaaccagtgtgttttctcaattt60tgagactgcaaatgtgccaatacaaggggagtcgcacaccttggtgaaacatctttttgg120ccgtcaatggctggttcgtactgttcaacatactactgaggtacaagagttggatttgcc180agtacctgaccagggtcatgcatctctgttgcgcttctttgcctatttctctggggaagt240gattctgaccattgttaataatggaacaacaccctgcatggttgcacactcttatacaat300ggacaatctcacttctgaatatgctgtcactgccatggggggtattcttatcccagcaaa360ctctgccaagaatattaatatcccattttattctgttacacctttacgccccacacgacc420catgccagcatctcaggggggtggcttgacttttggcaggttgtatatttggacacaatc480aggaagtgtttctgtttttatgggcctccataagccagctttgtttttcccactacctgc540accaacctacacaacacacacgctgttgaataagattgaaaccatgaatctgcataatca600atcagatcagccagattgccatctgtgtgagatttgtaggaaaatgaaaaaatggtctcg660caaccatcgcccatttcgcttctgtttgagactcaaaacacttgcctttgagctccattt720ggaaattgaatcataccaatttcga745当前第1页1 2 3