用于检测鲍类疱疹病毒的引物组以及探针序列的制作方法

本发明涉及引物及探针，具体涉及用于检测鲍类疱疹病毒的引物组及探针序列。

背景技术：

鲍疱疹病毒（abaloneherpes-likevirus，abhv）作为鲍低温病毒病的主要病原，造成了自1999年春季开始的中国南方鲍主养区养殖杂色鲍的恶性流行病，对我国杂色鲍养殖业造成了毁灭性的打击。该病传染性强，可感染各规格杂色鲍，但极少引起盘鲍等发病，具有种属特异性；该病来势凶猛，从症状出现到全池死亡通常只要3天时间。目前，针对该病毒病尚无有效的治疗方法，病毒的早期准确检测对疾病的预防和控制尤为重要，因此建立一种简便、快速、灵敏、准确的病毒检测方法对病毒病的防控具有重要意义。目前，常用的是以聚合酶链式反应（pcr）为代表的病原检测技术。但是此过程需要精密的仪器和专业的试验场地，耗时长，时效性低，不能满足水产养殖现场诊断的需求。重组酶聚合酶扩增（rpa）是近几年出现的一种可在室温下进行的核酸快速检测技术，无需温控设备，反应可在15分钟内迅速完成，具有和pcr一样的灵敏度和特异性，非常适宜水产病原的现场快速检测。rpa检测所用的引物组和探针是其核心组分，它们决定着rpa的检测效果。但rpa引物和探针的设计难度较大，没有类似pcr引物的专业设计软件，检测的灵敏度和特异性完全依赖于引物设计者的经验和大量的试验验证。有时从数十套候选引物探针组合中都难以筛选到1套可用的检测序列，因此引物设计是rpa检测方法成败的关键。

技术实现要素：

本发明的目的之一是提供一种用于检测鲍类疱疹病毒的引物组以及探针序列。

本发明的引物组和探针序列是根据病毒的orf38（genbankaccessionno.jx453331.1）基因序列进行设计的。

本发明提供的用于检测鲍类疱疹病毒的引物组以及探针序列，其中，所述的引物组为：

fp:ctttcttaccgctttcaatctgatccgtgg

rp:gaacaggggtaattgtatagcaactgcgta

探针序列：

gcgtacagtaaaacgaaaaccatggcaca（dt-fam）gc（thf）ca（dt-bhq1）tgaaaacatccaagc（c3spacer）。

本发明的目的之二是提供使用上述引物组和探针序列在制备用于rpa检测鲍类疱疹病毒的试剂的应用。

本发明的有益效果：

本发明提供一套用于鲍类疱疹病毒的荧光定量rpa（qrpa）检测引物和探针组，以它们为基础开发的荧光定量rpa检测方法具有灵敏度高、特异性强、反应迅速、仪器设备要求低等优点，非常适用于水产动物病原检测。abhv-qrpa检测体系的检测灵敏度与qpcr相似，但检测时间仅为20±0.50分钟，时间相比qpcr大大缩短；反应温度为恒温37℃，无需升降温系统，适于野外实地操作。

附图说明

图1是实施例一中扩增产物的电泳图。

图2是abhv-qrpa检测体系扩增曲线图；

不同的曲线代表10⁷〜10的不同浓度质粒拷贝数，每条扩增曲线是三次重复测量的平均值。

图3是abhv-qrpa检测体系的标准曲线；

体现了abhv-qrpa检测体系中不同浓度标准品达到荧光阈值对应的循环数。

图4是abhv-qrpa与abhv-qpcr检测结果的散点图；

体现了abhv-qrpa与abhv-qpcr检测结果之间的相关性。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细说明，但本发明的保护范围不限于以下的实施例。

实施例1引物组和探针的设计和特异性检测

根据病毒的orf38（genbankaccessionno.jx453331.1）基因序列设计引物组和探针，其中目标基因序列为：

tgaacaggggtaattgtatagcaactgcgtacagtaaaacgaaaaccatggcacatgccattgaaaacatccaagcaaacacccaaggcaagtttgttgttcctttatgcaaacagattctcaaaacgactaaagaaaccacggatcagattgaaagcggtaagaaaga。

fp:ctttcttaccgctttcaatctgatccgtgg

rp:gaacaggggtaattgtatagcaactgcgta

探针序列：

gcgtacagtaaaacgaaaaccatggcaca（dt-fam）gc（thf）ca（dt-bhq1）tgaaaacatccaagc（c3spacer）。

特异性检测：建立含有abhv的阳性对照、ddh2o的阴性对照、虾病毒（wssv）基因组dna对照、卵形鲳鲹基因组dna对照、东风螺基因组dna对照、牡蛎基因组dna对照、水体dna对照和嗜水气单胞菌基因组dna对照，以这些基因组dna作为模板，进行检测。

鲍疱疹病毒基因组dna，虾病毒（wssv）基因组dna、卵形鲳鲹基因组dna、东风螺基因组dna和牡蛎基因组dna提取使用海洋动物组织提取试剂盒（东盛，广东，中国），具体操作按照说明书上指示进行。

水体dna和嗜水气单胞菌基因组dna提取使用细菌dna提取试剂盒（magen，苏州，中国），具体操作按照说明书上指示进行。

反应体系：

rehydrationbuffer（twistdx试剂盒（tabas03kit））:14.8ul

rpafp（10μm）:1.2μl

rparp（10μm）:1.2μl

ddh2o:4.6μl

dna（50~500ng）:2μl

mgac（280nm）:1.2μl

反应条件：37℃孵育30分钟。

反应结束后，反应物通过琼脂糖凝胶电泳（1.5%的琼脂糖）的结果进行判断，结果显示，这些基因组dna和阴性对照均没有扩增信号，而阳性对照有明显的扩增信号（图1）。可见，本发明建立的引物组和探针特异性强。

实施例2灵敏度验证

标准曲线模板由上海英潍捷基公司合成。该模板是由目标基因片段和pmd18-tvector载体连接而成。载体序列已公开：http://wenku.baidu.com/view/385564bdf121dd36a32d8271.html。

采用绝对定量法进行检测：将构建的质粒标准品用tebuffer作10倍梯度稀释，构建不同浓度梯度10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²和10制作标准曲线，用ddh2o作为阴性对照，每个浓度重复三次。运用实时荧光定量pcr仪（eppendorf）进行rpa扩增反应。

反应体系：

rehydrationbuffer（twistdx试剂盒，taexo02kit）:14.7μl

rpafp（10μm）:1.1μl

rparp（10μm）:1.1μl

probe（10μm）:0.3μl

ddh2o:4.6μl

dna（50~500ng）:2μl

mgac（280nm）:1.2μl

反应条件：37℃孵育30分钟。

根据各个浓度扩增结果建立各个浓度的扩增曲线以及扩增效率，统计结果，建立标准曲线，结果参见图2和图3。从图2可见，该检测方法对abhv的检测限为100拷贝。

实施例3可行性验证

为了进一步确定本发明qrpa检测体系的可靠性，我们随机抽出50只杂色鲍，同时对其体内的abhv含量分别进行qrpa与qpcr检测。结果显示(参见图4)，两个诊断方法的检测结果呈现出较好的相关性（r²>0.8）

鲍肌肉组织dna提取使用海洋动物组织提取试剂盒，具体操作按照说明书指示进行。

qrpa检测方法、引物组和探针同实施例2。

qpcr检测方法采用的是已经报道的taqman^®pcr技术（corbeils,williamslmetal,.developmentandvalidationofataqman®pcrassayfortheaustralianabaloneherpes-likevirusserge.diseasesofaquaticorganisms.2010)，所用引物和探针序列分别为：

f：aacccacacccaatttttga

r：cccaaggcaagtttgttgtt

probe：6fam-ccgctttcaatctgatccgtgg-tamra。

本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。凡是依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何细微修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

序列表

<110>中国水产科学研究院南海水产研究所

<120>用于检测鲍类疱疹病毒的引物组以及探针序列

<160>7

<210>1

<211>30

<212>dna

<213>引物fp

<400>1

ctttcttaccgctttcaatctgatccgtgg30

<210>2

<211>30

<212>dna

<213>引物rp

<400>2

gaacaggggtaattgtatagcaactgcgta30

<210>3

<211>48

<212>dna

<213>探针序列

<400>3

gcgtacagtaaaacgaaaaccatggcaca（dt-fam）gc（thf）ca（dt-bhq1）tgaaaacatccaagc（c3spacer）48

<210>4

<211>169

<212>dna

<213>orf38

<400>4

tgaacaggggtaattgtatagcaactgcgtacagtaaaacgaaaaccatggcacatgcca60

ttgaaaacatccaagcaaacacccaaggcaagtttgttgttcctttatgcaaacagattc120

tcaaaacgactaaagaaaccacggatcagattgaaagcggtaagaaaga169

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>引物f

<400>5

aacccacacccaatttttga20

<210>6

<211>20

<212>dna

<213>引物r

<400>6

cccaaggcaagtttgttgtt20

<210>7

<211>22

<212>dna

<213>引物r

<400>7

6fam-ccgctttcaatctgatccgtgg-tamra22