一种基于PSP的适用于高通量测序中elRNA文库构建方法与流程

本发明涉及基因高通量测序技术领域，具体地，涉及一种基于psp的适用于高通量测序中elrna文库构建方法。

背景技术：

在二代和三代测序技术中，构建高质量的测序文库是高通量测序的关键因素。测序文库的质量直接决定测序产出的数据质量，进而对数据分析有着莫大的关联。随着高通量测序技术的快速发展，各大试剂公司，高通量测序在动物学、植物学、微生物学、农业、医学等各个领域得到了极大的应用。高通量测序的建库方法也逐渐被开发、成熟、应用；面对的样品类型越来越复杂，例如单个细胞、cfdna等，这类样品的获得相当不容易，难以满足高通量测序文库构建的要求。

外泌体为细胞分泌到胞外的囊性小泡，囊泡直径大小在30-100nm，其内包含多种物种，有dna、rna、蛋白质。经多国科学家研究，证实外泌体内含物能够一定程度上反应细胞内生理变化，可以作为细胞生理活动的一种指标，也即，外泌体内含物是细胞生理活动的一种标记物。外泌体内含物在医学上有着重要的意义，尤其是在肿瘤方面，需要更进一步地研究。高通量测序方法在这一领域具备技术条件，是研究外泌体内rna种类、含量等方面重要的举措。

但是，外泌体内含物的量非常低，对利用高通量测序技术对外泌体内rna的科研造成一定的影响，具体影响到高通量测序中的建库成功率。通俗讲，文库构建不成功，就无法进行高通量测序，也就无法进行相关研究。对此，本发明就在外泌体内含物含量无法增加的情况下，借助于psp(pcr-sort-pcr)文库富集技术，引入一种适用于高通量测序中elrna文库构建方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种基于psp的适用于高通量测序中elrna文库构建方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种基于psp的适用于高通量测序中elrna文库构建方法，包括以下步骤：

(1)以elrna为样品来源；

(2)采用去除核糖体方法进行文库构建至pcr反应之前；

(3)采用psp文库富集技术进行两轮pcr扩增。

本发明方法适用于来源于外泌体包裹的大rna，即elrna。外泌体来源于种类不限，但其包裹物中必须含有elrna。

步骤(1)所述的elrna为外泌体中非小rna，可以简单界定为rna长度大于或等于200nt。

步骤(3)所述的psp文库富集技术依次包括第一轮pcr扩增、片段分选或dna纯化、第二轮pcr扩增三个步骤。

上述第一轮pcr扩增的循环数为建库流程中建议循环数的一半，上述第二轮pcr扩增的循环数为建库流程中建议循环数的另一半。所述建库流程中的建议循环数为常规建库试剂盒给出的pcr条件中的pcr循环数。

本发明技术方案的关键为：在文库构建过程中将pcr扩增由一步扩增设计为两轮pcr扩增，并在两轮扩增中间添加片段分选或dna纯化步骤，采用该方法可以在首轮pcr之后，样品总量有所提高的情况下，利用纯化或者片段分选的方式对所得核酸进行限定，以期达到片段分布相对集中的文库，并且能够有效避免文库片段类型的丢失，保证了文库的片段类型的丰度；另外，通过纯化或者片段分选，将首轮pcr产品进行除杂，为第二轮pcr提供更加纯净的模板，进而提高第二轮pcr的反应效率。因此，本发明技术可以成功构建elrna文库，而实验过程中采用一步扩增却无法成功构建elrna文库。

依次包括第一轮pcr扩增、片段分选或dna纯化、第二轮pcr扩增三个步骤。

上述的片段分选为采用磁珠法进行核酸片段范围分选或者采用切取琼脂糖凝胶的方法进行核酸片段范围分选。上述dna纯化的方法包含但不限于磁珠法、过柱法。

步骤(2)中采用去除核糖体方法进行文库构建至pcr反应之前的过程包括以下步骤：

(ⅰ)对外泌体totalrna进行核糖体rna去除；

(ⅱ)对步骤(ⅰ)所得rna进行高温、高盐打断；

(ⅲ)对步骤(ⅱ)所得产物进行逆转录成双链cdna，并进行纯化；

(ⅳ)对步骤(ⅲ)所得产物进行末端修复、3`末端加a、加接头，并进行纯化。

步骤(3)中第一轮pcr扩增所用模板为步骤(2)中获得的纯化产物。

步骤(3)中第二轮pcr扩增获得的产物应进行纯化，所述纯化的方式包含但不限于磁珠法、过柱法等。

上述的方法在构建高通量测序文库中的应用。

本发明提供的一种基于psp的适用于高通量测序中elrna文库构建方法，最优选技术方案具体包括以下步骤：

(1)以elrna为样品来源；

(2)采用去除核糖体方法进行文库构建至pcr反应之前；

(ⅰ)利用核糖体rna去除试剂盒对外泌体totalrna进行核糖体rna去除；

(ⅱ)利用试剂盒提供的逆转录模块缓冲液对步骤(ⅰ)所得rna进行高温、高盐打断；

(ⅲ)利用试剂盒提供的逆转录模块对步骤(ⅱ)所得产物进行逆转录成双链cdna，并进行纯化；

(ⅳ)利用试剂盒提供的建库模块对步骤(ⅲ)所得产物进行末端修复、3`末端加a、加接头，并进行纯化；

(3)按照试剂盒提供的温度条件，对纯化后的接头连接产物进行首轮pcr扩增；然后利用dna纯化磁珠对首轮pcr产物进行分选或者纯化；最后按照试剂盒提供的温度条件，对分选或纯化后的pcr产物进行二轮pcr扩增。

步骤(ⅲ)和(ⅳ)中所述纯化的方法为磁珠纯化，但不限于此。

本发明方法中，步骤(2)所述的文库构建至pcr之前，是指含有单次pcr扩增的文库构建流程中的pcr反应之前。进一步地，若某一建库流程存在多次pcr反应，使用本专利的停靠点应结合实际情况安排。

本发明的实施例中，使用agilent公司出品的2100核酸检测仪及相关试剂，或者perkinelmer公司提供的labchipgxtouch及相关试剂进行样品片段范围检测。建库试剂为南京诺唯赞生物科技有限公司(vazyme)提供的vahtstotalrna-seq(h/m/r)libraryprepkitfor(#nr603)及配套使用的接头与引物试剂盒vahtstmdnaadaptersforillumina(#n801-n812)。实验过程中使用的dna纯化磁珠为vahtstmdnacleanbeads(#n412)。

本发明方法中，步骤(ⅰ)中核糖体rna去除试剂盒为市场上销售的相应试剂盒，去除原理不尽相同，适应物种不同，本发明建议结合物种，选择合适的试剂盒。例如本发明使用的是适用于人类，利用核酸酶消化原理的南京诺唯赞生物科技有限公司提供的nr603试剂盒。

本发明方法中，步骤(ⅱ)-步骤(ⅳ)按照nr603试剂盒或者类似的试剂盒提供的相关试剂、条件进行。

本发明方法中，步骤(3)中按照试剂盒给出的pcr温度条件，将pcr循环数调节至一半，进行首轮pcr扩增。

本发明方法中，步骤(3)中所说的片段分选是对首轮pcr扩增获得的pcr产物进行磁珠分选，分选产物可以用于第二轮pcr扩增。在不需要进行分选的文库构建流程中，可以更改为纯化。

步骤(2)所述的去核糖体进行文库构建的方法为市面上提供的常规方法，但不限于此。

步骤(3)所述pcr温度、时间条件应与步骤(2)提供的建库方法所述pcr条件一致，但不限于此，可以根据实际条件进行调整。

发明的适用于高通量测序的低起始量文库构建时文库富集技术，具有以下优点及有益效果：

(1)本发明针对于含量极低的elrna进行文库构建，目的性强；

(2)方法简易可行、易于实际执行；

(3)能够获得较多、均一的文库。

本发明应用新潮，能够解决最为前沿的elrna样品文库构建的困难。

附图说明

图1为本发明实施例中文献给出的外泌体总rna检测结果图，图中可以看出大于200nt的样品含量极低；

图2为本发明实施例中自行提取的外泌体总rna检测结果图，图中可以看出大于200nt的样品含量极低；

图3为本发明实施例中最终文库使用labchipgxtouch检测的结果图，图中能够明显看到，存在300-500bp范围内的正态分布的文库；

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；实施例中所用的试剂为市售商品。核酸检测仪器及试剂为agilent公司出品的2100核酸检测仪及相关试剂，或者perkinelmer公司提供的labchipgxtouch及相关试剂进行样品片段范围检测。建库试剂为南京诺唯赞生物科技有限公司(vazyme)提供的vahtstotalrna-seq(h/m/r)libraryprepkitfor(#nr603)及配套使用的接头与引物试剂盒vahts^tmdnaadaptersforillumina(#n801-n812)。实验过程中使用的dna纯化磁珠为vahts^tmdnacleanbeads(#n412)。

实施例1本发明的适用于极低含量的elrna高通量建库的技术实例

1.使用2100核酸检测仪将提取后的外泌体总rna进行质控，结果如图1；

2.在pcr管中加入10ng外泌体总rna；

3.按照建库试剂盒提供的方法、步骤建库至连接产物纯化后；具体步骤如(ⅰ)～(ⅳ)所示：

(ⅰ)利用核糖体rna去除试剂盒对外泌体totalrna进行核糖体rna去除；

(ⅱ)利用试剂盒提供的逆转录模块缓冲液对步骤(ⅰ)所得rna进行高温、高盐打断；

(ⅲ)利用试剂盒提供的逆转录模块对步骤(ⅱ)所得产物进行逆转录成双链cdna，并用磁珠纯化；

(ⅳ)利用试剂盒提供的建库模块对步骤(ⅲ)所得产物进行末端修复、3`末端加a、加接头，并用磁珠纯化；

4.按照建库试剂盒给出的pcr条件，将cycles调节至9，进行第一轮pcr反应；

5.在pcr反应后进行磁珠分选，分选出范围在450-500bp的片段；

6.分选产物进行第二轮9cycles的pcr反应，pcr产物进行磁珠纯化；

7.使用qubit对最终产物进行浓度测定，结果为13.01ng/ul，并取8μl，用perkinelmer公司提供的labchipgxtouch进行文库片段范围检测，保存图片(图3)；

8.通过对最终文库浓度、片段分布分析，可以得出本发明在elrna建库中有效应用，能够获得满足上机条件的文库，解决了极低含量的elrna建库难题。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。