本发明涉及分子标记技术领域，具体来说是一种用于达氏鲟家系鉴定的微卫星标记引物及其鉴定方法。
背景技术：
达氏鲟又称长江鲟、沙腊子，是我国特有物种，主要分布于长江干流及金沙江下游，以四川宜宾-合江段产量较高。近20年来，由于葛洲坝工程的兴建以及水体污染、过度捕捞等原因，达氏鲟的野生资源量已经极其稀少，1988年被列为国家一级重点保护动物和长江上游一级急切保护鱼类。通过对达氏鲟野生资源驯化培育，达到性成熟后进行人工繁殖来是保护该物种的重要手段。达氏鲟繁殖时采用“一雌配多雄”的方法，能够显著提高人工受精率，进而提高繁殖率。然而“一雌配多雄”的配种方式及子代混养带来了亲子关系不明，系谱结构不清等问题，难以实现达氏鲟的科学选育。而按照传统的方法获取准确的系谱结构信息，需要将每一个家系单独饲养，或者使用物理标记，如荧光标记和电子标记。但采用单个家系单独养殖的方式不仅占用空间大，劳动强度高，养殖设备费用高，更重要的是不同的环境效应会影响不同家系的生长性状；而通过传统的物理标记存在操作繁琐、费用昂贵、对鱼体有伤害、标志容易脱落等缺点，不能区分单个个体。利用传统的方法获得可靠的亲缘关系及系谱结构信息非常困难。
微卫星标记(ssrs：simplesequencerepeats)或短串联重复(shorttandemrepeats，strs)，是一种广泛应用的遗传学领域的dna分子标记。ssr与其它遗传标记相比较，具有位点众多，多态性程度高，检测时对dna模板要求程度低，检测简单快速的优点，是一个良好的遗传标记。微卫星dna的高突变性、共显性表达及其在真核生物基因组中的普遍性，使其成为群体遗传多样性的分析、亲缘关系的鉴定、基因组作图和遗传育种的优越的分子标记，与等位酶、rapd方法相比也有一定的优越性。以微卫星分型为基础的亲子鉴定技术是目前水产动物系谱确认中应用最广泛最可靠的手段之一。已应用到中华鲟、扇贝、罗非鱼、泥鳅、黄颡鱼等水产经济动物育种中。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种用于达氏鲟家系鉴定的微卫星标记引物及其利用该引物鉴定达氏鲟家系的方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种用于达氏鲟家系鉴定的微卫星标记引物，所述微卫星引物共有18个引物对，分别为adx21、adx29、adx33、adx80、adx38、adx40、adx42、adx52、adx55、adx58、adx59、adx60、adx61、adx66、adx70、adx72、adx74和adx75，其中：
引物对adx21的核苷酸序列如seqidno.1和seqidno.2中所示；
引物对adx29的核苷酸序列如seqidno.3和seqidno.4中所示；
引物对adx33的核苷酸序列如seqidno.5和seqidno.6中所示；
引物对adx80的核苷酸序列如seqidno.7和seqidno.8中所示；
引物对adx38的核苷酸序列如seqidno.9和seqidno.10中所示；
引物对adx40的核苷酸序列如seqidno.11和seqidno.12中所示；
引物对adx42的核苷酸序列如seqidno.13和seqidno.14中所示；
引物对adx52的核苷酸序列如seqidno.15和seqidno.16中所示；
引物对adx55的核苷酸序列如seqidno.17和seqidno.18中所示；
引物对adx58的核苷酸序列如seqidno.19和seqidno.20中所示；
引物对adx59的核苷酸序列如seqidno.21和seqidno.22中所示；
引物对adx60的核苷酸序列如seqidno.23和seqidno.24中所示；
引物对adx61的核苷酸序列如seqidno.25和seqidno.26中所示；
引物对adx66的核苷酸序列如seqidno.27和seqidno.28中所示；
引物对adx70的核苷酸序列如seqidno.29和seqidno.30中所示；
引物对adx72的核苷酸序列如seqidno.31和seqidno.32中所示；
引物对adx74的核苷酸序列如seqidno.33和seqidno.34中所示；
引物对adx75的核苷酸序列如seqidno.35和seqidno.36中所示。
本发明还提供一种利用上述的微卫星标记引物鉴定达氏鲟家系的方法，步骤包括：
(1)达氏鲟亲本及子代dna提取：分别选取43尾f1代达氏鲟及67尾f2代达氏鲟作为鉴定的亲本及子代，同时选取全同胞家系繁殖的20尾已知父母本的f2代达氏鲟作为本次鉴定的阳性对照，选取亲本及子代肌肉组织，采用ctab法提取dna，获得达氏鲟全部亲本及子代的dna作为模板待用；
(2)微卫星标记引物荧光修饰：选取上述19个引物对，在正向引物5’端分别用fam、hex或者tampa三种不同的荧光中的其中一种进行修饰，用于pcr分析；
(3)荧光pcr：采用荧光pcr反应利用步骤(2)中荧光基团修饰过的19个引物对分别对步骤(1)中的亲本及子代的dna进行pcr扩增，扩增产物按照步骤(2)中分组的方法进行混合，混合物作为上机待测样品；
(4)达氏鲟微卫星家系鉴定：将上机待测样品采用基因分析仪进行分析，读取每个样品的基因型，对亲本基因型和子代基因型进行分析，判定子代个体的父母本，获得达氏鲟的微卫星家系。
进一步的，步骤(3)中，荧光pcr反应时，体系为20μl，包括50ng基因组dna、1×pcr缓冲液、mg2+(1.5mm)、1utaq酶、dntps0.2mm、正反引物均为0.25μm。
进一步的，步骤(3)中，荧光pcr反应时，94℃5min，94℃30s、退火30s、72℃30s、32循环，72℃8min，4℃保存。
本发明的有益技术效果是：本发明利用高通量测序技术对达氏鲟进行微卫星分子标记的开发不仅比传统方法更为快捷，花费更少，而且在获得微卫星位点的同时可以查找对应est序列的功能性状，与基因关联性较强。本发明方法能快速、有效地鉴别达氏鲟不同家系及来源，为达氏鲟的选育，繁殖配组提供了依据。本发明选择的微卫星位点等位基因数目较多，多态性高，可以用于达氏鲟的亲子鉴定，有助于防止近亲交配或小群体内近交导致的种群质量下降，也可以依据亲本与子代的对应关系，分析亲本对子代的贡献率，确定繁殖力较高的个体，为种群遗传管理策略的制定提供理论依据，为制定科学的繁殖策略提供参考。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1用于达氏鲟家系鉴定的微卫星标记引物的获得和验证：
达氏鲟样品收集及rna提取：
从四川省水产研究所挑选两尾健康的达氏鲟，解剖取其性腺进行totalrna的提取，随后进行达氏鲟转录组的测序、拼接及组装并查找微卫星位点。经过筛选之后最终选择了18对条带清晰，多态性高的引物作为家系鉴定的引物，引物在上海生工生物工程股份有限公司合成。
表1用于达氏鲟家系鉴定的微卫星引物信息
实施例2达氏鲟微卫星家系的鉴定方法
(一)达氏鲟亲本及子代dna提取
(1)达氏鲟家系的建立
选取四川省水产研究所43尾性成熟的达氏鲟作为此次鉴定的候选亲本，选取2014年繁殖的f2代43尾及2015年繁殖的f2代24尾总共67尾幼鱼作为此次鉴定的子代。同时，为了确保鉴定方法的可靠性，选取了20尾2016年繁殖的已知父母本的达氏鲟子代(分别来自两个全同胞繁殖家系，每个家系各10尾鱼苗)作为阳性参照，来评估鉴定方法的准确性。
(2)达氏鲟亲本和子代基因组dna的提取
达氏鲟dna的制备采用ctab法进行，具体步骤如下：将达氏鲟的鳍条约30mg放入1.5ml离心管中；离心管中加入500μl的组织裂解液(tris-hcl10mm，edta100mm，sds0.6％，nacl400mm，10mnaoh调节ph＝7.5)，用干净的剪刀将组织剪碎，离心管中加入1μl20mg/ml蛋白酶k；55℃水浴3h，每隔半个小时轻轻颠倒混匀；向离心管中加入120μl饱和nacl，混匀，冰上放置5～10min；4℃，12000r/min离心10min，并转移上清液(约500μl)到另一干净1.5ml离心管中；加入等体积的异丙醇，轻摇，放置5min；4℃，12000r/min离心10min，弃上清液；加入1ml70％预冷的乙醇洗涤dna沉淀一次，自然晾干后以适量双蒸水溶液溶解dna样品；取1ul左右的样品进行电泳检测dna质量，-20℃备用。
(二)微卫星标记引物荧光修饰
选取实施例1中的18个引物对，根据扩增片段大小的差异，分别在每组引物的正向引物5’端用fam、hex或tamra三种不同的荧光基团进行修饰，具体如表1中所示，用于pcr分析；
采用荧光pcr反应利用上述荧光基团修饰过的18个引物对分别对上述亲本及子代的dna进行pcr扩增，不同荧光的混合产物作为上机待测样品。
扩增体系为20μl，包括50ng基因组dna，1×pcr缓冲液，mg2+(1.5mm)，1utaq酶，dntps0.2mm，正反引物均为0.25μm。
扩增条件为：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，退火30秒，72℃延伸30秒，变性至延伸三个步骤重复32次，最后72℃充分延伸8分钟，4℃保存。
(三)微卫星位点基因分型及家系鉴定
(1)微卫星位点基因分型
扩增产物在abi3730xl基因分析仪上进行分型，用genemarker软件读取个体的基因型。
(2)家系鉴定结果
因达氏鲟为多倍体，所以所有的微卫星分型结果都转化为显性遗传标记，即不考虑等位基因的剂量，每个等位基因只考虑有或无。
转化后的微卫星结果采用软件colony2.0进行家系鉴定。
对于阳性参照的20尾子代，采用colony软件中的full-pedigreelikelihood法，结果均找到了其真实的父母本。说明此发明开发的18对微卫星标记在阳性参照上的鉴定成功率为100％。
在实际鉴定的67个子代个体中，所有子代都找到了对应的父本和母本，且置信度均在95％以上，没有发现多重配对的情况。所以，此次家系鉴定从候选亲本中找到真正父母亲的概率为100％，能够满足遗传育种中系谱分析的要求。
最后所应说明的是：以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
sequencelisting
<110>四川省农业科学院水产研究所
<120>一种用于达氏鲟家系鉴定的微卫星标记引物及其鉴定方法
<130>权利要求书、说明书
<160>36
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>18
<212>dna
<213>adx21引物正向序列
<400>1
aacttcatcatgctggaa18
<210>2
<211>18
<212>dna
<213>adx21引物反向序列
<400>2
gatttgactgctttgtgg18
<210>3
<211>20
<212>dna
<213>adx29引物正向序列
<400>3
cctcgtcaccacatacatca20
<210>4
<211>20
<212>dna
<213>adx29引物反向序列
<400>4
ttattaagggaccctcctag20
<210>5
<211>20
<212>dna
<213>adx33引物正向序列
<400>5
gtgggcaaagacctcagaca20
<210>6
<211>20
<212>dna
<213>adx33引物反向序列
<400>6
cttgggacagtggcaacgac20
<210>7
<211>23
<212>dna
<213>adx80引物正向序列
<400>7
ctctcatttctcttctgtcgcta23
<210>8
<211>23
<212>dna
<213>adx80引物反向序列
<400>8
aaagtcttcctcaatttaccctc23
<210>9
<211>22
<212>dna
<213>adx38引物正向序列
<400>9
gttattgacctcacagaagacg22
<210>10
<211>22
<212>dna
<213>adx38引物反向序列
<400>10
ttctaggtgctgctaaagtttc22
<210>11
<211>23
<212>dna
<213>adx40引物正向序列
<400>11
cctcagtttgggagtataggaga23
<210>12
<211>23
<212>dna
<213>adx40引物反向序列
<400>12
agtttacacaggcttgatgttgt23
<210>13
<211>19
<212>dna
<213>adx42引物正向序列
<400>13
ctcctgtgggttttgcctg19
<210>14
<211>19
<212>dna
<213>adx42引物反向序列
<400>14
cttccctgtgttcgtgtga19
<210>15
<211>22
<212>dna
<213>adx52引物正向序列
<400>15
aagtacaaacagagaagcagcg22
<210>16
<211>20
<212>dna
<213>adx52引物反向序列
<400>16
aaataaacctgcagtgaccg20
<210>17
<211>22
<212>dna
<213>adx55引物正向序列
<400>17
accatgcactgctttactacaa22
<210>18
<211>23
<212>dna
<213>adx55引物反向序列
<400>18
aaagaacagtttgaaatcattcg23
<210>19
<211>23
<212>dna
<213>adx58引物正向序列
<400>19
atgctcttgatttatagaagggt23
<210>20
<211>23
<212>dna
<213>adx58引物反向序列
<400>20
acaaacacagaaacagaacggaa23
<210>21
<211>22
<212>dna
<213>adx59引物正向序列
<400>21
gcactcttgaggtgtatcagtt22
<210>22
<211>21
<212>dna
<213>adx59引物反向序列
<400>22
gaaccgtgtctgtggaaccag21
<210>23
<211>22
<212>dna
<213>adx60引物正向序列
<400>23
agctggggtcgtacatttttaa22
<210>24
<211>22
<212>dna
<213>adx60引物反向序列
<400>24
ggagggtcaccttcctttcttt22
<210>25
<211>21
<212>dna
<213>adx61引物正向序列
<400>25
tgaccaaaccaaggaactaca21
<210>26
<211>20
<212>dna
<213>adx61引物反向序列
<400>26
aaagggtttgcaatgctgcc20
<210>27
<211>21
<212>dna
<213>adx66引物正向序列
<400>27
ccgcttcctgaaactagagag21
<210>28
<211>22
<212>dna
<213>adx66引物反向序列
<400>28
tctaaacagaacggtatccctg22
<210>29
<211>22
<212>dna
<213>adx70引物正向序列
<400>29
aaatttgatcctctgtcatgga22
<210>30
<211>24
<212>dna
<213>adx70引物反向序列
<400>30
gagaatgtccaacttcaatacctt24
<210>31
<211>20
<212>dna
<213>adx72引物正向序列
<400>31
gcctgggagagaagtgttga20
<210>32
<211>20
<212>dna
<213>adx72引物反向序列
<400>32
ggaggggagagtgggagata20
<210>33
<211>19
<212>dna
<213>adx74引物正向序列
<400>33
aatgaagggactgcgtaat19
<210>34
<211>19
<212>dna
<213>adx74引物反向序列
<400>34
ctttccagggacagatgtg19
<210>35
<211>23
<212>dna
<213>adx75引物正向序列
<400>35
aatatagagaaatgcccatccct23
<210>36
<211>23
<212>dna
<213>adx75引物反向序列
<400>36
agccacattgacttggaactaac23