本发明涉及一种生物富硒酵母，尤其涉及的是一种富硒酵母、制备方法及应用。
背景技术：
硒是生物体生命活动所必需的微量元素之一，具有增强机体免疫力、抗氧化和抗衰老等诸多功能。同时，硒也是人和动物体内谷胱甘肽过氧化物酶的辅助因子，具有清除对机体有害的自由基，防止细胞膜氧化受损的作用。相反，缺硒则可能导致癌症、心肌梗塞等多种疾病发生。因此，通过膳食摄取足够的硒，尤其是有机硒，对于预防疾病，维持机体健康有着重要的作用。
生物富硒是获取有机硒的有效途径。目前，生物富硒的方法主要为微生物转化法。用于富硒的微生物有食用菌类、酵母类和细菌等，其中酵母是目前公认的最理想的富硒载体。酵母具有较高的富硒能力，在酵母生长过程中，将无机硒吸收，并将毒性较高的无机硒转化为安全的有机硒，纳入菌体，成为其蛋白质的一部分，主要以含硫氨基酸的类似物(蛋氨酸硒或胱氨酸硒)成为蛋白质的结构组成部分。
啤酒酵母具有生长繁殖快，发酵周期短，对微量元素吸收率高等特点，目前文献报道的富硒酵母生产方法，也大都集中在酿酒酵母上。将普通的酿酒酵母在添加适量的亚硒酸钠的发酵液培养基中，于一定的培养条件下培养，最终获得富硒酵母，进一步开发成富硒产品。而对于其他酵母菌株的富硒能力，目前研究开发得较少，一方面导致各家公司的富硒产品同质化严重，另一方面也极大的限制了其他酵母菌株在富硒产品生产中的应用。因此，开发利用酿酒酵母之外的富硒酵母菌株，生产营养成分多元化、更具特色的富硒产品，对于提升产品竞争力，加快富硒特色产业发展，具有重要意义。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种富硒酵母、制备方法及应用，制得富硒酵母中的硒含量高达3000ppm以上。
本发明是通过以下技术方案实现的：本发明的一种富硒酵母的制备方法，包括以下步骤：
(1)富硒菌株选育
将乙醇假丝酵母Candida ethanolica进行氮离子注入诱变，经过多次诱变筛选，获得耐受高浓度亚硒酸钠的乙醇假丝酵母突变菌株，命名为C.ethanolica cas8；
(2)种子培养液制备
将乙醇假丝酵母突变菌株C.ethanolica cas8接种在斜面培养基得到斜面菌株，再将斜面菌株接种于种子培养基中，得到种子培养液；
(3)发酵培养
将种子培养液按体积百分含量8～12％的接种量接种至含有发酵培养基中，发酵10～12h至对数生长期，在发酵产物中补加终浓度为150～200mg/L的亚硒酸钠，继续发酵培养20～24h，收集发酵产物；
(4)发酵产物收集
将发酵液，离心洗涤，干燥后制得淡黄色粉末状产品，产品水分小于8％。
所述步骤(1)包括以下步骤：
(11)乙醇假丝酵母C.ethanolica采用YEPD培养平板上培养24～36h，挑取单菌落至含YEPD液体培养基的培养瓶中，160～180rpm，震荡培养20～24h，菌液离心洗涤，制成单细胞悬液，使细胞浓度在108～109个/mL；
(12)将菌悬液均匀涂布到无菌培养皿中，风干制成菌膜；
(13)在N+注入机中进行离子注入，能量14～18KeV；
(14)每个菌株做6个梯度剂量，每个剂量两个平板，N+注入剂量分别为2.0×1014、4.0×1014、6.0×1014、8.0×1014、1.0×1015、1.2×1015ion/cm2，并做真空对照平板；
(15)诱变完成后，加入无菌水洗涤菌体制成菌悬液；
(16)将菌悬液稀释104～108倍涂布于含亚硒酸钠的筛选培养基，经过多次诱变筛选，获得耐受高浓度亚硒酸钠的酵母突变菌株，而且其发酵生物量在同等条件下比出发菌株提高，命名为C.ethanolica cas8。
所述步骤(2)中，将乙醇假丝酵母C.ethanolica cas8接种在斜面培养基25～30℃培养16～24h，得到斜面菌株，再将所述斜面菌株接种于种子培养基中，25～30℃、160～180r/min、振荡培养16～24h，得到种子培养液。
所述步骤(2)中，斜面培养基包括以下组分：葡萄糖15～20g/L,蛋白胨15～20g/L,酵母膏5～10g/L,亚硒酸钠20～30mg/L，琼脂12～18g/L。
所述步骤(2)中，种子培养基包括以下组分：麦芽抽提物10～20g/L，蛋白胨10～15g/L，酵母膏5～10g/L，亚硒酸钠30～60mg/L。
所述步骤(3)中，发酵培养基包括以下组分：可发酵还原糖200～300g/L，硫酸铜0.025～0.04g/L，硫酸锰0.02～0.03g/L，硫酸亚铁0.25～0.35g/L，硫酸镁4.5～6.0g/L，硫酸锌1.5～2.5g/L，氯化钙2.5～4.5g/L，硫酸铵4～6g/L，氯化钠7.5～10g/L，谷氨酸6～10g/L，L-半胱氨酸为10～12g/L，其余部分用蒸馏水补足至1L。
所述步骤(3)中，发酵条件为：25～30℃，溶氧为50～70％，pH为5.5～6.0。
一种使用所述的富硒酵母的制备方法制得的富硒酵母。
所述富硒酵母生物量达10～15g/L，得到的每kg富硒酵母产品中有机硒含量为4000～5000mg，其中硒蛋氨酸含量大于60％，无机硒含量不超过总硒含量2％。
一种富硒酵母在食品、保健品或饲料添加剂中的应用。
本发明相比现有技术具有以下优点：本发明采用的富硒酵母C.ethanolica cas8发酵得到的产品生物量高，且酵母细胞有机硒含量高，每kg富硒酵母干粉产品中，有机硒含量可达4000～5000mg，硒转化率高达95～99％。同时，通过本发明的制备方法所得到的富硒酵母产品中，含有大量的氨基酸及小肽，极易被动物所消化吸收，酵母中的有机硒可随着氨基酸及小肽的吸收而被生物体充分吸收，大大提高了有机硒的消化利用率。用于医药、食品、饲料等领域时，同等添加量情况下比同类产品有明显的生产性能方面的优势，或达到同等的生产性能情况下可以减少添加量，降低成本。此外，本发明中制得的富硒酵母产品中硒蛋氨酸含量可占有机硒总量的65～70％，高硒蛋氨酸含量也是本发明的一大特点。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
本实施例的富硒酵母制备方法如下：
(1)富硒菌株选育
乙醇假丝酵母C.ethanolica采用YEPD培养平板上培养24～36h，挑取单菌落至含100ml YEPD液体培养基的250ml三角瓶中，160～180rpm，震荡培养20～24h，菌液离心洗涤3次，制成单细胞悬液，使细胞浓度在108～109个/mL。取0.1mL菌悬液均匀涂布到无菌培养皿中,置于超净工作台风干制成菌膜。在N+注入机中进行离子注入,能量15KeV。每个菌株做6个梯度剂量，每个剂量两个平板。N+注入剂量分别为2.0×1014、4.0×1014、6.0×1014、8.0×1014、1.0×1015、1.2×1015ion/cm2，并做真空对照平板。诱变完成后，加入1ml无菌水洗涤菌体制成菌悬液。将菌悬液稀释104倍涂布于含亚硒酸钠的筛选培养基，采用3,3'-二氨基联苯胺盐酸盐法测定酵母菌株硒的含量。经过多次诱变筛选，获得耐受高浓度亚硒酸钠(200mg/L)的酵母突变菌株，而且其发酵生物量在同等条件下较出发菌株提高了近一倍，命名为C.ethanolica cas8。
(2)种子培养液制备
将上述乙醇假丝酵母C.ethanolica cas8接种在斜面培养基28℃培养16h，得到斜面菌株，斜面培养基成分组成为：葡萄糖15g/L,蛋白胨15/L,酵母膏5g/L,亚硒酸钠20mg/L，琼脂12g/L。
将上述斜面菌株接种于80mL的种子培养基中，28℃、160r/min、振荡培养16h，得到种子培养液。种子培养基成分组成为：麦芽抽提物10g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，亚硒酸钠30mg/L。
(3)发酵培养
发酵培养基成分组成为：可发酵还原糖200g/L，硫酸铜0.025g/L，硫酸锰0.02g/L，硫酸亚铁0.25g/L，硫酸镁4.5g/L，硫酸锌1.5g/L，氯化钙2.5g/L，硫酸铵4g/L，氯化钠7.5g/L，谷氨酸6g/L，L-半胱氨酸为10g/L，其余部分用蒸馏水补足至1L。
将种子培养液按8％(体积百分含量)的接种量接种至含有发酵培养基的50L发酵罐中(装液量为45％)，28℃，溶氧控制50～60％，pH维持5.5，发酵10h至对数生长期，在发酵产物中补加终浓度为150mg/L的亚硒酸钠，继续发酵培养20h，收集发酵产物。
(4)发酵产物收集及富硒能力检测
收集经过上述步骤制得的发酵液，离心机离心，洗涤，160℃喷雾干燥，制得淡黄色粉末状产品，产品水分小于7％。
采用常规检测方法，检测发现所得发酵液中富硒酵母生物量可达12g/L，得到的每kg富硒酵母产品中有机硒含量为4000mg，其中硒蛋氨酸含量大于65％，无机硒含量不超过总硒含量2％。
实施例2
本实施例的富硒酵母制备方法如下：
(1)富硒菌株选育
富硒菌株选育的过程和实施例1相同。
(2)种子培养液制备
将乙醇假丝酵母C.ethanolica cas8接种在斜面培养基28℃培养20h，得到斜面菌株，斜面培养基成分组成为：葡萄糖18g/L,蛋白胨17g/L,酵母膏7g/L,亚硒酸钠25mg/L，琼脂14g/L。
将上述斜面菌株接种于80mL的种子培养基中，28℃、170r/min、振荡培养20h，得到种子培养液。种子培养基成分组成为：麦芽抽提物18g/L，蛋白胨13g/L，酵母膏7g/L，亚硒酸钠45mg/L。
(3)发酵培养
发酵培养基成分组成为：可发酵还原糖250g/L，硫酸铜0.035g/L，硫酸锰0.025g/L，硫酸亚铁0.31g/L，硫酸镁5.2g/L，硫酸锌2.1g/L，氯化钙3.5g/L，硫酸铵4.8g/L，氯化钠8.5g/L，谷氨酸8g/L，L-半胱氨酸为11g/L，其余部分用蒸馏水补足至1L。
将种子培养液按10％(体积百分含量)的接种量接种至含有发酵培养基的50L发酵罐中(装液量为45％)，28℃，溶氧控制60～70％，pH维持5.5～6.0，发酵10h至对数生长期，在发酵产物中补加终浓度为180mg/L的亚硒酸钠，继续发酵培养22h，收集发酵产物。
(4)发酵产物收集及富硒能力检测
收集经过上述步骤制得的发酵液，离心机离心，洗涤，160℃喷雾干燥，制得淡黄色粉末状产品，产品水分小于7％。
采用常规检测方法，检测发现所得发酵液中富硒酵母生物量可达15g/L，得到的每kg富硒酵母产品中有机硒含量为5000mg，其中硒蛋氨酸含量大于65％，无机硒含量不超过总硒含量2％。
实施例3
本实施例的富硒酵母制备方法如下：
(1)富硒菌株选育
富硒菌株选育的过程和实施例1相同。
(2)种子培养液制备
将上述乙醇假丝酵母C.ethanolica cas8接种在斜面培养基28℃培养24h，得到斜面菌株，斜面培养基成分组成为：葡萄糖20g/L,蛋白胨20g/L,酵母膏10g/L,亚硒酸钠30mg/L，琼脂18g/L。
将上述斜面菌株接种于80mL的种子培养基中，28℃、180r/min、振荡培养24h，得到种子培养液。种子培养基成分组成为：麦芽抽提物20g/L，蛋白胨15g/L，酵母膏10g/L，亚硒酸钠60mg/L。
(3)发酵培养
发酵培养基成分组成为：可发酵还原糖300g/L，硫酸铜0.04g/L，硫酸锰0.03g/L，硫酸亚铁0.35g/L，硫酸镁6.0g/L，硫酸锌2.5g/L，氯化钙4.5g/L，硫酸铵6g/L，氯化钠10g/L，谷氨酸10g/L，L-半胱氨酸为12g/L，其余部分用蒸馏水补足至1L。
将种子培养液按12％(体积百分含量)的接种量接种至含有发酵培养基的50L发酵罐中(装液量为45％)，28℃，溶氧控制60～70％，pH维持5.5～6.0，发酵12h至对数生长期，在发酵产物中补加终浓度为200mg/L的亚硒酸钠，继续发酵培养24h，收集发酵产物。
(4)发酵产物收集及富硒能力检测
收集经过上述步骤制得的发酵液，离心机离心，洗涤，160℃喷雾干燥，制得淡黄色粉末状产品，产品水分小于7％。
采用常规检测方法，检测发现所得发酵液中富硒酵母生物量可达14.1g/L，得到的每kg富硒酵母产品中有机硒含量为4610mg，其中硒蛋氨酸含量大于65％，无机硒含量不超过总硒含量2％。
将实施例1～3制得的富硒酵母，应用于医药、食品、饲料中，能够易于消化吸收，提高了有机硒的消化利用率。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。