基因沉默指示基因及其病毒诱导沉默载体以及构建和侵染方法与流程

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种基因沉默指示基因及其病毒诱导沉默载体以及构建和侵染方法。

背景技术：

柑橘属于多年生木本植物，通过常规的遗传转化技术验证基因功能，一直受到遗传转化率低、再生周期长和童期长等困扰。病毒诱导的基因沉默(virus-inducedgenesilencing，vigs)是一个抑制内源基因表达的强大工具，因其具有快速、高效、高通量、便利、便宜等优点，已被用于如马铃薯(solanumtuberosum)、本生烟(nicotianabenthamiana)、拟南芥(arabidopsisthaliana)、西红柿、水稻(oryzasativa)和玉米(zeamays)等多种植物的基因功能研究。目前，多个vigs载体被应用于解析代谢途径、植物发育、生物和非生物胁迫。近年来，多种vigs载体相继得到开发并在多种植物中得到广泛的应用。其中，烟草脆裂病毒(trv)是目前应用最广泛的vigs载体，它是由trv1与trv2两条rna病毒链组成，trv1用于辅助载有靶基因片段的trv2在植物体内移动。trv作为病毒载体有诸多优点，比如病毒症状较轻、沉默效率高且持久、各种组织均可产生沉默等，因而被广泛应用。虽然，来源于柑橘的叶疱斑病毒(citrusleafblotchvirus，clbv)和衰退病病毒(citrustristezavirus，ctv)的载体已在柑橘中建立沉默体系，但存在基因沉默表型出现慢、不是很稳定，未被应用于更广泛的基因功能研究。trv是很多草本和少数木本植物中广泛应用于鉴定基因功能的vigs载体。在这些寄主植物中，trv引起的症状比其它载体相对温和，并且能够快速地传递到分生组织、根、果实、花和叶等整个植株，甚至通过种子传到子代。然而，trv载体是否能够有效地抑制柑橘中的内源基因表达，目前尚未见报道。

magnesiumchelatasesubuniti(chll)基因是控制叶绿素的生物合成相关的基因，在一些植物中被作为一个通用的vigs报告基因，沉默此基因导致叶片形成黄化现象。目前柑橘的chll基因目前还未得到证实和报道。

技术实现要素：

针对以上问题，本发明一方面提供一种用于trv介导的基因沉默系统中的指示基因，其核酸序列如seqidno:1所示。

本发明另一方面提供了一种含有柑橘chll指示基因的病毒诱导沉默载体，所述载体为trv介导的柑橘chll基因病毒诱导沉默载体，其含有如seqidno:1所示的核苷酸序列。

本发明另一方面还提供了一种上述含有柑橘chll指示基因的病毒诱导沉默载体的构建方法，包括如下步骤：

(1)提取柑橘植株cdna；

(2)以柑橘植株cdna为模板，以引物cichll-v2-f和cichll-v2-r进行pcr扩增，引物序列为：

cichll-v2-f：5’-tctagaggtctgtgggacgattgacat-3’，

cichll-v2-r：5’-gagctccgagctctctcctccacaatc-3’；

(3)将步骤(2)的扩增产物进行回收纯化得到目的基因片段；

(4)用xbai和saci限制性内切酶分别对trv2载体和步骤(3)得到的目的基因片段进行双酶切；

(5)将步骤(4)得到的目的基因片段和trv2载体的酶切产物进行连接；

(6)将连接产物转化至dh5α感受态细胞，筛选得到阳性克隆，提取质粒，即得。

在上述技术方案中，所述步骤(2)中的pcr反应程序为：98℃变性10s，56℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环。

本发明另一方面还提供了一种重组载体侵染柑橘幼苗的方法，包括如下步骤：

(1)将上述制备得到的病毒诱导沉默载体进行扩繁得到扩繁菌液，与trv1的扩繁菌液混合，得到侵染液；

(2)将柑橘幼苗浸入侵染液，在真空条件下进行浸染10s～30min，或采用无菌注射器将重悬液注射叶片；

(3)用清水冲洗浸染的部位后，将幼苗移至光照培养箱中培养，培养条件为19～28℃，白天光照14～18h，夜间黑暗培养6～10h，保持50～95％的湿度进行培养。

本发明另一方面还提供了一种用于如seqidno:1所示指示基因的实时荧光定量检测的引物组，所述引物组的上、下游序列为：

cichll-qpcr-f：5’-agatccagaggccatgggtat-3’，

cichll-qpcr-r：5’-atcgtcccacagaccctgtct-3’。

本发明的有益效果是：本发明首次成功证实了柑橘的chll基因，并利用trv成功构建了沉默柑橘chll基因的诱导载体，首次证明trv能够成功应用于柑橘基因沉默和功能验证，为柑橘类植物的基因功能研究奠定了很好的基础。本发明的基因沉默载体构建简易，沉默表型显著，性状表现持久，为快速的基因功能研究起到良好的指示作用。

附图说明

图1是trv2-cichll和trv1混合的重悬液侵染柑橘幼苗后的荧光观察图。

图2是处理组浸染的柑橘幼苗的dna常规pcr扩增产物电泳图，v1：trv1部分片段，v2：trv2部分片段，g：gfp部分片段，m：dl2000marker。

图3是墨西哥莱檬和长寿金柑用对照组和处理组进行侵染后14天时的植株叶片表型图，mxglm：墨西哥莱檬，csk：长寿金柑，c+：对照组，chll-trv：处理组。

图4是长寿金柑侵染后14天chll基因qrt-pcr表达量检测结果图，chll-trv：处理组，trv+：对照组，trv-：未进行侵染的植株。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

主要试剂及生产者：

primescript^tm1ststrandcdnasynthesiskit、t4dnaligase、ex：takara公司，日本。

biospingelextractionkit：杭州博日科技有限公司，中国。

限制性内切酶xbai、saci：thermoscientific公司，美国。

trv1、trv2-gfp、trv2载体：中国农业科学院柑桔研究所资源育种研究室保存提供。

dh5α感受态细胞：takara公司，日本。

eha105农杆菌感受态细胞：中国农业科学院柑桔研究所资源育种研究室保存提供。

e.z.n.a.tmplasmidminikiti：omegabio-tek公司，美国。

总rna提取试剂盒：天根公司，中国。

实施例1柑橘chll基因病毒诱导沉默载体的构建

1、提取柑橘叶片cdna：用cdna提取试剂盒primescript^tm1ststrandcdnasynthesiskit提取柑橘叶片cdna。

2、扩增柑橘chll基因

从拟南芥基因组数据库搜寻到chll的氨基酸序列，通过与柑橘的基因组数据库(http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)进行blast比对后获得同源基因序列，根据该同源基因设计带有酶切位点的柑橘chll基因的pcr扩增引物cichll-v2-f和cichll-v2-r，引物序列为：

cichll-v2-f：5’-tctagaggtctgtgggacgattgacat-3’(seqidno:2)，

cichll-v2-r：5’-gagctccgagctctctcctccacaatc-3’(seqidno:3)。

以柑橘叶片cdna为模板，利用引物cichll-v2-f和cichll-v2-r，采用takara公司的ex(pcr反应体系参照说明书)进行pcr扩增，pcr反应程序为98℃变性10s，56℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环。

3、pcr产物经琼脂糖凝胶电泳得到348bp的基因片段，用胶回收纯化试剂盒biospingelextractionkit回收纯化目的片段，对回收片段进行测序，其序列如seqidno:1所示，认为该序列为柑橘的chll基因，有待后续进一步验证。

4、用fastdigestxbai和saci限制性内切酶分别对回收纯化的目的基因片段和trv2载体进行双酶切(酶切体系参照说明书)，37℃酶切5-30min。

5、将前述得到的目的基因片段和trv2载体酶切产物回收纯化后，用t4dnaligase进行连接(连接方法参照说明书)。

6、连接产物42℃热激90s，转化至dh5α感受态细胞，挑取阳性克隆利用质粒提取试剂盒e.z.n.a.tmplasmidminikiti提取质粒(提取方法参照说明书)，得到重组质粒，命名为trv2-cichll质粒，即得到柑橘chll基因的病毒诱导沉默载体。

实施例2制备扩繁菌液

分别取0.5μl的trv1、trv2-gfp、trv2-cichll质粒，采用电击法分别转化到20μl的eha105农杆菌感受态细胞，涂布到lb固体培养基(含50mg/l卡那霉素、50mg/l庆大霉素和50mg/l利福平)，置于28℃暗培养2-3天。挑取含有trv1、trv2-gfp、trv2-cichll农杆菌的单克隆至lb液体培养基(50mg/l含卡那霉素、50mg/l庆大霉素和50mg/l利福平)，置于28℃摇床上200r/min过夜培养，收集农杆菌细胞，用mma(含10mmmgcl2，10mm2-吗啉乙磺酸(mes),100μm乙酰丁香酮(acetosyringone))液体重悬菌体，调od600至0.5以上。分别向trv2-gfp、trv2-cichll重悬液中加入等体积的trv1重悬液，然后加入重悬液体积0.05～0.25％的silwetl-77表面活性剂，混匀后静置1h以上。将trv2-gfp和trv1混合的重悬液作为对照组，将trv2-cichll和trv1混合的重悬液作为处理组。

实施例3浸染

用实施例2制备的对照组和处理组重悬液分别去浸染不同的柑橘幼苗，然后检测侵染是否成功，按照如下步骤操作：

(1)将柑橘幼苗浸入重悬液，在真空条件下进行浸染10s～30min。或采用无菌注射器将重悬液注射叶片。

(2)用清水冲洗浸染的部位后，将幼苗移至光照培养箱中培养，培养条件为19～28℃，白天光照16h，夜间黑暗培养8h，保持50～95％的湿度进行培养。

(3)侵染结果检测

a、用对照组和处理组侵染的柑橘幼苗，都能检测到绿色荧光，处理组幼苗荧光观察如图1所示。

b、用pcr方法检测侵染后的幼苗：

①采用常规pcr方法扩增

提取显示荧光的幼苗的dna(ctab法)，分别用扩增trv1、trv2、gfp的引物组trv1-f/trv1-r、trv2-f/trv2-r、trv2-gfp-f/trv2-gfp-r进行常规pcr扩增，在对照组和处理组侵染的柑橘幼苗中都能检测到trv1、trv2、gfp的部分片段，处理组的扩增结果如图2所示。

所述引物的序列如下：

trv1-f：5’-ttgggttgctactgattcgact-3’(seqidno:4)，

trv1-r：5’-ctgtaaggaccatcatacttcgc-3’(seqidno:5)，

trv2-f：5’-attcactgggagatgatacgct-3’(seqidno:6)，

trv2-r：5’-gaatctaagtccactcgtccgt-3’(seqidno:7)，

trv2-gfp-f：5’-ctgcccgacaaccactacct-3’(seqidno:8)，

trv2-gfp-r：5’-cttgtacagctcgtccatgcc-3’(seqidno:9)。

②采用实时荧光定量pcr检测侵染后的幼苗中cichll基因表达量

侵染后培养14天后，从植株表型可以观察到(如图3所示)：侵染了对照组重悬液的墨西哥莱檬和长寿金柑植株的叶片并未发生黄化现象，而侵染了处理组重悬液的叶片则出现了黄化现象，进一步证明seqidno:1就是柑橘的chll基因。处理组重悬液诱导的沉默效率如表1所示：

表1处理组诱导的不同品种的沉默效率

然后，用总rna提取试剂盒提取长寿金柑对照组、处理组、未进行任何处理的幼苗的总rna，利用引物cichll-qpcr-f(5’-agatccagaggccatgggtat-3’，seqidno:10)、cichll-qpcr-r(5’-atcgtcccacagaccctgtct-3’，seqidno:11)进行qrt-pcr表达量检测。检测结果如图4所示，可见在侵染后14天，用处理组处理的沉默植株的cichll基因的表达量明显下降，进一步证明seqidno:1就是柑橘的chll基因，本申请构建的trv介导的病毒诱导沉默载体trv-cichll能够成功沉默柑橘的chll基因。

序列表

<110>中国农业科学院柑桔研究所

<120>基因沉默指示基因及其病毒诱导沉默载体以及构建和侵染方法

<130>1

<160>11

<210>1

<211>348

<212>dna

<213>人工序列

<223>柑橘chll基因

<400>1

ggtctgtgggacgattgacattgagaaagctctaacggagggtgtcaaagcatttgagcc60

tggccttcttgctaaagctaacagaggaattctttatgttgatgaagttaatcttctgga120

tgaccatttagtggatgttcttttggattctgctgcctcgggatggaacacagtagagag180

agagggcatttcaatttcacatcctgcaaggtttattctgattggttcaggtaatcctga240

ggaaggagagctaaggcctcagctgcttgatcggtttggaatgcatgcccaagtggggac300

tgtaagggatgcagaactcagagtaaagattgtggaggagagagctcg348

<210>2

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<223>cichll-v2-f

<400>2

tctagaggtctgtgggacgattgacat27

<210>3

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<223>cichll-v2-r

<400>3

gagctccgagctctctcctccacaatc27

<210>4

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<223>trv1-f

<400>4

ttgggttgctactgattcgact22

<210>5

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<223>trv1-r

<400>5

ctgtaaggaccatcatacttcgc23

<210>6

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<223>trv2-f

<400>6

attcactgggagatgatacgct22

<210>7

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<223>trv2-r

<400>7

gaatctaagtccactcgtccgt22

<210>8

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<223>trv2-gfp-f

<400>8

ctgcccgacaaccactacct20

<210>9

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<223>trv2-gfp-r

<400>9

cttgtacagctcgtccatgcc21

<210>10

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<223>cichll-qpcr-f

<400>10

agatccagaggccatgggtat21

<210>11

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<223>cichll-qpcr-r

<400>11

atcgtcccacagaccctgtct21