利用拟南芥AtYchF1基因植物除草的方法及应用与流程

本发明属于基因工程应用技术领域，特别涉及利用拟南芥AtYchF1基因植物除草的方法及应用。

背景技术：

随着世界人口的不断增长，人类对粮食及其他农作物的需求越来越大。为了促进粮食及其他农作物的生长，实现粮食及其他农作物的增产，防止作物附近的杂草与粮食及其他农作物竞争营养成分，常常需要将粮食及其他农作物附近的杂草除去，传统的除草方式是人工除草(割草或拔草)，但是人工除草劳动强度大、效率低且人力成本高；采用除草剂(百草枯)能大大提高除草效率，有效降低劳动强度及人力成本，百草枯(1-1-二甲基-4-4-联吡啶阳离子盐)是一种快速灭杀性除草剂，其除草的机理是作为电子受体，作用于植物线粒体，参与氧化还原调控，产生大量的活性氧自由基，包括超氧化阴离子自由基(O＝)及过氧化氢(H₂O₂)，最终导致植物的死亡，由于百草枯对粮食及其他农作物与杂草并无选择性，同时，粮食及其他农作物对百草枯的耐受性不够高，因此，当杂草与将粮食及其他农作物夹杂生长在一起的时候，使用除草剂(百草枯)除草很容易伤害甚至杀死粮食与其他农作物。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服了上述缺陷，提供利用拟南芥AtYchF1基因植物除草的方法及应用，为培育出耐除草剂作物新品种提供新的可能。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

本发明提供利用拟南芥AtYchF1基因植物除草的方法，包括以下步骤：

步骤1：培育缺失AtYchF1同源基因的作物植物；

步骤2：在田间种植步骤1培育的缺失AtYchF1同源基因的作物植物；

步骤3：在田间施加作物植物耐受的、有效量的除草剂至杂草和作物植物以控制杂草。

本发明还提供利用拟南芥AtYchF1基因植物除草的应用，所述AtYchF1基因在Genebank中的编号为AT1G30580，其DNA序列如序列表中序列1所示，其编码的氨基酸序列如序列表中序列2所示；

所述AtYchF1基因与植物抵抗除草剂功能相关，在将AtYchF1基因缺失后，突变体植株对于除草剂的耐受性得到增强；

而在将AtYchF1基因过表达后，突变体植株对于除草剂的敏感度提升。

本发明的有益效果在于：由于除草剂(百草枯)作用于植物线粒体，参与氧化还原调控，产生大量的活性氧自由基，而发明人通过一系列实验证明，拟南芥AtYchF1基因也参与植物内部的氧化还原调控，并在翻译水平参与了植物对于除草剂(百草枯)的抵抗，且由于YchF家族成员在不同物种间的蛋白质序列保守性极强(同源性>90％)，因此，针对AtYchF1基因的突变体，为培育新的耐除草剂(百草枯)的经济作物新品种提供了新的可能，进而达到利用除草剂(百草枯)清除杂草，但不伤害农作物的目的；本除草方法通过提高作物植物对除草剂的耐受性再利用除草剂除去植物作物附近杂草，既保持了化学除草的高效性，又有效避免了除草剂(百草枯)对作物的伤害，可操作性强，具有一定的推广性。

附图说明

图1是本发明实施例1中缺失突变体AtYchF1和野生型Col-2拟南芥生长在含有百草枯培养基上的表型。

图2是本发明实施例2中缺失突变体AtYchF1和野生型Col-2拟南芥的半定量PCR试验结果。

图3是本发明实施例3中百草枯处理后缺失突变体AtYchF1的叶绿素含量与野生型Col-2拟南芥的叶绿素含量。

图4是本发明实施例4中不同植物YchF蛋白质氨基酸序列的比对，同源性>90％，其中水稻OsYchF1基因与拟南芥AtYchF1基因同源性≥96％。

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图详予说明。

请参照图1至图4，本发明提供一种利用拟南芥AtYchF1基因植物除草的方法，包括以下步骤：

步骤1：培育缺失AtYchF1同源基因的作物植物；

步骤2：在田间种植步骤1培育的缺失AtYchF1同源基因的作物植物；

步骤3：在田间施加作物植物耐受的、有效量的除草剂至杂草和作物植物以控制杂草。

从上述描述可知，本发明的有益效果在于：由于除草剂(百草枯)作用于植物线粒体，参与氧化还原调控，产生大量的活性氧自由基，而发明人通过一系列实验证明，拟南芥AtYchF1基因也参与植物内部的氧化还原调控，并在翻译水平参与了植物对于除草剂(百草枯)的抵抗，且由于YchF家族成员在不同物种间的蛋白质序列保守性极强(同源性>90％)，因此，针对AtYchF1基因的突变体，为培育新的耐除草剂(百草枯)的经济作物新品种提供了新的可能，进而达到利用除草剂(百草枯)清除杂草，但不伤害农作物的目的；本除草方法通过提高作物植物对除草剂的耐受性再利用除草剂除去植物作物附近杂草，既保持了化学除草的高效性，又有效避免了除草剂(百草枯)对作物的伤害，可操作性强，具有一定的推广性。

进一步的，所述除草剂为百草枯。

由上述描述可知，采用百草枯为除草剂除草效果更佳。

进一步的，得到所述AtYchF1同源基因的作物植物突变体的手段包括RNAi干扰及CRISPR-Cas6基因编辑技术。

本发明还提供拟南芥AtYchF1基因在植物除草方面的应用，所述AtYchF1基因在Genebank中的编号为AT1G30580；

所述AtYchF1基因与植物抵抗除草剂功能相关，在将AtYchF1基因缺失后，突变体植株对于除草剂的耐受性得到增强；

而在将AtYchF1基因过表达后，突变体植株对于除草剂的敏感度提升。

本发明的工作过程及原理为：G蛋白是一个重要的调控因子，广泛参与植物不同的信号传导通路。G蛋白分为三类：异三聚体G蛋白、小G蛋白及非传统G蛋白。与异三聚体G蛋白和小G蛋白一样，非传统G蛋白可以水解三磷酸鸟苷(GTP)为二磷酸鸟苷(GDP)，因此有两种存在形态，结合GTP的激活形态和结合GDP的非激活形态。水稻OsYchF1属于非传统G蛋白，为G蛋白TRAFAC超家族Obg家族YchF亚家族的一员。

非传统G蛋白OsYchF1由三个结构域构成，从N端到C端依次为，双螺旋结构域、G蛋白核心结构域和TGS(ThrRS，GTPase，SpoT)结构域。核心结构域又由五个保守的区域构成，G1，G2，G3，G4和G5。G1(GxxxxGK(S/T))区域通过形成氢键可以结合GTP或者腺苷三磷酸(ATP)的磷酸根；G2(x(T/S)x)和G3(hhhDxxG)区域可以结合一个镁离子，并且起到水解GTP为GDP的作用；G5((T/G)(C/S)A)区域协助了鸟嘌呤或者腺嘌呤基团的识别；TGS结构域的功能还不是很清楚，由于它富集碱性氨基酸，可能参与结合核糖体RNA；G4区域识别GTP的鸟嘌呤基团，决定了G蛋白结合GTP或者ATP。非传统G蛋白YchF亚家族成员的G4区域((N/T)(M/L)xE)区别于其它G蛋白G4区域((N/T)KxD)，这种G4区域的差异使OsYchF1既可以结合GTP，又可以结合ATP，而其它类型的G蛋白只能结合GTP或者ATP其中的一种。

目前的研究结果表明，非传统G蛋白YchF亚家族成员在非转录水平上参与了氧化还原调控，并且起到了负调控因子的作用。Osychf1人体同系物hola1突变体细胞系表现了对三丁基氢过氧化物和二酰胺引起的氧压的耐受性，并且在翻译水平参与了人体的氧化还原调控过程。最新的体外生化研究结果表明，大肠杆菌YchF蛋白质表面保守的半胱氨酸(Cys-35)参与了由氧化还原调控的蛋白质单体和同源二聚体的循环平衡，并且对其生理功能起到了关键性的调控作用。二聚体型态的大肠杆菌YchF失去了ATPase活性，而硫氧还蛋白可以与二聚体型态的大肠杆菌YchF相互作用，并且恢复了其ATPase活性。

水稻OsYchF1基因的前期研究结果表明，与野生型相比较，水稻OsYchF1基因的拟南芥过量表达转基因株系对病原体(Pseudomonas syringae pv.tomato strain DC3000(Pst DC3000))响应为敏感；同时，对150mM NaCl处理的响应也为敏感；与野生型(Col-2)相比较，申请人的研究发现AtYchF1的突变体表现了对除草剂(百草枯)引起的活性氧压的耐受性。现有证据表明，YchF家族成员作为负调控因子参与了生物体应对外界胁迫的调控过程，并且在应答胁迫的氧化还原过程中扮演重要角色。

本发明在对野生型(Col-2)、AT1G30580所代表基因AtYchF1功能缺失突变体atychf1植株在对除草剂的系列生理研究发现，AtYchF1基因在翻译水平参与了植物对于除草剂的抵抗。由于YchF家族成员在不同物种间的蛋白质序列保守性极强(同源性>90％)，针对AtYchF1基因的突变体，可为培育新的耐除草剂的经济作物新品种提供新的可能，从而达到应用除草剂清除杂草，但不伤害农作物的目的。

从上述描述可知，本发明的有益效果在于：由于除草剂(百草枯)作用于植物线粒体，参与氧化还原调控，产生大量的活性氧自由基，而发明人通过一系列实验证明，拟南芥AtYchF1基因也参与植物内部的氧化还原调控，并在翻译水平参与了植物对于除草剂(百草枯)的抵抗，且由于YchF家族成员在不同物种间的蛋白质序列保守性极强(同源性>90％)，因此，针对AtYchF1基因的突变体，为培育新的耐除草剂(百草枯)的经济作物新品种提供了新的可能，进而达到利用除草剂(百草枯)清除杂草，但不伤害农作物的目的；本除草方法通过提高作物植物对除草剂的耐受性再利用除草剂除去植物作物附近杂草，既保持了化学除草的高效性，又有效避免了除草剂(百草枯)对作物的伤害，可操作性强，具有一定的推广性。

进一步的，所述除草剂为百草枯。

进一步的，所述将AtYchF1基因缺失的手段包括RNAi干扰及CRISPR-Cas6基因编辑技术。

进一步的，所述RNAi干扰为将全长AtYchF1基因的sense和anti-sense链分别连接到RNAi载体中，运用花絮侵染法侵染拟南芥，筛选获得RNAi干扰株系。

进一步的所述RNAi载体为pKANNIBAL；

进一步的，所述RNAi干扰的具体操作包括以下步骤：

步骤1：植物培养；

植物培养包括打顶与浇水，所述打顶为从底部剪去第一个花序；打顶一周后，浸染前一天进行浇水；

其中最适宜的浸染时间为：主花序结荚，次花序约2-10cm长，有少量花开；

步骤2：农杆菌侵染；

所述农杆菌浸染所采用的农杆菌培养基包括以下原料制备而成：YEP(10g蛋白胨，5g酵母提取物，5g氯化钠)及50μg/mL抗生素(卡那霉素)；

农杆菌培养条件：在28度环境中，于250rpm转速下振荡培养；

a)接种并挑选单克隆接种于10ml YEP培养基中，在28～30度环境中，于250rpm转速下振荡培养过夜；

b)按比例1:100接种到200ml YEP，摇菌18-24小时，使得OD600为1.8-2.0；

c)配制新鲜侵染液：包括1/2MS，5.0％蔗糖；0.05％Silwet L-77(表面活性剂)，pH＝5.7；

d)5500rpm(转每分钟)离心沉淀，20min收集菌体，用侵染液重悬，使得OD600为0.8；

e)侵染，将植物上部分组织浸入侵染液3-5秒，并轻轻晃动；

f)套筒，保持湿度和避光，过夜；

g)第二日移入正常生长培养箱中，直到收种；

步骤3：筛选

a)种子消毒

i.75％乙醇浸泡，剧烈震动，2-3分钟，去离子水冲洗

ii.次氯酸钠浸泡，剧烈震动，3分钟，去离子冲洗五次

b)播种

i.播种于含抗性的1/2MS(Sigma#M-5519)，0.8％agar培养基上

进一步的，所述CRISPR-Cas6基因编辑技术为将选定的AtYchF1基因片段转入CRISPR-Cas6载体(bgk01)中，运用花絮侵染法侵染拟南芥。

实施例1

请参照图1，将在1/2MS培养基上萌发五天的缺失突变体AtYchF1和野生型Col-2拟南芥转到含有0.1mM百草枯的1/2MS培养基上继续生长五天，并观察其表型。

由图1可知，在含有百草枯的培养基上进行培养的缺失突变体AtYchF1明显比野生型Col-2拟南芥长得茂盛，表明缺失突变体AtYchF1对百草枯的耐受性远远高于野生型Col-2拟南芥，即缺失AtYchF1基因的拟南芥对百草枯的耐受性得到提高。

实施例2

请参照图2，运用半定量RT PCR技术，以缺失突变体AtYchF1和野生型Col-2拟南芥转的cDNA为模版，鉴定缺失突变体AtYchF1和野生型Col-2拟南芥AtYchF1基因RNA的转录情况。

由图2可知，RT-PCR结果显示，缺失突变体AtYchF1中没有AtYchF1基因RNA的转录，而野生型Col-2拟南芥有AtYchF1基因RNA的转录，即AtYchF1的突变体没有表达AtYchF1的mRNA。

实施例3

请参照图3，将在含有0.1mM百草枯的1/2MS培养基上生长五天的缺失突变体AtYchF1和野生型Col-2拟南芥叶片分别剪下，在4℃用0.8ml N,N-dimehylformamide(DMF)浸泡过夜，用紫外分光光度计测量叶绿素a，叶绿素b，叶绿素p的含量，并计算叶绿素的总含量(纵坐标为荧光强度)。

由图3可知，缺失突变体AtYchF1的叶绿素含量高于野生型Col-2拟南芥的叶绿素含量，表明AtYchF1突变体受百草枯引起的活性氧压的影响小于野生型Col-2拟南芥。

实施例4

一种利用拟南芥AtYchF1基因植物除草的方法，包括以下步骤：

步骤1：培育缺失AtYchF1同源基因的作物植物，如缺失水稻OsYchF1基因(同源性≥96％)的水稻突变体；

步骤2：在田间种植步骤1培育的缺失AtYchF1同源基因的作物植物，如在田间种植步骤1培育的水稻(缺失OsYchF1基因)突变体；

步骤3：在田间施加作物植物耐受的、有效量的除草剂至杂草和作物植物以控制杂草。

综上所述，本发明提供的拟南芥AtYchF1基因在植物除草方面的应用，由于除草剂(百草枯)作用于植物线粒体，参与氧化还原调控，产生大量的活性氧自由基，而发明人通过一系列实验证明，拟南芥AtYchF1基因也参与植物内部的氧化还原调控，并在翻译水平参与了植物对于除草剂(百草枯)的抵抗，且由于YchF家族成员在不同物种间的蛋白质序列保守性极强(同源性>90％)，因此，针对AtYchF1基因的突变体，为培育新的耐除草剂(百草枯)的经济作物新品种提供了新的可能，进而达到利用除草剂(百草枯)清除杂草，但不伤害农作物的目的；本除草方法通过提高作物植物对除草剂的耐受性再利用除草剂除去植物作物附近杂草，既保持了化学除草的高效性，又有效避免了除草剂(百草枯)对作物的伤害，可操作性强，具有一定的推广性。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建农林大学

<120> 利用拟南芥AtYchF1基因植物除草的方法及应用

<130> 2017

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1185

<212> DNA

<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana L.）

<400> 1

atgcctccga aagccaaagc taaagatgca ggtcccgtag agaggcctat tcttggccgt 60

ttctcttctc acctcaagat cggaattgtt gggttaccaa atgttggaaa atctactctt 120

ttcaacactc ttacaaagct ttcaattcca gctgagaatt tccccttttg taccattgag 180

cctaatgagg cacgtgtgaa tatccccgat gagaggttcg attggctttg ccaaacttac 240

aagcctaaga gtgagattcc agctttcttg gaaattcatg acattgctgg gcttgttaga 300

ggagctcatg aaggacaggg tcttggaaac aacttcttgt cccatattcg tgcagttgat 360

ggaattttcc atgttttacg tgcttttgaa gatgctgata ttatccatgt cgacgatatc 420

gtggatcctg ttagagattt ggagaccatt actgaagagt tgcggctaaa ggatattgaa 480

tttgttggaa agaagattga tgatgtcgag aagagcatga agaggagcaa tgacaagcag 540

ctgaaaatag aacttgagct cttgcaaaag gtaaaagctt ggctagaaga tggtaaggat 600

gtccgttttg gggactggaa aacagctgat atcgagattt tgaacacttt ccaattgctt 660

tctgcaaagc ccgttgttta cttgattaac ctgaatgaga gagactatca gaggaagaaa 720

aacaagttct tgccaaagat tcatgcctgg gttcaagaac acggtggtga tactatgatt 780

cctttcagtg gtgtgtttga aaggagtctc gctgatatgg ccccagatga agcagcaaag 840

tattgtgagg agaacaaact gcaaagtgct cttccgagga tcatcaaaac tggattttca 900

gcaattaacc tcatatactt ctttacagca gggcctgatg aggtgaagtg ctggcaaata 960

agacggcagt caaaggctcc tcaagctgca ggggccattc atactgattt tgagagagga 1020

tttatttgtg ctgaggtcat gaaattcgag gatctcaagg aacttggcaa tgaacctgca 1080

gtcaaggccg caggaaaata cagacaggag ggtaaaacat atgttgttca ggatggagat 1140

atcattttct tcaagttcaa tgtttccggt ggtgggaaga aatga 1185

<210> 2

<211> 394

<212> PRT

<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana L.）

<400> 2

Met Pro Pro Lys Ala Lys Ala Lys Asp Ala Gly Pro Val Glu Arg Pro

1 5 10 15

Ile Leu Gly Arg Phe Ser Ser His Leu Lys Ile Gly Ile Val Gly Leu

20 25 30

Pro Asn Val Gly Lys Ser Thr Leu Phe Asn Thr Leu Thr Lys Leu Ser

35 40 45

Ile Pro Ala Glu Asn Phe Pro Phe Cys Thr Ile Glu Pro Asn Glu Ala

50 55 60

Arg Val Asn Ile Pro Asp Glu Arg Phe Asp Trp Leu Cys Gln Thr Tyr

65 70 75 80

Lys Pro Lys Ser Glu Ile Pro Ala Phe Leu Glu Ile His Asp Ile Ala

85 90 95

Gly Leu Val Arg Gly Ala His Glu Gly Gln Gly Leu Gly Asn Asn Phe

100 105 110

Leu Ser His Ile Arg Ala Val Asp Gly Ile Phe His Val Leu Arg Ala

115 120 125

Phe Glu Asp Ala Asp Ile Ile His Val Asp Asp Ile Val Asp Pro Val

130 135 140

Arg Asp Leu Glu Thr Ile Thr Glu Glu Leu Arg Leu Lys Asp Ile Glu

145 150 155 160

Phe Val Gly Lys Lys Ile Asp Asp Val Glu Lys Ser Met Lys Arg Ser

165 170 175

Asn Asp Lys Gln Leu Lys Ile Glu Leu Glu Leu Leu Gln Lys Val Lys

180 185 190

Ala Trp Leu Glu Asp Gly Lys Asp Val Arg Phe Gly Asp Trp Lys Thr

195 200 205

Ala Asp Ile Glu Ile Leu Asn Thr Phe Gln Leu Leu Ser Ala Lys Pro

210 215 220

Val Val Tyr Leu Ile Asn Leu Asn Glu Arg Asp Tyr Gln Arg Lys Lys

225 230 235 240

Asn Lys Phe Leu Pro Lys Ile His Ala Trp Val Gln Glu His Gly Gly

245 250 255

Asp Thr Met Ile Pro Phe Ser Gly Val Phe Glu Arg Ser Leu Ala Asp

260 265 270

Met Ala Pro Asp Glu Ala Ala Lys Tyr Cys Glu Glu Asn Lys Leu Gln

275 280 285

Ser Ala Leu Pro Arg Ile Ile Lys Thr Gly Phe Ser Ala Ile Asn Leu

290 295 300

Ile Tyr Phe Phe Thr Ala Gly Pro Asp Glu Val Lys Cys Trp Gln Ile

305 310 315 320

Arg Arg Gln Ser Lys Ala Pro Gln Ala Ala Gly Ala Ile His Thr Asp

325 330 335

Phe Glu Arg Gly Phe Ile Cys Ala Glu Val Met Lys Phe Glu Asp Leu

340 345 350

Lys Glu Leu Gly Asn Glu Pro Ala Val Lys Ala Ala Gly Lys Tyr Arg

355 360 365

Gln Glu Gly Lys Thr Tyr Val Val Gln Asp Gly Asp Ile Ile Phe Phe

370 375 380

Lys Phe Asn Val Ser Gly Gly Gly Lys Lys

385 390