技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种蜜蜂西奈湖病毒基因组扩增引物和扩增方法及其应用。
背景技术：
：
西奈湖病毒(lakesinaivirus，lsv)，属+ssrna病毒，基因组长约5600bp，目前发现有7株，lsv1-7。2008年首次发现于美国南达科他(southdakota)的靠近西奈湖(lakesinai)的一个流动养蜂场，随后研究表明该病毒与蜜蜂群体崩溃失调病(ccd)的发生有关。其中lsv2毒性最强，其基因组全长约5910bp，编码衣壳蛋白57.3kda，包括3个开放阅读框，病毒粒子直径约27nm。lsv可以通过媒介，食物或粪便传播，分布于蜜蜂的肠道、胸部、腹部及头部。但具体病理特征还不清楚。为了研究其病理特征，其纯病毒粒子的获得是关键，但是一般情况下，蜜蜂常携带多种病毒或其他病原，因此获得lsv病毒基因组全长，构建病毒复制体系是关键。因此，基因组信息的获得对于西奈湖病毒研究具有重要意义。目前其基因组信息的获得是高通量测序，再拼接，成本高，对信息生物学技术分析要求高，并且得不到序列进行后续研究，只能获得信息。
技术实现要素：
：
本发明的目的是提供一种高灵敏度的蜜蜂西奈湖病毒基因组扩增引物和扩增方法及其应用。
本发明的第一个目的是提供蜜蜂西奈湖病毒基因组扩增引物，其特征在于，包括六对扩增引物：
引物对1：lsv-1f：5'-gggaagtttatgcctcctac-3'；
lsv-1r：5'-gatgatcgagaagagctgg-3'；
引物对2：orf1-f-78：5'-atgaaggttgtcttcttggtttcg-3'；
orf1-r-2615：5'-ttacgcaccttcgtttgggaggt-3'；
引物对3：rdrp-f-1852：5'-atgatatcaagtcttgtgacgc-3'；
rdrp-r-3720：5'-ttacgcgtaaagaacagacctaaact-3'；
引物对4：lsv-3630：5'-ttcctcttaccgctatcttaag-3'；
lsv-3903：5'-gcctattaatagacgaaggctg-3'；
引物对5：cap-f-3738：5'-gtgaatccaccaactacgactac-3'；
cap-r-5300：5'-ttacttagcgtcaaagaagatgt-3'；
引物对6：lsv-5154f：5'-atctccatgttgccgggtgtagg-3'；
lsv-5909r：5'-gctgtcgcaacaaccaacagcgtt-3'。
本发明的第二个目的是提供一种蜜蜂西奈湖病毒基因组的扩增方法，其特征在于，分别以上述引物lsv-1f/lsv-1r、orf1-f-78/orf1-r-2615、rdrp-f-1852/rdrp-r-3720、lsv-3630/lsv-3903、cap-f-3738/cap-r-5300和lsv-5154f/lsv-5909r作为扩增引物的上下游引物，以蜜蜂西奈湖病毒的rna为模板进行rt-pcr扩增，分别得到扩增产物，然后对扩增产物进行核酸序列测序，然后再拼接比对，得到蜜蜂西奈湖病毒基因组全长序列。
优选，所述的rt-pcr扩增，其反应体系为：含有2×one-steprt-pcrmixture10μl，10μmol/l上游引物和10μmol/l下游引物各0.6μl，mlv/rnasin/hs-taq酶混合液0.8μl，rna模板2μl，其余由双蒸水补足至20μl。
优选，所述的rt-pcr扩增，其反应条件为：以引物对lsv-1f/lsv-1r作为引物的反应条件为：50℃反转录30min；94℃预变性3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，共30次循环；72℃最后延伸5min；以引物对orf1-f-78/orf1-r-2615作为引物的反应条件为：50℃反转录30min；94℃预变性3min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，共30次循环；72℃最后延伸5min；以引物对rdrp-f-1852/rdrp-r-3720作为引物的反应条件为：50℃反转录30min；94℃预变性3min；94℃30s，63℃30s，72℃30s，共30次循环；72℃最后延伸5min；以引物对lsv-3630/lsv-3903作为引物的反应条件为：50℃反转录30min；94℃预变性3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，共30次循环；72℃最后延伸5min；以引物对cap-f-3738/cap-r-5300作为引物的反应条件为：50℃反转录30min；94℃预变性3min；94℃30s，63℃30s，72℃30s，共30次循环；72℃最后延伸5min；以引物对lsv-5154f/lsv-5909r作为引物的反应条件为：50℃反转录30min；94℃预变性3min；94℃30s，61℃30s，72℃30s，共30次循环；72℃最后延伸5min。
本发明的第三个目的是提供蜜蜂西奈湖病毒基因组扩增引物在扩增得到蜜蜂西奈湖病毒基因组序列中的应用。
本发明针对蜜蜂西奈湖病毒主要致病基因型，根据基因组所包含的三个开放阅读框设计了分段扩增策略，并根据保守区域设计相应的扩增引物，能有效的扩增出蜜蜂西奈湖病毒的全基因组序列。本发明可广泛应用于蜜蜂及相关蜂产品、检验检疫等具有蜜蜂西奈湖病毒检测需求及相应的科研领域。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
以下实施例所使用的蜜蜂西奈湖病毒基因组扩增引物，具体如下：
引物对1：lsv-1f：5'-gggaagtttatgcctcctac-3'；
lsv-1r：5'-gatgatcgagaagagctgg-3'；
引物对2：orf1-f-78：5'-atgaaggttgtcttcttggtttcg-3'；
orf1-r-2615：5'-ttacgcaccttcgtttgggaggt-3'；
引物对3：rdrp-f-1852：5'-atgatatcaagtcttgtgacgc-3'；
rdrp-r-3720：5'-ttacgcgtaaagaacagacctaaact-3'；
引物对4：lsv-3630：5'-ttcctcttaccgctatcttaag-3'；
lsv-3903：5'-gcctattaatagacgaaggctg-3'；
引物对5：cap-f-3738：5'-gtgaatccaccaactacgactac-3'；
cap-r-5300：5'-ttacttagcgtcaaagaagatgt-3'；
引物对6：lsv-5154f：5'-atctccatgttgccgggtgtagg-3'；
lsv-5909r：5'-gctgtcgcaacaaccaacagcgtt-3'。
实施例1：样本中病毒基因组的扩增效果
(1)病毒样本处理及核酸提取：取蜜蜂西奈湖病毒阳性样本，通过pbs溶液(ph7.4，depc处理)冲洗待处理样品后，在样品中加入rna提取液，并按rna提取试剂盒说明书抽提样本中病毒rna共60μl。
(2)基因组分段扩增法(即分6段扩增，所使用的引物配组如下：lsv-1f/lsv-1r、orf1-f-78/orf1-r-2615、rdrp-f-1852/rdrp-r-3720、lsv-3630/lsv-3903、cap-f-3738/cap-r-5300和lsv-5154f/lsv-5909r，每次rt-pcr反应选择一对引物)：采用20μl的一步法rt-pcr反应体系，含有2×one-steprt-pcrmixture10μl，上游引物和下游引物(10μmol/l)各0.6μl，mlv/rnasin/hs-taq酶混合液0.8μl，样本rna模版2μl，其余由ddh2o补足。
反应条件为：以引物对lsv-1f/lsv-1r作为引物的反应条件为：50℃反转录30min；94℃预变性3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，共30次循环；72℃最后延伸5min；以引物对orf1-f-78/orf1-r-2615作为引物的反应条件为：50℃反转录30min；94℃预变性3min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，共30次循环；72℃最后延伸5min；以引物对rdrp-f-1852/rdrp-r-3720作为引物的反应条件为：50℃反转录30min；94℃预变性3min；94℃30s，63℃30s，72℃30s，共30次循环；72℃最后延伸5min；以引物对lsv-3630/lsv-3903作为引物的反应条件为：50℃反转录30min；94℃预变性3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，共30次循环；72℃最后延伸5min；以引物对cap-f-3738/cap-r-5300作为引物的反应条件为：50℃反转录30min；94℃预变性3min；94℃30s，63℃30s，72℃30s，共30次循环；72℃最后延伸5min；以引物对lsv-5154f/lsv-5909r作为引物的反应条件为：50℃反转录30min；94℃预变性3min；94℃30s，61℃30s，72℃30s，共30次循环；72℃最后延伸5min。
(3)电泳、pcr产物序列测定：取扩增产物5μl，1.0％的琼脂糖凝胶(含0.05‰goldview核酸染料)进行电泳，并通过凝胶成像系统观察结果。按引物对：lsv-1f/lsv-1r、orf1-f-78/orf1-r-2615、rdrp-f-1852/rdrp-r-3720、lsv-3630/lsv-3903、cap-f-3738/cap-r-5300和lsv-5154f/lsv-5909r，每次rt-pcr的顺序，扩增条带依次为500bp、2538bp、1869bp、275bp、1563bp、756bp。
(4)基因组序列拼接与比对：拼接各段序列，获得基因组全长序列，长度为5909bp。将基因组序列提交genebank进行blast分析，结果表明，所得lsv基因组序列(其核苷酸序列如seqidno.1所示)与genbank登录号为：hq888865.2(美国)的lsv2基因组序列达到94％的相似度。
序列表
<110>广东省生物资源应用研究所
<120>一种蜜蜂西奈湖病毒基因组扩增引物和扩增方法及其应用
<160>1
<210>1
<211>5909
<212>dna
<213>蜜蜂西奈湖病毒
<400>1
gggaagtttatgcctcctacttcctagcatcgattcgtgtggttactggtaattggccgc60
aggtcatcccacacaccatgaaggttgtcttcttggtttcgtttgctgtgttcctcatct120
gtcaggccccacccgtctcgtactggttggaggatctgttagatgagtacaacacgatgt180
gcagttatgagtatgctgctgctgaggcttataacaattttgttcacaagcatcgcgtgg240
ccgcctatgctgccggtgtccgtgttctgcggtaccgtgcaccgtggtattgttttgcgt300
cgcgaagcgttcccgttgtccacccgttttcctggcttatgggtcagtatgacgctacga360
ttgaccgcgttggcacgttgatgcagcgacttgagatcgcgaatgtttcaatttctgacg420
gccttcgcaccgttgccgatactgctctcaaggcttacttttactatcagatcatctggt480
tccagctcttctcgatcatcatgctggtcggtttcttttctgctgtcatttgctctagtc540
gtgtgcgtgttgtccgcatacgcaacagggtacgtggttacagcgtctctgaactgcgct600
ctgattttgaggagagtatgtccgccatattggcccccttatctcgcgggcactcttgtt660
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gttgtttccggtctgttgcgtcgtcgcagggcaggtgggcggaagttggtcatcgtctcc780
accgctgctcacctgtcgtcatggatggcgcattcgtgcctgagtatgatcaacgtttca840
gtgcctgccgtcggcacccctccgtttgtccggataggtttgatatccctgccgcgattc900
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atccgtattaccactggtccgacgagggtgttgttgttgcttcttccggtgcgtttcaat1140
actttagaattggacgtctgttcgataccaccctctactatgcatttccaacctctggaa1200
catatgctcgggatgatccttcagctcttcgccgttctaccagcggcgacctccattact1260
attctccgcacgaaaagcgctttgtcagttatacagctgatgatactcattaccatgtct1320
ttggcgttgccgttccgcgttcgttggccgactactgcgctgccactttttgcagagcag1380
ttcgtgatgataagttttatgacagtctgcgttcttactaccagaataggtgtcgggcca1440
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acgctagcttgcgtactttcggcttttcccggttgtcttccgctccttcgtcctggtcgg1560
cttattgcttgtcatggatcctggtcaaggttaatcatatgatgccgctggcccttactt1620
catacgtcctgaatgtgttgcaccggtttttcggcgctaagtctgcgccgtggaactggg1680
caacggttcacctgccaacttatgatatggtgacatcgccatttcggctgaggctgtttg1740
ggcgcaatcctacagtctttaacctcgagcgatttcgtgctgaggccacggttgttggtt1800
cccccaatcgtggccagcctgccgagggtgcctgccaagacgatcacgaacatgatatca1860
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ctcatcccaagagaaccactcaccccctgtgccccgacccgactgcctcgtgcggacctc2160
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cggtgggaggtgaagatatcacccatgttgttgatccggctctgggagcgtctatatcgc2280
aacggtttagcgcttcgcagttacgcctccttggctggtctatcgacggaattttcaata2340
ctttatctggcgccgccacctcgtcattcgtcgagtcgacgttgttgtgcttatcacgat2400
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aagtgttctgatccacgaaacatttcacctcgaagcgatgcgaccctttcgacccttggc2700
ccttatttttccgccatcgagcataatgctgccggtttgccctttctaattaagggatgt2760
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gcttggatctcgttggtctacgcccctgatatgcacccgctgttctggcagacgctggtc2940
gccacgttggtcacttcggggtttagtgagtatggcattacctataccctccccggatcg3000
cgttgtagcggcgaccctcatacgtctgttggcaacggcatcctcaatgcgttcctcaca3060
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ccgtgggcggtttattttccgtttaattatgagccgttccattctgaaccaaccccagcg3540
atgcgcgccgccttctcggcgcgcacaggtatatctcctgccttgcagatattgtacgag3600
cagtatctcctcaatttaaaatatgtcccttcctcttaccgctatcttaagcgtgatctt3660
gacatagacggtgtccataccgcgttgttgggtgagtttaggtctgttctttacgcgtaa3720
ccaatagaaattatcacgtgaatccaccaactacgactacaaccactacgcgcaccattc3780
gcgccccaaaagttcaactggcgcccaattctgccactcggcgtcggcgtaatcgtcgac3840
gccgtcgacctgccgctactattgctgggcctttgtccatccagccttcgtctattaata3900
ggcgtatggtgtctagggttaccagaaggtccgccgttatcaccgcggccggtctagcgt3960
ggctgcgtcagtatctcaaccctatgggtcccgacacgaccagcgttacgggctaccccg4020
atggttctgctgttactacgtgtatcgcggactattctaacacgtttaatgtgtctttcc4080
cgcccagggaggccctttattgcactgggtcctcctcttcggaaaagcctacccttgtcg4140
acgctgacaattatgccaagatagacaagtggtccacctacgacatcacactatgcgtgc4200
tcgcactacccatgttgcgtaacgttgtgatgcttcgtctctacccgcacacccctactg4260
ctttcgcccttaccgagcagactcccaattttcctcaacgttttccgaactggagtgttt4320
actccgctgatggtactcggttcaacaacggcgatgagcctggttaccttcagtcctatg4380
tttacttgccgaacgttgacaagcatctttctgctgcccggggataccgcttactgtccc4440
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cgtcgatgcctcgatatgtgttcccgctagatggagataattgtgctccgtcatccctca4680
ccgaaacttaccatcaggcctatcaatccaaggctactgatggattttacatgcctgtgt4740
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tattgcaatatattcctacctccggctctgtcttggctaactttaccagacacgagccta5040
cttacgatcagatagcacttgatgctgctgatcgtctgcgtaacctgatgcctcacgctt5100
accctgccgcatacaacgattggggatggcttggtgatctgcttgattctgccatctcca5160
tgttgccgggtgtaggtactgtgtataacattgccaaaccacttatcaagcctgcgtgga5220
actggcttggaaataaggtgtctgacttctttggaaacccggtggctcgtgatggcgaca5280
tcttctttgacgctaagtaatcggaggcgcaatctctcggcgctagaaatttaacgattt5340
cgatatgccaagtatcttgacgttgtatttcgtctttattgtagtgtggttactggtaat5400
cagtcgcagactgctccacgctatgcgccccagaggttcgtacagttcgatgctcgccac5460
cgaatgcttgcgagtccaacttgagctcgctcgcaaagtggccaattatcttggtgtcga5520
tcacgtttatgtgttcgataccaccgggttctttgacagtgcttctgtccatgtcacctc5580
ccacggtttgcgttaccgcacccgtgaggggcatgtcgctgtgctgtctcagtcagcgca5640
gttgatactgccacgcgctgaccctaatgtgttccagcagatcgccagatgccgactcat5700
caatgctgcctatggcctctgcttggacaccccccagtcagaccgctcggacgctgttga5760
tgtgtccgaccgcggtcgagacgaggttgacggttgattattgcaatcaccgttggccag5820
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