利用逆流色谱从火龙果中快速分离多糖的方法与流程

本发明属于食品加工利用及功能性食品制造领域，主要应用色谱方法和化学方法从具有利用价值的或含有生物活性成分的生物材料中提取分离生物活性物质或功能性成分，为研究此成分的活性机理或开发新产品等提供技术支撑。

背景技术：

火龙果(Hylocereus undulates Britt)被誉为“仙人果”、“吉祥果”，是一种营养丰富，老少皆宜的水果，含有多糖、有机酸、膳食纤维及钾、钙、镁、磷等多种营养成分。据报道，火龙果多糖在促进肠道蠕动、预防便秘等方面具有很好的功能。

功能性多糖的提取分离是开发功能性食品的关键。目前现有的关于多糖的提取制备方法主要是采用凝胶柱色谱、膜分离、离子交换色谱等方法，其局限性是所使用的材料(填料或膜)价格贵、成本高、速度慢，并且每次分离的量有限。因此，现有的多糖分离技术难以满足火龙果多糖的分离的需要。

目前已有应用逆流色谱分离海带多糖、香菇多糖、螺旋藻多糖的报道，但根据报道的逆流色谱分离条件和方法不适用于分离火龙果多糖。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种无污染、快速高效、成本较低的从火龙果中提取制备多糖的方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种利用逆流色谱从火龙果中快速分离多糖的方法，包括以下步骤：

(1)将火龙果去皮后切片、冷冻干燥制成含水量≤0.05％的火龙果干片，将火龙果干片粉碎后沸水(100℃)浸提2～3h；

(2)将浸提液冷却至室温(10～30℃)后过滤，滤液依次进行浓缩、脱色素、脱蛋白，并再次进行浓缩，得浓缩液；

(3)在浓缩液中加入无水乙醇中进行沉淀，所得的沉淀物进行冷冻干燥，获得火龙果粗多糖；

(4)取0.25～0.35g火龙果粗多糖溶于25±5ml的双水相溶剂系统的下相中，并注入(缓慢注入)逆流色谱(例如选用HSCCC-1000型逆流色谱仪)；

所述双水相溶剂系统由以下质量含量的成分组成：4～6％聚乙二醇6000(PEG6000)、16～20％的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、7～9％的磷酸二氢钾(KH₂PO₄)、3～5％的硫酸钾(K₂SO₄)，以及作为余量的水；

双水相溶剂系统自然分层，从而形成双水相溶剂系统的上相、双水相溶剂系统的下相。

(5)、每500mL的双水相溶剂系统的上相中分别加入5.0mL 0.05M HCl溶液、5.0mL 0.15M HCl溶液、2.78mL 0.01M NaOH溶液，从而分别作为流动相Ⅰ、流动相Ⅱ、流动相Ⅲ；

分别取300±30mL的流动相Ⅰ、流动相Ⅱ、流动相Ⅲ依次进行洗脱，流动相Ⅰ、流动相Ⅱ、流动相Ⅲ的流速均为3.0±0.2mL/min；

收集每种流动相下相同比移值的洗脱液，将收集的3类洗脱液分别经浓缩、透析、冷冻干燥，从而分别获得3种火龙果多糖。

备注说明：

流动相Ⅰ下收集的相同比移值为0.28；即，收集23～45；

流动相Ⅱ下收集的相同比移值为0.57；即，收集53～77；

流动相Ⅲ下收集的相同比移值为0.85。即，收集111～138管。

冷冻干燥为于-60～-80℃，50～100Pa条件下冷冻干燥120～240min。

作为本发明的利用逆流色谱从火龙果中快速分离多糖的方法的改进：

所述步骤(1)中：粉碎至过200～300目筛，浸提时的液料质量比为35～50L/1kg(较佳为38～45L/1kg)；

浸提后所得的残渣重复上述沸水浸提2～3次，合并所有的浸提液。

作为本发明的利用逆流色谱从火龙果中快速分离多糖的方法的进一步改进：

所述步骤(2)为：将滤液先浓缩(用旋转蒸发仪浓缩，真空度0.05Mpa，温度32～35℃)至原体积的1/10～1/5(较佳为1/6～1/8)，然后加入占浓缩液0.002～0.003重量倍的活性碳均匀混合，静置3～5h吸附色素，过滤，所得的滤液Ⅱ中加入占滤液Ⅱ0.01倍体积的三氯乙酸进行混合、震荡5～10分钟(目的是使蛋白变性析出脱除蛋白)，离心(3000～3500×g)，所得的上清液浓缩(用旋转蒸发仪浓缩)至为原体积的1/5～1/3；得浓缩液。

作为本发明的利用逆流色谱从火龙果中快速分离多糖的方法的进一步改进：

所述步骤(3)为：在浓缩液中加入2～5体积(较佳为3～5体积倍)的无水乙醇震荡3～5分钟，然后于4±1℃醇析24±2h(使火龙果多糖充分析出)，离心(2000～3000×g离心3～5分钟)，所得的沉淀物冷冻干燥(-50～-80℃干燥2～8h)，得火龙果粗多糖。

作为本发明的利用逆流色谱从火龙果中快速分离多糖的方法的进一步改进：

所述双水相溶剂系统由以下质量含量的成分组成：5％聚乙二醇6000(PEG6000)、18％的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、8％的磷酸二氢钾(KH₂PO₄)、4％的硫酸钾(K₂SO₄)，65％水。

即，PEG6000:PVP:KH₂PO₄:K₂SO₄:H₂O＝0.5:1.8:0.8:0.4:6.5。

作为本发明的利用逆流色谱从火龙果中快速分离多糖的方法的进一步改进，所述步骤(5)中：

用薄层层析法进行检测，收集每种流动相下相同比移值的洗脱液；

浓缩至原体积的1/4～1/6；

所述透析为经8000～14000Da透析膜透析。

作为本发明的利用逆流色谱从火龙果中快速分离多糖的方法的进一步改进，步骤(1)的切片为：将果肉切片至厚度3～5mm，冷冻干燥为：于-50～-55℃的温度、50～100Pa的真空度进行干燥至水分含量≤0.05％(干燥时间约为24h)。

本发明采用热水(100℃)浸提植物中醇沉的多糖成分，得到多糖提取液和蛋白的混合液；经脱蛋白、色素，冻干，获得多糖粗品；再采用逆流色谱方法进行分离；以双水相溶剂系统的下相作为固定相；以双水相分离系统的上相作为流动相。

在本发明中，将得到的火龙果多糖用高效液相色谱进行检测分析，色谱条件为ELSD 2000蒸发光检测器，TSK-GEL3000PW_XL液相色谱柱，用H₂O为流动相，流速0.65mL/min。对所收集的样品进行分析检测，含量(纯度)≥97％。

本发明具有如下技术优势：本发明与传统的膜分离、凝胶柱分离、离子交换分离方法相比，具有分离速度快、成本低、进样量大的特点，本发明建立了火龙果多糖分离的逆流色谱双水相系统和pH梯度分离方法，使逆流色谱能应用于火龙果多糖的分离，扩大了逆流色谱分离多糖的应用范围，本发明所得的火龙果多糖具有显著的润肠通便作用。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为本发明的工艺流程图。

图2为实施例1的HSCCC分离图谱。

图3为实施例1分离所得的火龙果多糖HPLC图谱。

图4为实施例2的HSCCC分离图谱。

图5为实施例3的HSCCC分离图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1、一种从火龙果中分离制备多糖的方法(利用逆流色谱从火龙果中快速分离多糖的方法)，依次进行以下步骤：

(1)将火龙果去皮取果肉，将果肉切片至厚度3～5mm，于-50～-55℃的温度、50～100Pa的真空度下进行冷冻干燥，直至制成含水量≤0.05％的火龙果干片(干燥时间约为24h)。

将200g火龙果干片放入搅碎机中粉碎至过200～300目筛，得到火龙果干粉，加入至盛有8.0L蒸馏水的大烧杯内，加热至沸腾，保持100℃，蒸煮浸提3h；

以浸提后所得的残渣替代火龙果干片重复上述沸水浸提2次，合并所有的浸提液。

(2)合并后的浸提液冷却至室温后过滤，滤液依次进行浓缩、脱色素、脱蛋白，并再次进行浓缩，得浓缩液；

具体如下：

将滤液浓缩(用旋转蒸发仪浓缩，真空度0.05Mpa，温度32～35℃)至原体积的1/6，加入占浓缩液0.002重量倍的活性碳混合搅拌5min，静置3h吸附色素，过滤，所得的滤液Ⅱ中加入占滤液Ⅱ0.01倍体积的三氯乙酸进行混合、震荡5～10分钟(目的是使蛋白变性析出脱除蛋白)，离心(3000～3500×g)，所得的上清液浓缩(用旋转蒸发仪浓缩，温度42℃，真空度100Pa，)至为原体积的1/3；得浓缩液。

(3)在浓缩液中加入3体积倍的无水乙醇震荡3～5分钟，然后于4±1℃醇析24h(使火龙果多糖充分析出)，2000～3000×g离心3～5分钟，所得的沉淀物于-80℃，100Pa条件下冷冻干燥120min，获得火龙果粗多糖4.51g。

(4)将PEG6000–PVP–KH₂PO₄–K₂SO₄–H₂O按照0.5:1.8:0.8:0.4:6.5(w/w)混合，作为双水相溶剂系统。

双水相溶剂系统自然分层，从而形成双水相溶剂系统的上相、双水相溶剂系统的下相。

取0.35g火龙果粗多糖溶于25ml双水相溶剂系统的下相中，可采用超声波仪中辅助溶解10min。启动逆流色谱仪(HSCCC-1000型逆流色谱仪)，转速800rpm，速度稳定后用蠕动泵缓慢注入逆流色谱仪中进行分离。

(5)、每500mL的双水相溶剂系统的上相中分别加入5.0mL 0.05M HCl溶液、5.0mL 0.15M HCl溶液、2.78mL 0.01M NaOH溶液，从而分别作为流动相Ⅰ(pH值为6.25)、流动相Ⅱ(pH值为4.70)、流动相Ⅲ(pH值为7.90)；

分别取300mL的流动相Ⅰ、流动相Ⅱ、流动相Ⅲ依次进行洗脱，流动相Ⅰ、流动相Ⅱ、流动相Ⅲ的流速均为3.0mL/min，每2min收集1管，共收集150管。

流出液用薄层层析法进行检测，收集每种流动相下相同比移值的洗脱液，即，收集第24～45管(比移值为0.28)、收集58～77管(比移值为0.57)、收集119～138管(比移值为0.85)；

备注：每2min收集一管；

将收集的3类洗脱液分别浓缩至原体积的1/5，8000～14000Da透析膜透析12h，冷冻干燥(-80℃，100Pa条件下冷冻干燥120min)，分别对应得到3种火龙果均一多糖----0.1033g多糖Ⅰ、0.0847g多糖Ⅱ、0.0763g多糖Ⅲ，即收率分别为29.51％、24.20％、21.80％。收率根据苯酚-硫酸法进行检测，其含量均能达到97％以上。

实施例2、一种从火龙果中分离制备多糖的方法，依次进行以下步骤：

(1)、火龙果干片的制备方法同实施例1。

将180g火龙果干片放入搅碎机中粉碎至过200～300目筛，得到火龙果干粉，加入至盛有7.0L蒸馏水的大烧杯内，加热至沸腾，保持100℃，蒸煮浸提2.5h；

以浸提后所得的残渣替代火龙果干片重复上述沸水浸提2次，合并所有的浸提液。

(2)合并后的浸提液冷却至室温后过滤，滤液依次进行浓缩、脱色素、脱蛋白，并再次进行浓缩，得浓缩液；

具体如下：

将滤液浓缩(用旋转蒸发仪浓缩，真空度0.05Mpa，温度32～35℃)至原体积的1/7，加入占浓缩液0.002重量倍的活性碳混合搅拌5min，静置3h吸附色素，过滤，所得的滤液Ⅱ中加入占滤液Ⅱ0.01倍体积的三氯乙酸进行混合、震荡5～10分钟(目的是使蛋白变性析出脱除蛋白)，离心(3000～3500×g)，所得的上清液浓缩(用旋转蒸发仪浓缩，温度42℃，真空度100Pa)至为原体积的1/3；得浓缩液。

(3)在浓缩液中加入3体积倍的无水乙醇震荡3～5分钟，然后于4±1℃醇析24h(使火龙果多糖充分析出)，2000～3000×g离心3～5分钟，所得的沉淀物于-80℃，100Pa条件下冷冻干燥120min，获得火龙果粗多糖3.97g。

(4)～(5)、

取0.25g火龙果粗多糖溶于30ml双水相溶剂系统的下相中，流出液用薄层层析法进行检测，收集相同比移值的第23～41、53～72、111～131管，其余等同于实施例1的步骤(4)～(5)；

得到3种火龙果均一多糖----多糖Ⅰ、多糖Ⅱ、多糖Ⅲ，分别为0.0743g、0.0607g、0.0550g(即收率分别为29.72％、24.28％、22.00％)，含量均达到97％以上。

实施例3、一种从火龙果中分离制备多糖的方法，依次进行以下步骤：

(1)、火龙果干片的制备方法同实施例1。

将180g火龙果干片放入搅碎机中粉碎至过200～300目筛，得到火龙果干粉，加入至盛有8.0L蒸馏水的大烧杯内，加热至沸腾，保持100℃，蒸煮浸提3h；

以浸提后所得的残渣替代火龙果干片重复上述沸水浸提2次，合并所有的浸提液。

(2)合并后的浸提液冷却至室温后过滤，滤液依次进行浓缩、脱色素、脱蛋白，并再次进行浓缩，得浓缩液；

具体如下：

将滤液浓缩(用旋转蒸发仪浓缩，真空度0.05Mpa，温度32～35℃)至原体积的1/8，加入占浓缩液0.002重量倍的活性碳混合搅拌5min，静置3h吸附色素，过滤，所得的滤液Ⅱ中加入占滤液Ⅱ0.01倍体积的三氯乙酸进行混合、震荡5～10分钟(目的是使蛋白变性析出脱除蛋白)，离心(3000～3500×g)，所得的上清液浓缩(用旋转蒸发仪浓缩，温度42℃，真空度50Pa，)至为原体积的1/5。

(3)在浓缩液中加入5体积倍的无水乙醇震荡3～5分钟，然后于4±1℃醇析24h(使火龙果多糖充分析出)，2000～3000×g离心3～5分钟，所得的沉淀物于-80℃，100Pa条件下冷冻干燥120min，获得火龙果粗多糖4.09g。

(4)～(5)、

取0.30g火龙果粗多糖溶于25mL双水相溶剂系统的下相中，将流出液用薄层层析法进行检测，收集相同比移值的第23～44、57～75、116～137管，其余等同于实施例1的步骤(4)～(5)；

得到3种火龙果均一多糖----多糖Ⅰ、多糖Ⅱ、多糖Ⅲ，分别为0.0886g、0.0730g、0.0647g(即，收率分别为29.53％、24.33％、21.57％)，含量均达到98％以上。

性能实验：

为了检验火龙果多糖的通便作用，设计了3种火龙果多糖(多糖Ⅰ、多糖Ⅱ、多糖Ⅲ)分别为对便秘模型小鼠通便作用的实验。将雄性昆明小鼠随机分为空白组、阳性对照组和3个火龙果多糖给药组、黑木耳多糖给药组，每组12只。给药组经口分别给予0.50g/kg bw的火龙果多糖I、II、III、黑木耳多糖；空白组和模型组给予20mL/kg bw的蒸馏水；阳性对照组给予0.50g/kg bw的麻仁丸。连续灌胃8d后，观察各组小鼠的首次排黑便时间、5h内排便粒数和测定粪便含水量。所得结果具体如下：

3种火龙果多糖对小鼠排便指标的影响

结果表明火龙果多糖能显著缩短首次排黑便时间、增加5h内排便粒数和提高粪便含水量，3种火龙果多糖具有显著的润肠通便作用，多糖II效果最佳。

对比例1-1、将实施例1中的双水相溶剂系统改成PEG6000–KH₂PO₄–K₂SO₄–H₂O(2.3:0.8:0.4:6.5，w/w)；其余等同于实施例1，则所配溶剂由于不能形成上下两相，不能作为逆流色谱的溶剂系统，所以不适用于分离火龙果多糖。

对比例1-2、将实施例1中的双水相溶剂系统改成PEG6000–PVP–KH₂PO₄–K₂SO₄–H₂O(0.8:1.5:0.8:0.4:6.5，w/w)；其余等同于实施例1，产生的流动相对火龙果多糖的溶解度不够，不能有效分离火龙果多糖。

对比例1-3、将实施例1中的双水相溶剂系统改成PEG6000–PVP–KH₂PO₄–K₂SO₄–H₂O(0.2:2.1:0.8:0.4:6.5，w/w)，其余等同于实施例1，则所配溶剂由于不能形成上下两相，不能作为逆流色谱的溶剂系统，所以不适用于分离火龙果多糖。

对比例2-1、将实施例1作如下更改：

每500mL上相中分别加入2.5mL 0.05M HCl溶液、2.5mL 0.15M HCl溶液、1.39mL 0.01M NaOH溶液，从而分别作为流动相Ⅰ(pH值为6.55)、流动相Ⅱ(pH值为5.70)、流动相Ⅲ(pH值为7.30)；其余等同于实施例1。所得结果表明：此时流动相不能有效分离3种火龙果多糖，收集得到的3种多糖依然是混合物。

对比例2-2、将实施例1作如下更改：

每500mL上相中分别加入10mL 0.05M HCl溶液、10mL 0.15M HCl溶液、5.56mL 0.01M NaOH溶液，从而分别作为流动相Ⅰ(pH值为5.25)、流动相Ⅱ(pH值为3.60)、流动相Ⅲ(pH值为9.15)；其余等同于实施例1。

所得结果表明只有多糖I能够少许分离，得率3.61％，其余2种多糖无法实现分离。

对比例3-1、将实施例1中的双水相溶剂系统改成已有报道的PEG6000-(NH₄)₂SO₄-H₂O(2.0:0.8:7.2，w/w)，其余等同于实施例1，结果表明此双水相系统不能使火龙果多糖实现分离。

对比例3-2、将实施例1中的双水相溶剂系统改成已有报道的PEG1000–K₂HPO₄–KH₂PO₄–H₂O(0.5:1.25:1.25:7.0,w/w)，其余等同于实施例1，结果表明此双水相系统不能使火龙果多糖实现分离。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。